Introduction
Under mitose, blir kromosomene i replikert genom organiseres på cellen ekvator for å sikre lik fordeling av søsterkromatider i løpet av de nydannede dattercellene. Kromosom posisjonering og segregering formidles av deres tilknytning til spindel mikrotubuli stammer fra to motstrid centrosomes. I tillegg til å sikre trofast kromosom fordeling, orientering av den mitotiske spindel dikterer også den celledeling planet 1. Koordinert orientering av celledeling er viktig i mange utviklingsstadier og for vev homeostase to. Nærmere bestemt, kan reguleres mitotisk spindel posisjonering føre til at den asymmetriske fordelingen av cellulære innhold eller selv produsere datterceller av forskjellige størrelser 2. Mitotisk spindelenheten og orientering starter i prophase og er orkestrert av et komplekst samspill mellom samarbeidende og motvirke tvangs generatorer 3,4. De genererte styrkene består av bklien trekke og skyve krefter. Disse krefter stammer både fra spindel kontakt med cellen cortex, så vel som fra inne i spindelen, og kan genereres ved mikrotubulidynamikk så vel som av molekylære motorer og kryssbindere (figur 1).
Presser krefter kan bli generert når mikrotubuli vokse mot stive strukturer som for eksempel cellen cortex. Avhengig av den totale motstandskraften som genereres i systemet, kan dette føre til reposisjonering av den mitotiske spindel (lave krefter) eller utløse mikrotubulus bukling eller katastrofe (store krefter) 5-8. Mengden av kraft som kan genereres ved å skyve avhenger av mikrotubulus lengde, ettersom lengden er en sterk determinant av mikrotubuli-knekking 9. I tillegg kan mikrotubuli som stammer fra en sentrosomen presse mot den andre sentrosomen, en mekanisme som har blitt foreslått for å drive sentrosomen separering i tidlig prophase 3,10.
i annonsendition å skyve kreftene som genereres av voksende mikrotubuli, ender microtubule kontakte cellen cortex kan også formidle trekke styrkene 11. Studier fra flere laboratorier har vist at den kontrollerte aktiviteten av kortikale kraftgeneratorer er nødvendig for den asymmetriske plassering av mitotiske spindler in vivo 1. Essential til disse strekkrefter er cortex-lokaliserte cytoplasma dynein (heretter omtalt som "dynein '), en minus-end rettet microtubule motor protein 8,12,13. For eksempel, i spirende gjær, laterale interaksjoner av kortikale dynein med mikrotubuli gitter resultat i motor-avhengige mikrotubuli som glir langs cortex 14. Imidlertid kan kortikale trekkrefter også genereres ved evnen dynein til å danne ende-on vedlegg til depolymerisering av mikrotubuli 8. Den energi som genereres av mikrotubuli krymping kan føre til at krefter som generelt er en størrelsesorden høyere (~ 50 pN (referanse 15 16)). End-on feste av kortikale dynein til depolymerisering mikrotubuli fremmer spindel posisjonering i spirende gjær 17 og C. elegans 13. Enten både motor avhengig skyve og microtubule depolymeriseringsprosesser drevet kortikale trekkrefter kan samarbeide eller er gjensidig utelukkende in vivo er i dag ukjent.
I tillegg til mikrotubulidynamikk skyve krefter og dynein-mediert cortical trekkrefter, er sentrosomen posisjonering styres innenfra den mitotiske spindelen ved en rekke andre proteiner. Kinesin-5 motorer, for eksempel foreligge som tetramerer som kan kryssbinde antiparallelle interpolar mikrotubuli, noe som resulterer i genereringen av ytre skyvekrefter 18-20. Medlemmer av kinesin-5 motor familie er nødvendig for sentrosomen separasjon og bipolar spindelenheten i alle eukaryoter som er undersøkt, med unntak av C. elegans (anmeldt i referanse 21).
Videre er diffusible tverrbindere av Ase1 / PRC1 familie også kjent å lokalisere til overlappende mikrotubul regioner av interpolar mikrotubuli in vivo og in vitro 22-27. De krefter som genereres av Ase1 drevet utvidelse av det overlappende mikrotubuli-regionen er store nok til å motvirke kinesin-14 medierte skyvekrefter in vitro 28,29. I celler, er Ase1 / PRC1 nødvendig for stabil dannelse av overlapp mikrotubulidynamikk regioner i spindelmidtsone 25-27,30, noe som tyder på at de kreftene som genereres av diffusible kryssbindere kan bidra vesentlig til spindel organisasjon. Til slutt, styrker fra den mitotiske kromatin og kinetochores påvirke mitotisk spindel montering og posisjonering gjennom ulike veier 3. Siden disse komponentene er ikke en del av omdannings analysene beskrevet her, vil de ikke bli diskutert i detalj.
jove_content "> Ulike teorier om hvordan de ulike molekylære komponenter og krefter som er beskrevet ovenfor samarbeide i spindelenheten og posisjonering, men vi er fortsatt langt fra en kvantitativ forståelse. I tillegg til forsøk i levende celler, in vitro eksperimenter med rensede komponenter gir et kraftig rute for å bidra til å nå dette målet. Her presenterer vi en visuell guide til en tilpasset og utvidet versjon av de nylig publiserte metoder (Roth et al. 31), hvor grunnleggende spindler er rekonstituert i vann-i-olje emulsjon dråper, og starter med en minimalt antall komponenter. Ved hjelp av microfluidic teknikker, er sfæriske dråper generert med størrelser som er sammenlignbare med mitotiske celler. Innenfor disse dråpene, kan rensede centrosomes og tubulin kombineres for å studere mikrotubul aster dynamikk, tvinger generasjon og aster-aster interaksjoner. Ved innføre kortikale (som dynein) og inter-polare (som kinesin-5 / Ase1) tvangs generatorer, virekonstituere stadig mer komplekse spindel-lignende strukturer som begynner å likne in vivo situasjon.Protocol
1. Utarbeidelse av MicroFluidics Chips
MERK: For bottom-up studie av spindelenheten, er sfæriske vann-i-olje emulsjon dråper brukes. Disse er vandige mikrodråper skilt fra den omgivende oljefasen ved et monolag av fosfolipider og overflateaktivt middel. Disse emulsjon-dråper produseres innenfor microfluidic polydimethylsiloxane (PDMS) chips. Endringer i kanal geometrier og strømningshastigheter kan brukes til å tune dråpestørrelse. I mikrofluid utformingen som er beskrevet her, små dråper med en diameter på ca. 15 um for å etterligne den geometriske innesperring av en pattedyr mitotiske celle.
- Fotomaske Design og Mold Fabrication
- Utforme en fotomaske som inneholder tre innløpskanaler 31. Inlet kanal 1 kobles til vannfasen, som inneholder dråpe innholdet (se punkt 3 "Rekonstitusjon grunn mikrotubulidynamikk asters"). Innløpskanal 2 kobles til oljefasen (se avsnitt 2.1 "Lipid / olje-phase forberedelser "). Bruk innløpskanalen 3 for å fortynne emulsjon-dråper med ekstra lipid / olje-fasen før observasjon (valgfritt) (figur 2a-b).
MERK: Alle innløpskanaler blir etterfulgt av et støvfilteret (en labyrint av kanaler 2 um) for å fange opp støv, partikler og PDMS (protein-aggregater), og for å hindre dem i å blokkere kanalene microfluidic (figur 2d). Kanaler er 75 mikrometer brede og lipid / oljefasen og vannfasen møtes på en 12,5 mikrometer brede krysset der emulsjon-dråper vil danne (figur 2c). - Bestille og få trykte fotomasker på en film underlaget, med en negativ polaritet (fotomasken blir mørkt med transparente utformet strukturer).
- Utforme en fotomaske som inneholder tre innløpskanaler 31. Inlet kanal 1 kobles til vannfasen, som inneholder dråpe innholdet (se punkt 3 "Rekonstitusjon grunn mikrotubulidynamikk asters"). Innløpskanal 2 kobles til oljefasen (se avsnitt 2.1 "Lipid / olje-phase forberedelser "). Bruk innløpskanalen 3 for å fortynne emulsjon-dråper med ekstra lipid / olje-fasen før observasjon (valgfritt) (figur 2a-b).
- mold Fabrication
- Dikte formene av spin-coating SU-8 3025 fotoresist på en 4 tommers silisium wafer ved hjelp av en spin-belegger (500 rpm, 10 sek, etterfulgt av 1800 rpm, 45 sek) i en clean-room miljø.
- Expose SU-8 belagtsilisium wafer gjennom fotomasken. Utvikle wafere i henhold til produsentens instruksjoner for å lage kanaler med ~ 40 mikrometer tykkelse.
- Å gjøre en microfluidic chip
- Bland 10 deler PDMS pre-polymer med en del herder (totalt ~ 40 gr) i en båt-lignende kar med en plastsparkel. Plasser PDMS inneholdende båt lignende kar i et vakuumkammer for ~ 30 min. for å fjerne luftbobler. Vikle aluminiumsfolie rundt støpeformen for å danne en kopp med ~ 1 cm oppstående kanter.
- Hell PDMS (~ 75% av det totale volum) inn i formen, la i et vakuumkammer for en annen ~ 30 min. (For å fjerne luftbobler) og herde i 1 time ved 100 ° C i en ovn.
- Spin-belegge de gjenværende PDMS på glassplater (5 sekunder ved 200 rpm, etterfulgt av 30 sekunder ved 4000 rpm) etterfulgt av herding i 1 time ved 100 ° C. Fjern støv fra glassplater ved hjelp av trykkluft / N 2 mold flyt, er ikke nødvendig før rengjøring.
Merk: PDMS belagt glassplater kan brukes både for microfluidic chip og flow-celle produksjon (se også 2.2). - Forsiktig stripe PDMS ut av formen ved hjelp av et barberblad og hulle (0,5 mm for viker, 0,75 mm for uttak) .Corona-behandle microfluidic chip og en PDMS-belagt glassplate ved hjelp av et laboratorium corona overflatebehandler i noen sekunder .
- Plasser microfluidic chip på glass-slide (kanaler nedover) og bake chips o / n ved 100 ° C (figur 3a). Oppbevar microfluidic chips i flere måneder i et støvfritt miljø.
2. microfluidic Setup
MERK: Vann-i-olje emulsjon dråper er generert ved hjelp av en MicroFluidics oppsett og microfluidic chips som er beskrevet ovenfor. Sammensetningen av lipid / oljefase kan varieres avhengig av de eksperimentelle krav. Olje-oppløselig lipider vil danne et monolag ved vann-olje-grensesnittet med de polare hodegrupper som vender mot vannet inne. For å målrette proteiner(F.eks dynein) til dråpegrense, lave mengder av biotinyl-fosfatidyletanolamin (biotinyl-PE) lipider kan legges. Dette gjør at rekrutteringen av biotinylert dynein (se avsnitt 4.1 "dynein målretting for å dråpe cortex») via streptavidin-mediert multimerization. Dråpestørrelse er stabilisert ved tilsetning av et overflateaktivt middel og som er lagret i PDMS belagte strømningsceller.
- Lipid / olje-fase Forberedelse
- Bland kloroform-oppløst 1,2-dioleoyl- sn- glysero-3-fosfo-L-serin (DOPS) og biotinyl-PE lipidene i et 4: 1 molart forhold i et glassrør ved bruk av glass pipetter (omfattende skylle pipetter med kloroform før bruk). Fremstille et totalt ~ 250 ug lipider, noe som resulterer i en lipid-konsentrasjon på ~ 0,5 mg / ml.
- Tørke grundig lipidblandingen med N2 strømning og deretter i et vakuumkammer for ~ 1 time. Oppløs de tørkede lipidene i mineralolje og 2,5% overflateaktivt middel til 0,5 mg / ml (gjøre ~ 500 mL).
- Plasser lipid / oljeprøven i enultralydbad og sonikere i 30 min. ved 40 kHz for å løse opp lipidene.
- Flow-cell Forberedelse
- Spin-coat PDMS (se også avsnitt 1.3) på dekkglass (5 sek ved 200 rpm, etterfulgt av 30 sekunder ved 4000 rpm) og glassplater (5 sek ved 100 rpm, etterfulgt av 30 sek 1500 rpm) for å avsette det homogene sjikt PDMS.
MERK: For optimal bildekvalitet, sørg for å bruke dekkglass med en tykkelse som passer til mikroskopet målet. I dette tilfelle: 1,5 (~ 0,17 mm). - Kurere PDMS-belagte dekkglass og glassplater i 1 time ved 100 ° C i en ovn. Gjør flyt-celler ved tett avstand (~ 2 mm) tynne skiver av laboratorie forsegling film (~ 3 mm i bredde) på PDMS-belagte glass lysbilder. Når den lagres i et støvfritt miljø, kan kanaler som ikke er brukt anvendes på andre tidspunkter.
- Dekk strømnings-celler med en PDMS-belagt dekkglass og forsegling ved smelting laboratoriet forsegling film ~ 1 min. ved 100 ° C, trykkerforsiktig (figur 3c). Lukk laboratorium forsegling film -Glassrengjørings-grenser med Valap (figur 3c). Oppbevares flow-celler for flere måneder i et støvfritt miljø.
- Spin-coat PDMS (se også avsnitt 1.3) på dekkglass (5 sek ved 200 rpm, etterfulgt av 30 sekunder ved 4000 rpm) og glassplater (5 sek ved 100 rpm, etterfulgt av 30 sek 1500 rpm) for å avsette det homogene sjikt PDMS.
- PDMS Cup Forberedelse
- For langsiktig bildebehandling, lage en PDMS cup, ved å slå et hull diameter 4 mm i en bit av PDMS (~ 3 mm tykk)
- Corona-behandle PDMS stykke og en PDMS belagt dekkglass og legg dem oppå hverandre. Bake PDMS koppen o / n (ved 100 ° C) (figur 5a).
- Emulsion-dråpe Formation
- Monitor dråpedannelse på en invertert lyse-feltet mikroskop. Koble trykkregulatoren til microfluidic chip bruker PEEK rør (diameter: 510 mikrometer (ytre) og 125 mikrometer (indre)) (figur 3a). Fyll microfluidic chips helt med lipid / oljefase fra fjord 2.
- Innføre MRB80 baserte vannfase (se kapittel 3 "Rekonstitusjon grunn mikrotubulidynamikk asters4;) fra innløp 1. Kontroll dråpestørrelsen ved å endre lipid / oljefase og vannfase-trykk for å skape små dråper av ~ 15 mikrometer i diameter (figur 3b).
MERK: Ved hjelp av dette oppsettet, bruk ~ 800 mbar for lipid / oljefase og ~ 200 mbar for vannfasen for å lage dråper av ønsket størrelse. - Etter å ha fått den ønskede dråpestørrelse og mengde (~ 10 mL per prøve), samle dråper fra utløpskanal og last inn flow-celle (fylle flow-cellen helt).
- Lukke endene av strømningscellen forsiktig ved hjelp Valap (ufullstendig lukkede strømnings-celler kan resultere i utstrakt bevegelse av dråpene, noe som gjør det vanskelig å avbilde dem). I tillegg forhindre dannelse av luftbobler som resulterer i dråpe bevegelse.
- Skyll PEEK rør mye med isopropanol før og etter bruk for å hindre at prøven krysskontaminering og tilstopping.
3. rekonstituering Grunn microtubule Asters
MERK: Droplet innholdet kan varieres avhengig av de eksperimentelle krav. Alle buffere er MRB80 Basert (80 mM PIPES, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl2 (pH 6,8)), og alle prøvene fremstilles på is. Generelt dråpene alltid inneholde centrosomes, komponenter som er nødvendige for mikrotubulus polymerisering, en oksygenfjerner system og blokkerende middel (se avsnitt 3.1). Microtubule kraft-generatorer og nødvendige kofaktorer og målretting-faktorer kan inkluderes hvis ønskelig (se pkt 4.1 og 4.2).
- Hovedoppsett for aster dannelse i emulsjon dråper (Figur 3d)
- Fremstille glukose-oksydase (20 mg / ml glukose oksydase i 200 mM DTT og 10 mg / ml katalase) blanding på forhånd og oppbevares i små porsjoner ved -80 ° C.
- Forbered en blokkering mix "som inneholder κ-kasein, bovint serum albumin (BSA), Tween-20 og fluorescerende dekstran (som en nøytral markør) (se tabell 1) på forhånd og butikk i små aliquots ved -80 ° C. Forhindre gjentatte fryse-tine sykluser. Sørg for at alle komponentene er nylaget.
- Rens centrosomes fra menneskelige lymfoblast KE37 cellelinjer som beskrevet av Moudjou et al. 32 og oppbevar ved -150 ° C i små porsjoner.
- Tine centrosomes ved romtemperatur og inkuber ved 37 ° C i ~ 20 minutter. før bruk for å sikre riktig microtubule kjernedannelse.
MERK: Dette fremmer microtubule kjerne under forsøket. - I mellomtiden tilberede 'analyseblanding' inneholdende tubulin (fluorescerende og "mørke"), guanosin trifosfat (GTP), en oksygenfjerner system (glukose, glukose-oksidase, katalase og 1,4-ditiotreitol (DTT)), molekyl~~POS=TRUNC (f.eks mikrotubul-motorer / kryssbindingsmidler), adenosin trifosfat (ATP) og en ATP-regenererende system (fosfoenolpyruvat (PEP), pyruvat-kinase (PK) og laktat-dehydrogenase (LDH)) på is (se tabell 2).
- Pre-kjøleairfuge rotor på is. Spinne ned prøven i den avkjølte airfuge rotor (30 psi i 3 min) .Legg forvarmet centrosomes (optimere mengden av centrosomes å ta sikte på dråper som inneholder 1-2 centrosomes).
- Bruke den kombinerte blanding for å fremstille emulsjonsdråper ved hjelp av de metoder som er beskrevet i avsnitt 2.3.
| Komponent | Stock konsentrasjon | Endelig konsentrasjon (i analyse) | Volum | Kommentar |
| Dekstran-647nm | 75 mikrometer | 3,75 um (0,6 mm) | 5 pl | |
| κ-kasein | 20 mg / ml | 12,5 mg / ml (2 mg / ml) | 62,5 mL | |
| Tween-20 | 5% | 0,375% (0,06%) 7,5 mL | ||
| BSA | 200 mg / ml | 12 mg / ml (1.9 mg / ml) | 6 mL | |
| MRB80 | 19 mL | |||
| 100 pl endelige | Oppbevares i 2 pl prøver |
Tabell 1: Sammensetning av "Blocking Mix 'bestanddeler av blokkerende blanding, som er nødvendig for rekonstitueringen av spindel-lignende strukturer i vann-i-olje-emulsjon dråper.. For beskrivelse, se hovedteksten punkt 3 "Rekonstitusjon grunn mikrotubulidynamikk asters". For detaljer om materialer, se "Materialer tabell.
| Komponent | Stock-konsentrasjonn | endelig Konsentrasjon | Volum | Kommentar |
| Blokkering mix | 1,6 mL | |||
| tubulin | 500 mikrometer | 30 mikrometer | 0,6 mL | |
| Tubulinbasert 488/561 | 50 mikrometer | 3 mikrometer | 0,6 mL | |
| GTP | 50 mm | 5 mm | 1,0 mL | |
| Dynein-TMR | 178 nM | 30 nM | 1,7 mL | |
| streptavidin | 5 mg / ml | 200 nM | 0,4 mL | bare for kortikal dynein |
| Kinesin-5 | 1,6 mm | 80 nM | 0,5 ul | |
| ATP | 25 mm | 1 mm | 0,4 mL | bare for motorer |
| PEP | 0,5 M | 25,6 mm | 0,5 ul | bare for motorer |
| PK / LDH | 800 U / 1100 U | 23 U / 32 U | 0,3 mL | bare for motorer |
| Ase1-GFP | 400 nM | 80 nM | 2,0 mL | |
| glukose | 2,5 M | 50 mm | 0,3 mL | siste trinnet |
| Glukose-oksidase | 50x | 1,0x | 0,3 mL | siste trinnet |
| MRB80 | x | |||
| 9 mL endelig |
Tabell 2: Sammensetning av 'analysen Mix'. Materialer tabell.
4. Innføring spindelenheten faktorer
MERK: I analysene beskrevet her, et grønt fluorescerende protein (GFP) -tagged forkortet versjon av S. cerevisiae dynein ble anvendt som er kunstig dimerisert ved hjelp av et amino-terminalt Glutation S-transferase (GST) -tag 33. Dette proteinet er renset gjennom en affinitetsmerkelapp som inneholder to kopier av protein A IgG-bindende domener. Den varianten som er brukt her er merket med en tetramethylrhodamine (TMR) etikett på den karboksy-terminale og N-terminale SNAP-koden er brukt til å biotinylere de rensede proteiner. For konstruere detaljer, se Roth et al 31.; for rensing detaljer, se Reck-Peterson et al., 33. GFP-biotin-dynein-TMR kan være rettet mot den dråpe cortex gjennom dannelsen av biotin-streptavidin komplekser som lenker dynein til Biotinyl-PE lipider (Figur 3E).
- Dynein Targeting til Droplet Cortex
- Omfatte GFP-biotin-dynein-TMR inn i 'analyseblanding' (se tabell 2) i en endelig dråpekonsentrasjon på 30 nM. Omfatter streptavidin til "analyseblanding '(se tabell 2) i en endelig dråpekonsentrasjon på 200 nM.
MERK: dynein avhenger av ATP-hydrolyse for trinnvis bevegelse på mikrotubuli. Derfor inkluderer ATP og et ATP-regenererende system (inneholdende PEP og PK / LDH) inn i 'analyseblanding' (se tabell 2).
MERK: Rekombinant full-lengde S. pombe GFP-Cut7 (kinesin-5) ble vennlig levert av Diez lab (Senter for molekylær bioteknologi, Technische Universitat Dresden, Dresden, Tyskland), se. Rekombinant full length histidin-merket S. pombe GFP-Ase1 ble vennlig levert fra Jansons lab (Wageningen University, Wageningen, Nederland) og lagt til "testblanding 'i konsentrasjoner på 80 nM.
- Omfatte GFP-biotin-dynein-TMR inn i 'analyseblanding' (se tabell 2) i en endelig dråpekonsentrasjon på 30 nM. Omfatter streptavidin til "analyseblanding '(se tabell 2) i en endelig dråpekonsentrasjon på 200 nM.
5. Imaging
NB: Under eksperimentet kan mikrotubulus vekst styres ved å endre temperaturen. I valg av bildeforhold, avveininger må gjøres mellom høy bildekvalitet og muligheten til å overvåke spindelenheten i lange tidsperioder. Å sammenligne kinetikken spindel formasjon under forskjellige forhold, kan dråper med forskjellig innhold blandes og avbildes i samme strømningskanalen.
- Grunnleggende bildeinnstillinger
- Bilde i temperaturkontrollerte omgivelser ved hjelp av et lukket kammer. Visualiser individuelle mikrotubuli etter ~ 30 min ved 26 ° C. Mens avbildning, for å fremme mikrotubuli-vekst ved å øke temperaturen opp til ~ 30 ° C.
MERK: sinns nedenfor er spesifikke for vår mikroskop oppsett og kan variere med forskjellige systemer og annen driftsprogramvare. Alle analysene beskrevet her er avbildet på et motorisert invertert system med en roterende disk confocal hodet og drives ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare som Andor iQ 3.1. Innhente alle bilder med en 100X oljeneddyppingsobjektivet og EMCCD kamera. - Sett eksitasjon lasere 488, 561 og 641 nm til omtrent ~ 10% intensitet. Gå til "acquisition" panel, klikk på 'AOTF fanen og skyv laser intensiteter til 10%. Klikk på "record" for å lagre innstillingene.
- For z -projections, ta stabler med 1 mikrometer intervaller (~ 20 bilder / dråpe). Gå til hoved "kamera" panel, klikk på "rediger z 'og sett' Z trinn 'til 1,0. Klikk på" neste "for å lagre innstillingene.
- Angi maksimal lineær EM-gevinst ved å klikke på "kamera" kategorien i "acquisition" panel og skyv EM gevinst bar til 300. Sett eksponeringganger til 200 msek i samme kategorien. Klikk på "record" for å lagre innstillingene.
- Bilde i temperaturkontrollerte omgivelser ved hjelp av et lukket kammer. Visualiser individuelle mikrotubuli etter ~ 30 min ved 26 ° C. Mens avbildning, for å fremme mikrotubuli-vekst ved å øke temperaturen opp til ~ 30 ° C.
- levende Imaging
- For levende bildebehandling, og bruk programvaren kontroller gjør z -projections hver 2 min. i løpet av 1-2 timer ved å redusere eksponeringstidene til ~ 100 msek. (som beskrevet i 5.1.4) og øke z -intervals til 2 um (som beskrevet i 5.1.3). Sett tidsserier i hoved "kamera" panel, klikk på "repeat t 'og satt til 2 min. intervaller for en total tid på 120 min.
- For live assays, bruke en PDMS kopp stedet for en vanlig strømningscellen for å sikre at dråpene er så ubevegelig som mulig.
- Kombinert Imaging av 2 betingelser
- Produser dråper bruker MicroFluidics og lagre på toppen av en PDMS belagt glass lysbilde på isen. Dette hindrer mikrotubulus kjernedannelse inntil det andre sett av dråper har blitt dannet. Før fremstilling av det andre settet av dråper, skylles PEEK rør og mikrofluid chip medMRB80 og helt fylle microfluidic chip med lipid / oljefasen.
- Generer dråper med og uten fluorescerende dekstran (eller ved bruk av dekstran med forskjellige bølgelengde fluoroforer) for å diskriminere mellom dråper med forskjellige farger. Etter fremstilling av det andre parti av dråper, forsiktig blande dråpene ved pipettering og laste inn i en enkelt strømnings-celle / PDMS-cup.
- Bildeanalyse.
- Analyser bilder ved hjelp av Fiji (open source programvare som er tilgjengelig online) 34.
- For live analyser, konvertere stabler inn hyperstacks bruke "image" - "hyperstacks '-' stack til hyperstack '. Still inn riktig antall z-skiver og tidsrammer.
- For å gjøre z-projeksjoner, velg «image» - 'stabler' - 'z-prosjektet ". Velg "maks intensitet 'projeksjon.
- For 3D-rekonstruksjoner, først gå til 'image' - 'egenskaper' og still inn riktig pixel med, pixel høyde, voxel dybde og frAME intervaller. Klikk på "OK". Velg «image» - 'stabler' - '3D prosjektets, sjekk den "interpolere" boksen og klikk "OK".
Representative Results
Metodene som er presentert i de foregående avsnittene tillate rekonstituering av spindel-lignende strukturer med økende kompleksitet ved å bruke den geometriske sperring av vann-i-olje-emulsjon-dråper. Denne delen beskriver representative resultater som kvalitativt viser evnen til disse analyser.
Under mitose, når den bipolare spindelen er montert, cellene runde opp for å danne kuler med en diameter på rundt 15 um, som målt for humane celler. Denne karakteristikken mitotisk cellen form gir et geometrisk grense som både begrenser og styrer spindel størrelse og orientering 35,36. Mikrofluid teknikker, gir en grad av geometrisk begrensning som nøyaktig ligner situasjonen observert i levende celler, og derfor muliggjør den nedenfra og opp rekonstruksjon av mitotiske spindler in vitro.
(Figur 4a, venstre panel). Etter ca 20-30 min, de første mikrotubuli blir synlige og sentrosomen diffusjon blir begrenset som mikrotubuli vokse mot cortex i alle retninger. Asters med mikrotubuli av middels lengde (ca 50% av dråpe diameter) kan (sterisk) frastøter hverandre en annen, med mikrotubuli presser mot hverandre, de andre centrosomes og hjernebarken. Dette resulterer i en typisk "bipolar" spindel-lignende anordning med de to centrosomes mot hverandre (figur 4a, midtre panel). Når mikrotubuli blir lengre enn ~ 50% av den dråpe diameter, får de centrosomes skjøvet videre til opposisjonelle grensene av dråpe, med mikrotubuli som vokser langs dråpe cortex (figur 4a, panel til høyre). Det er viktig å merke seg at mikrotubul veksthastighet hos disse analyser er svært følsomme for både temperatur og tubulin-konsentrasjoner. Disse parametrene vil derfor sterkt påvirke den tiden da kjerne først observert og når steady-state aster stillinger er nådd.
I celler, kortikale trekkrefter som genereres gjennom dannelsen av bærende vedlegg mellom microtubule pluss-ender og cortex-assosiert dynein. I dyreceller, avhenger denne foreningen på Gαi / LGN / NUMA-komplekset, som er rettet mot plasmamembranen via N-terminal myristoylation av Gαi en. I disse rekonstituering analyser, er kravet til Gαi / LGN / Numa kompleks omgås ved direkte kobling dynein til biotinylerte lipider gjennomdannelsen av biotin-streptavidin-biotin komplekser. Disse obligasjonene er relativt stabil (K D ~ 10 -14 M) 37 og danner raskt (vanligvis innen 10 minutter etter emulsjonsdråpe formasjon, før microtubule nucleation blir tydelig) (figur 4b). I nærvær av kortikale dynein, centrosomes vanligvis beholde en mer sentral stilling, mens i fravær av dynein, blir centrosomes presset til motsatte sider av den dråpe cortex (figur 4c). Vi Grunnen til at dette er et resultat av to effekter, som hindrer og motvirker mikrotubulidynamikk skyve krefter. (1) dynein direkte fremmer mikrotubulidynamikk katastrofer, og dermed begrenser microtubule lengde og hindrer overdreven microtubule knekking, og (2) kortikale trekkrefter fører til netto sentre krefter på de enkelte asters 8 som motvirker aster-aster frastøtende krefter.
Den diffusible kryss-linker Ase1 induserer forces som har en tendens til å øke den overlappende region av anti-parallelle mikrotubuli 29. I samsvar med dette, i nærvær av Ase1 (og fravær av dynein) centrosomes er funnet tett sammen med Ase1 lokalisering til sammen inter mikrotubuli (Figur 4d). Medlemmer av kinesin-5 familien kjøre sentrosomen separasjon ved å gi skyve krefter innenfra spindelen (se innledningen). I nærvær av Cut7 (S. pombe kinesin-5 ortolog), er centrosomes presset til motsatte sider av emulsjonsdråper, selv i nærvær av Ase1 (figur 4e). Ved å kombinere kortikale og inter-polare kraftgeneratorer, kan kompleksitetsnivå økes ytterligere i disse forsøkene, til slutt fører til en omfattende forståelse av bipolar mitotiske spindelenheten. En detaljert kvantitativ beskrivelse av disse resultatene vil være tilgjengelig i fremtiden (Roth et al., Manuskript under forberedelse).
(figur 5c). Dette letter undersøkelsen av både stabil tilstandsoppførsel og spindelenheten kinetikk. Ved å kombinere dråper med forskjellig innhold i den samme prøve, er det for eksempel mulig å direkte sammenligne sentrosomen posisjonering og spindelenheten kinetikk i dråper med og uten kortikale kraftgeneratorer (figur 5b).
Figur 1: krefter som virker på den mitotiske spindel Flere kraftgenererende molekyler handle på mikrotubuli av mitotisk spindel å fremme spindel formasjon og posisjonering.. Mikrotubuli som vokser inn i cellen cortex generere en skyvkraft på den sentrosomen. Kortikale dynein (lilla) fanger depolymerisering mikrotubuli og genererer en trekkraft på centrosomes. Innenfor spindel, kinesin-5 / Cut7 motor proteiner gir en ytre skyvekraft på anti-parallelle mikrotubuli, mens kryssbindere av PRC1 / Ase1 familie generere en motstander utover skyvekraft. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .
Figur 2:. Microfluidic Chip Design (A) Design av 4 tommers fotomaske inneholder 4 microfluidic chips. (B) Detaljert representasjon av en enkelt brikke. Chips inneholde en utløpskanal og tre innløpskanaler, etterfulgt av en støvfilteret. Innløpskanal 1 inneholder vannfasen, kan kanalen 2 lipid / olje-fase og kanal 3 benyttes for å fortynne de dannede dråper med ekstra lipid / oljefase. (C) Detaljert fremstilling av veikryss hvor lipid / olje-fasen (som kommer fra topp og bunn) møter med vannfasen (som kommer fra venstre). I krysset, vil dråper og strømme mot utløpskanalen på høyre side. (D) Detaljert representasjon av et støvfilteret med 2 mikrometer kanaler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: Metode for vann-i-olje-emulsjon Droplet formasjonen (A) mikrofluid brikke og MicroFluidics rør på en klar-felt mikroskop. Både vann- og lipid / oljefase-rør er forbundet med de chip innløpene 1 og 2 henholdsvis. (B) Restriction på MicroFluidics chip der vann- og lipid / oljefaser møtes. Ved å endre trykkene kan dråper størrelse reguleres. (C) Design av PDMS-belagte flyt-celler. Etter lasting dråpene inn i flow-cellen, er de åpne endene stengt med ekstra Valap. (D) Skjematisk av dråpedannelsen. Dråper anvendes for å innkapsle centrosomes, tubulin og ytterligere komponenter som kreves for mitotisk spindel formasjonen. (E) Skjematisk av kortikal-dynein målretting. Biotinylated (Bio) dynein er rettet mot biotinylerte lipider gjennom streptavidin (Strp). 
Figur 4:. Representative Resultater av spindel reconstitutions med økende kompleksitet (A) maksimal intensitet projeksjoner av dråper som inneholder to centrosomes viser eksempler på korte, middels og lange mikrotubuli. Centrosomes og mikrotubuli blir visualisert ved tilsetning av 10% HiLyte-488 merket Tubulin. Skala barer = 10 mikrometer. (B) Lokalisering av GFP-biotin-dynein-TMR i fravær (-, venstre) og tilstedeværelse (+, høyre) av streptavidin (Strp). (C) microtubule aster posisjonering i fravær (-, venstre) eller nærvær (+, høyre) av kortikal GFP-biotin-dynein-TMR. (D) microtubule aster (venstre panel, green) posisjonering i nærvær av Ase1 (midtre panel, rød). (E) microtubule aster (venstre panel, grønn) posisjonering i nærvær av Ase1 og Cut7 (kinesin-5) (midtpanelet, rød). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 5: Imaging Aster Positioning Dynamics in vitro (A) Design av en PDMS cup som gjør at dråpen bildebehandling for opp til flere timer.. (B) Generation, lagring og avbildning av dråper (overført) inneholder forskjellig innhold, illustrert ved fravær (venstre) inkludering (høyre) av fluorescerende dekstran (Alexa 647). (C) enkelt plan bilder av en 60 min time-lapse (2 min intervaller) tatt fra en z-stack (2 mikrometer avstander) av annonsenroplet inneholder en enkelt sentrosomen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Metodene som beskrives her presentere siste innsats for å rekonstituere grunn mitosetråder i vann-i-olje emulsjon dråper. Studerer spindelenheten innenfor geometriske grenser gir mange fordeler. Viktige tilbakekoblingsmekanismer eksisterer mellom mikrotubuler i den mitotiske spindel og de geometriske begrensninger på hvilke de er montert. Mikrotubuli kan generere skyve krefter når de vokser til geometriske grenser, noe som kan resultere i mitotisk spindel forskyvning. I tillegg kan vokse til en fysisk barriere indusere mikrotubul katastrofer. Dessuten kan spindelenheten innenfor et begrenset geometri fører til en gradvis uttømming av individuelle komponenter, slik som tubulin, som på sin side direkte påvirker den mikrotubul vekstraten 36. Disse er alle viktige determinanter av spindelenheten, noe som kan studeres ved å bruke analysene som er beskrevet her.
De beskrevne analyser er svært følsomme for liten konsentrasjon differences av dråpe komponenter. Dette er tilfellet for tubulin, hvor små konsentrasjonsforskjeller kan føre til enten er for langsom eller for hurtig mikrotubuli-vekst. I dette tilfellet, mikrotubul vekstrater kan ofte fremdeles korrigeres ved å justere temperaturen under den første ~ 30 minutter av forsøket. Mitotiske spindelenheten og posisjonering er også meget følsom for variasjoner i konsentrasjonen av (kortikale) kraftgeneratorer. Dette vil trolig være avhengig av konsentrasjon, renhet og aktivitet av de rensede komponenter og må titreres nøye for hver nylig renset protein.
I tillegg er visse avveininger må gjøres i bildeinnstillingene, avhengig av arten av analysen. I utgangspunktet høye nivåer av løselig fluorescerende tubulindimerer gjør det vanskelig å avbilde individuelle mikrotubuli. Som mikrotubuli blir lengre og oppløselig tubulin langsomt tømt, blir gradvis høyere signal-til-støy-forhold og tillater avbildning av individual mikrotubuli. I motsetning til oppsett med åpne systemer, forhindrer den geometriske sperring utveksling av fluorescerende molekyler og oksygenfjerner systemkomponenter innenfor et massereservoar, noe som resulterer i betydelig bleking. Spesielt for overvåkning av spindelenheten og posisjonering over tid, er det nødvendig å bilde med lave lysintensiteter, selv i nærvær av en sterk oksygenfjerner system.
Disse metodene aktivere bottom-up tilberedning av forenklede spindel-lignende strukturer in vitro. I tillegg til de komponentene innført her, har mange andre faktorer blitt beskrevet å påvirke bipolar spindel formasjon, posisjonering, orientering, shaping, etc. tre. Dette systemet kan utvides ytterligere for å studere de enkelte og kombinerte effekten av ytterligere kraftgeneratorer. Viktige bidragsytere til spindel formasjon som i dag er fraværende fra dette systemet er de mitotiske kromosomer. Mitotisk kromatin har vist seg ådirekte spindel formasjon ved (1) chromokinesins som kan generere såkalte "polar-utstøting styrkenes 3, (2) dannelse av en RanGTP gradient av kromatin-bundet RanGEF RCC1 38, (3) kinetochores som kan samhandle med (depolymerisering mikrotubuler) 39 og (4) kromatin selv, som kan fungere som en mekanisk fjær i mellom motstående mikrotubuli 40.
Til slutt, det beskrevne systemet gir foreløpig begrenset tidsmessig og romlig kontroll over aktivitet og lokalisering av introduserte kraftgeneratorer. I celler, mange spindelenheten faktorer lokalisere til bestemte avdelinger eller er aktive innenfor et begrenset tidsvindu. Et slående eksempel er aktiviteten til dynein, som er spesielt anriket på den bakre side av C. elegans en celle-trinns embryo for å fremme asymmetrisk spindel posisjonering og celledeling. I dette systemet, er vi for tiden utforsker muligheten for å etterligne en slik temporal og asymmetriske aktivitet ved hjelp av metoder lånt fra opto-genetiske teknikker. I tillegg er som tilfellet for C. elegans embryo og celler med en stiv cellevegg, er det mange celler ikke runde opp i mitose. Formen på det geometriske begrensnings vil ha en grunnleggende innvirkning på de krefter som virker på spindelen 41. Det vil derfor være viktig å rekonstituere spindelenheten og posisjonering i ikke-sfæriske dråper også, potensielt bruke mer komplekse microfluidic systemer som gjør det mulig å forme og lagring av emulsjon Dråper 42,43. Til slutt, i vev, celle-celle og celle-substrat signalisering og festing gi eksterne signaler som kan oversettes til spindel rettet orientering, som ofte er observert i epitelceller og stamceller. Alle disse spesialiserte aspekter har ikke blitt tatt hensyn til i denne studien, og kan gi framtidige utfordringer å bygge mot flere in vivo -lignende reconstitutions av mitotisk spindel assembly og posisjonering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Preparation of microfluidic chips | |||
| Photomask (Photomask on film substrate) | Selba S.A. Switzerland | ||
| SU-8 3025 | MicroChem | ||
| Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0>10-20 Ω-cm, 500-550 μm, SSP, with 2 flats) | WRS Materials | 4P0SSP-005 | |
| Spin coater | Polos | SPIN150I | |
| PDMS pre-polymer RVT615 A+B | Lubribond | 9481 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20ACV | |
| 2. Microfluidic setup | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)) | Avanti Polar Lipids | 870285 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | |
| Glass pipets | |||
| Glass tubes | |||
| Vacuum pump | Laboport | KNF | |
| Vacuum chamber | Kartell | Polypropylene Vacuum Desiccator | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Surfactant (Span80) | Sigma-Aldrich | 85548 | |
| Sonicator | Branson | M2800H | |
| Coverslips | 24 mm x 60 mm, thickness 1.5 | ||
| Glass-slides | 26 mm x 76 mm | ||
| Puncher | Harris Uni-Core | 135840/135841/135843 | |
| Laboratory sealing film | Parafilm | ||
| Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations) | Home made | ||
| Brightfield Microscope | Leica | PMIRB | Any inverted brightfield would suffice |
| Pressure controler | Fluigent | MFCS-FLEX-4C-1000 | |
| PEEK Tubing | Cluzeau Info. Labo, France | ||
| Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml) | VWR, The Netherlands | ||
| 3. Reconstituting spindle formation and positioning | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable) | Life Technologies | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | ||
| BSA - Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger) | Sigma-Aldrich | G6125 | |
| DTT (DL-dithioltheitol) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| Catalase (Catalase form bovine liver) | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Tubulin (Tubulin from bovine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
| Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
| GTP (Guanosine-'5-triphosphate, sodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| κ-casein (κ-casein from bovine serum milk) | Sigma-Aldrich | C0406 | |
| Airfuge (Air-driven ultracentrifuge) | Beckman-Coulter | CLS | |
| 4. Introducing spindle-assembly factors | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutravidin | Sigma-Aldrich | A2666 | |
| ATP (Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate ≥97% (enzymatic)) | Sigma-Aldrich | P0564 | |
| PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle) | Sigma-Aldrich | P0294 |
References
- Kotak, S., Gonczy, P. Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).
- Williams, S. E., Fuchs, E.
- Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly. Dev Cell. 19, 797-806 (2010).
- Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. Mitotic force generators and chromosome segregation. Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).
- Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).
- Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).
- Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).
- Laan, L., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
- Dogterom, M., Yurke, B. Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules. Science. 278 (5339), 856-860 (1997).
- Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos. Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).
- Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos. Cell. 129 (3), 499-510 (2007).
- Carminati, J. L., Stearns, T. Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex. J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).
- Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans. Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).
- Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
- Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).
- Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).
- Ten Hoopen, R., et al. Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae. Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).
- Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
- van den Wildenberg, S. M., et al. The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations. Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).
- Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).
- Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P.
- Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins. J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).
- Loiodice, I., et al. Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast. Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).
- Kapitein, L. C., et al. Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules. Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).
- Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Mollinari, C., et al. PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone. J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).
- Braun, M., et al. Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart. Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).
- Lansky, Z., et al. Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks. Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).
- Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling. Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).
- Roth, S., Laan, L., Dogterom, M.
- Moudjou, M., Bornens, M. Method of centrosome isolation from cultured animal cells. Cell Biology: A laboratory handbook. Celis, J. E. 2, 111-119 (1998).
- Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Lancaster, O. M., et al. Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation. Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
- Green, N. M.
- Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells. Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).
- Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
- Lawrimore, J., et al. DNA loops generate intracentromere tension in mitosis. J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).
- Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of cell geometry on division-plane positioning. Cell. 144 (3), 414-426 (2011).
- Taberner, N., et al. In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast. Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).
- Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).
