Artigo de método

Projetando microfluídicos para Estudar respostas celulares Sob único ou coexistindo Chemical / Elétrica / tensão de cisalhamento Estímulos

DOI:

10.3791/54397

⸱

13 de agosto de 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural Chemistry, National Taiwan University, 2Department of Physics, Fu-Jen Catholic University, 3Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica

Neste artigo

Resumo

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Dispositivos microfabricados integrados com componentes fluídicos fornecem uma plataforma in vitro para estudos celulares que imitam o microambiente in vivo. Desenvolvemos chips microfluídicos à base de polimetilmetacrilato para estudar as respostas celulares sob estímulos de estresse químico/elétrico/de cisalhamento únicos ou coexistentes.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

microcanais são capazes de criar um micro-ambiente celular preciso e controlável do pH, temperatura, concentração de sal, e outros estímulos físicos ou químicos. Eles têm sido comumente utilizado para estudos in vitro de células, fornecendo in vivo como arredores. Especialmente, como as células resposta a gradientes químicos, campos elétricos e tensões de cisalhamento tem atraído muitos interesses uma vez que estes fenómenos são importantes para compreender as propriedades e funções celulares. Estes chips de microfluidos pode ser feita de substratos de vidro, pastilhas de silício, polímeros de polidimetilsiloxano (PDMS), polimetilmetacrilato (PMMA), substratos ou substratos de tereftalato de polietileno (PET). Fora destes materiais, substratos de PMMA são baratos e podem ser facilmente tratados com ablação a laser e escrita. Embora alguns dispositivos microfluídicos foram projetados e fabricados para gerar múltiplos, coexistindo estímulos químicos e elétricos, nenhum deles foi consideradosuficientemente eficaz na redução repetições experimentais, em particular para fins de triagem. Neste relatório, nós descrevemos nosso projeto e fabricação de dois chips microfluídicos à base de PMMA para investigar respostas celulares, na produção de espécies reativas de oxigênio e a migração, sob / elétricos estímulos de estresse / cisalhamento químicas únicas ou coexistentes. O primeiro chip gera cinco concentrações relativas de 0, 1/8, 1/2, 7/8, 1 e nas regiões de cultura, juntamente com um gradiente de tensão de corte produzida dentro de cada uma destas áreas. O segundo chip gera as mesmas concentrações relativas, mas com cinco diferentes intensidades de campo elétrico criado dentro de cada área de cultura. Estes dispositivos não só proporcionar células com um, controlável micro-ambiente precisa, mas também aumentar grandemente a taxa de transferência experimental.

Introdução

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Em células in vivo estão rodeados por uma variedade de biomoléculas, incluindo matriz extracelular (ECM), hidratos de carbono, lípidos, e outras células. Eles funcionalizar por responder a estímulos micro-ambientais, tais como as interacções com o ECM e as respostas aos gradientes químicos de vários factores de crescimento. Tradicionalmente, os estudos in vitro de células são realizadas em pratos de cultura de células, onde o consumo de células e reagentes é grande e as células crescem num estática (não-circulantes) ambiente. Recentemente, os dispositivos micro fabricado com componentes integrados fluídicos forneceram uma plataforma alternativa para estudos de células de uma forma mais controlável. Tais dispositivos são capazes de criar um micro-ambiente precisa de estímulos químicos e físicos, enquanto minimizando o consumo de reagentes e células. Estes chips de microfluidos pode ser feita de substratos de vidro, pastilhas de silicone, polímeros de polidimetilsiloxano (PDMS), polimetilmetacrilato (PMMA) substratos, ou polyethylenetereftalato (PET) substratos 1-3. dispositivos baseados no PDMS é transparente, biocompatível, e permeável aos gases, tornando-os adequados para a cultura de células a longo prazo e estudos. substratos de PMMA e PET são baratos e fáceis de ser processados ​​usando ablação a laser e escrita.

microcanais deve fornecer células com um micro-meio ambiente estável e controlável quando as células são sujeitas a diferentes estímulos químicos e físicos. Por exemplo, chips de microfluidos são usados ​​para estudar a quimiotaxia de células. Em vez de métodos tradicionais que empregam câmara de Boyden e capilar 4,5 esses dispositivos fluídicos miniaturizados pode gerar gradientes químicos precisos para estudar comportamentos das células 1,6,7. Outro exemplo é o de estudar a migração direcional das células sob a campos elétricos (EFS), fenômeno chamado electrotaxis. Foram relatados comportamentos Electrotactic de células para ser relacionada com a regeneração do nervo 8, 9, o desenvolvimento embrionário,e cicatrização de feridas 10,11. E muitos estudos foram realizados para investigar a electrotaxis de vários tipos de células, incluindo células cancerosas 12,13, 14,15 linfócitos, células de leucemia 11, 16 e as células-tronco. Convencionalmente, placas de Petri e óculos de cobertura são usados ​​para construir câmaras electrotactic para gerar FE 17. Tais configurações simples levantam problemas de evaporação média e FE imprecisos, mas eles podem ser superados por meio de dispositivos microfluídicos de canais fluídicos fechado, bem definidas 12,18,19.

Para estudar sistematicamente respostas celulares sob estímulos químicos e eléctricos precisas, controláveis, seria de grande utilidade para desenvolver dispositivos de microfluidos, capazes de produzir células com vários estímulos, ao mesmo tempo. Por exemplo, Li et al. relatado um dispositivo microfluídico baseado no PDMS para a criação de simples ou coexistindo gradientes químicos e EFS 20. Kao et al. devfugiu um chip microfluídico semelhante para modular a quimiotaxia de células de câncer de pulmão pelo EFS 6. Além disso, para aumentar o rendimento, Hou et al. projetou e fabricou um chip multicanal-dual-campo elétrico à base de PMMA para fornecer células com 8 diferentes estímulos combinados, (concentrações 2 pontos fortes EF x 4 químicos) sendo 21. Para aumentar ainda mais a todo e adicione o estímulo tensão de cisalhamento, foram desenvolvidos dois dispositivos microfluídicos à base de PMMA para estudar as respostas celulares em / elétricos estímulos de estresse / cisalhamento químicos simples ou coexistindo.

Relatado por Lo et al. 22,23, estes dispositivos contêm cinco canais de cultura de células independentes sujeitos a contínuo fluxo de fluidos, imitando o sistema circulatório in vivo. No primeiro chip (chip-química tensão de corte ou o chip CSS), cinco concentrações relativas de 0, 1/8, 1/2, 7/8, e 1 são gerados nas regiões de cultura, e um gradiente de tensão de corte é produced dentro de cada uma das cinco áreas de cultura. No segundo chip (chip químico-elétrico campo ou o chip CEF), usando um único conjunto de eletrodos e 2 bombas de seringa, cinco pontos fortes EF são gerados além de cinco concentrações químicas diferentes dentro dessas áreas de cultura. Cálculos numéricos e simulações são realizadas para uma melhor concepção e operar estes chips, e células cancerosas de pulmão cultivadas dentro destes dispositivos são sujeitos a estímulos simples ou coexistentes de observação das suas respostas com respeito à produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), a taxa de migração, e a direcção da migração. Esses chips são demonstrado ser, de alto rendimento e dispositivos confiáveis ​​para investigar como as células respondem a vários estímulos micro-ambientais de poupança de tempo.

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Protocolo

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1. Chip projeto e fabricação

  1. Desenhar padrões a ser cauterizado em substratos de PMMA e fitas dupla face usando software comercial 24.
    1. Para estudar os efeitos de concentrações químicas e tensões de cisalhamento, desenhar um padrão de "árvore de Natal" com uma largura variando em sua extremidade em cada uma das cinco áreas de cultura (Figura 1A e 1B).
    2. Para estudar os efeitos de concentrações de produtos químicos e campos elétricos, desenhar um padrão de "árvore de Natal" com dois canais fluídicos mais para pontes de sal (Figura 2A e 2B).
  2. Scribe um padrão individual em uma folha de PMMA ou uma fita dupla face, carregando o arquivo correspondente para o riscador laser de CO 2.
    1. Ligue o riscador laser, e verifique sua conexão com o computador. Abra o padrão a ser excisada utilizando o software comercial.
    2. Coloque uma folha de PMMA ou de uma fita dupla face on topo da etapa do riscador. Ajustar o foco do laser de CO 2, se necessário, usando a barra de calibração e do visível do laser de He-Ne.
    3. Carregue o padrão para o riscador para ablação na folha de PMMA ou a fita.
    4. Pegue a folha padronizada ou fita, retire peças não desejadas, e limpar a superfície com sopro de azoto.
      NOTA: A espessura da folha de PMMA é de 1 mm, e que a fita de dupla face é de 0,07 mm ou 0,22 mm.

2. Montagem Chip

  1. Com super cola, anexar os adaptadores de acrílico (comprimento x largura x altura = 10 mm x 10 mm x 5 mm, com roscas no meio) com a camada mais superior do chip, alinhando as roscas e os furos na parte superior camada -mais. Esses adaptadores servem como entradas / saídas e conectores de ponte de sal médio.
  2. Montar o chip microfluídico dentro de uma capela de fluxo laminar.
  3. Montar o chip microfluídico estresse químico-cisalhamento (chip CSS).
    1. UMAttach 3 folhas de chapas de PMMA scribed usando 2 pedaços de fita dupla face descrito. (Figura 1A e 1B).
    2. Adicionar mais um pedaço de fita de dupla face 0,07 milímetros de espessura para a parte inferior do chip e anexar o chip a um 10 cm de diâmetro numa caixa de Petri.
    3. Colocar o chip conjunto na câmara de vácuo durante a noite.
  4. Para montar o chip campo químico-elétrico (chip CEF), anexar a folha de PMMA a uma fita dupla face de espessura = 0,22 mm (Figura 2A e 2B).
    1. Anexar a folha de PMMA descrito e fita dupla face para a 10 cm de diâmetro placa de Petri usando esse mesmo pedaço de fita.
  5. Deixe o chip montado no interior do exaustor e expô-la aos raios UV por 30 min para a esterilização.
  6. Ligue as entradas para duas seringas de 3 ml através de tubos de plástico e porcas com os dedos. Ligue a saída a um tubo de resíduos através de um tubo de plástico e uma porca dedos.
    NOTA: Autoclavetodos os tubos e as porcas a 121 ° C durante 15 min antes da utilização.
  7. Lentamente pressionar o êmbolo da seringa para injetar a canais fluídicos com PBS. Empurrar seringas e para trás para remover as bolhas.
  8. Coloque as fichas dentro de uma incubadora durante a noite a 37 ° C sob 5% de CO 2.
    NOTA: Estas duas etapas são destinadas para lavar o chip e retire as bolhas restantes dentro do chip.
  9. Tome o chip fora da incubadora.
  10. Prepare pontes salinas de agar para gerar campos elétricos no chip CEF.
    1. Dissolve-se 3% de agarose de baixo ponto de fusão em tampão fosfato salino (PBS), tampão 1x usando um forno de microondas.
    2. Injectar agarose para o canal de ponte salina faseada-solução e inserir os eletrodos antes de solução solidifica.
    3. Coloque os eletrodos de prata / prata-cloreto nas porcas tubulares.
  11. Conectar as seringas para as bombas de seringa, e continuamente o fluxo de meio de cultura (Dulbecco Modificado Eagler17; s forma, de DMEM) no interior do canal de fluidos durante 10 min a um caudal de 20 ul / min para substituir PBS.

3. Preparação de células e Configuração Experimental

NOTA: Pré-aquecido 1x PBS, meio de cultura (DMEM mais FBS), e tripsina num banho de água a 37 ° C antes do uso.

  1. Placa de 2 x 10 células de cancro de pulmão 5 25,26 CL1-5 numa placa de Petri de 10 centímetros fornecido com DMEM mais soro fetal bovino a 10% (FBS). Incubar as células dentro de uma incubadora sob 5% de CO2 a 37 ° C até 90% de confluência.
  2. Aspirar o meio e lava-se as células uma vez com pré-aquecido PBS 1x. Adicionar 2 ml de tampão de tripsina a 0,05% para as células e esperar durante 2 a 3 min a 37 ° C para separar as células.
  3. Transferir as células para um tubo de centrifugação de 15 ml estéril e adicionar 6 mL de meio de cultura dentro do tubo. Inverter cuidadosamente o tubo para a mistura e retirar 5 ul do meio contendo células para contagem do número de células num hemocytometer.
  4. Centrifugar o tubo a 300 x g durante 5 min. Suspender 6 10 células em 1 ml de meio de cultura e colocar o meio contendo as células em uma seringa de 1 ml.
  5. Infundir o meio contendo células no chip microfluídico da tomada e certifique-se de que a solução distribui através de todas as cinco áreas de cultura. Incubar o chip dentro de uma incubadora sob 5% de CO2 a 37 ° C durante 2 h.

4. Configuração Experimental

  1. Tome o chip fora da incubadora e coloque-o em cima de um aquecedor de vidro de óxido de índio e estanho transparente (ITO).
    NOTA: O vidro ITO é ligado a um controlador proporcional-integral-derivativo (PID) para manter a temperatura a 37 ± 0,5 ° C por meio de retorno a partir de um acoplador térmico apertadas entre o aquecedor e o chip de ITO.
  2. Colocar o conjunto de chip-aquecedor por cima de uma plataforma XY motorizado de um microscópio invertido para o rastreamento de migração celular ou uma plataforma XY fixo deum microscópio de fluorescência invertido para medir a produção de ROS.
  3. Para gerar diferentes concentrações químicas, encher duas seringas com 5 ml de soluções químicas de concentrações relativas 0 e 1 (dissolvido em meio de cultura) e estimulá-los para o chip a taxas de fluxo desejadas: no chip CSS, a uma taxa de fluxo de 0,3 ml / min durante 1 hora; no chip CEF, a uma taxa de fluxo de 20 ul / min durante os primeiros 20 min e um caudal de 20 ul / h durante mais 120 minutos (tempo total = 2 horas).
  4. No chip CEF, para acompanhar a migração celular, o programa do estágio XY do microscópio para repetir tirar fotos, através de um single-lens reflex digital (DSLR), de determinado campo de pontos de vista (FOVs) dentro de áreas de cultura a cada 15 minutos para 2 h.
  5. Para medir a produção de ROS, utilizar o indicador baseado em fluorescência 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetato de (2'-7'-DCFDA).
    1. Prepare o estoque de 2'-7'-DCFDA a 10 mM em molecular grau biologia disulfóxido de metilo (DMSO). Diluir DCFDA única em DMEM sem soro (5 uM em DMEM). O desacetilase potencial poderia aumentar os sinais de fundo e diminuir os sinais nas células.
    2. Após 1 h de estímulo tensão de cisalhamento no chip CSS ou depois de 2 h de EF estímulo no chip CEF, bombear 2'-7'-DCFDA (5 uM em DMEM) para o chip a um caudal de 20 ul / min durante os primeiros 20 min e um caudal de 20 ul / h durante mais 20 min. Para a lavagem, a bomba de DMEM para o chip a um caudal de 20 ul / h durante 20 min.
    3. Tire fotos, através de uma câmera do dispositivo de carga acoplada (CCD), de certas FOVs dentro das áreas de cultura para analisar as intensidades fluorescentes.

5. Cálculos de concentrações químicas, tensões de cisalhamento, e campos elétricos

  1. Em ambos o chip CSS eo chip CEF, calcular as concentrações químicas nas cinco áreas de cultura. Por exemplo, através da injecção de H 2 O 2 de concentrções 0 e 200 um a partir das duas entradas, concentrações de 0, 25, são gerados 100, 175, e 200 uM.
    NOTA: Ao assumir que todos os líquidos de fluxo dividido de forma suave e igualmente em torno do garfo, as concentrações relativas nas cinco áreas de cultura são 0, 1/8, 1/2, 7/8, e 1, respectivamente.
  2. No chip de CSS, calcular a tensão de cisalhamento (τ) dentro de cada uma das áreas de cultura usando figure-protocol-1 27, onde Q é a taxa de fluxo de volume, η é a viscosidade de fluidos, h representa a altura do canal, e w é a largura do canal.
    NOTA: Ao definir Q = 0,3 ml / min em cada entrada (Q = 0,12 ml / min em cada área de cultura), η = 0,0008 Pa.s para meio de cultura, h = 1 mm e w = 1 a 4 mm, o tensão de corte é calculado para variar de 0,0048 Pa (4 mm de largura região) a 0,0192 Pa (1 mm de largura região).
  3. Dentroo chip CEF, calcular a força FE dentro de cada uma das áreas de cultura utilizando E = I / (σA FEP) (Lei de Ohm), onde I é a corrente eléctrica que flui através do canal de fluidos, σ é a condutividade eléctrica do meio de cultura, e a ef é a área da secção transversal efectiva do canal.
    NOTA: Usando σ = 1,38 Ω -1 m -1 para o meio de cultura e A EFF = 0,22 mm 2 (width = 1 mm e altura = 0,22 mm), a força EF é calculada para ser E (mV / mm) = I ( A) × 3,3 × 10 6.
    1. Como se mostra na Figura 2D, tratar o circuito equivalente, tal como cinco circuitos seção-C com quatro (8 + 35 + 8) segmentos e uma (5 + 35 + 5) do segmento.
      NOTA: Ao analisar este circuito paralelo de acordo com a lei das tensões de Kirchhoff ea lei de Ohm, as correntes que fluem através de cinco cultura sãocomo, I 1 a I 5 de baixo para cima, está calculada em cerca de 0,49 I (área 1), 0,25 I (área 2), 0,13 I (área 3), 0,08 I (área 4), ​​e 0,05 I (área 5), respectivamente, onde I é o total de corrente contínua (DC). Com uma CC aplicada de 0,157 mA, FE de 254, 130, 67, 41, e 26 mV / mm são gerados dentro das cinco áreas de cultura.
      NOTA: Para uma análise eléctrica simplificada da rede de microfluidos, todos os segmentos de fluidos são considerados como resistências com resistência proporcional aos seus comprimentos.

Análise 6. Os dados

Nota: A análise dos dados é realizada utilizando o software ImageJ.

  1. Analisar a produção de ROS.
    1. Executar o software ImageJ. Vá em "Arquivo" → Abrir para carregar uma imagem fluorescente para ser analisado.
    2. Vá até "Imagem" → "Tipo" → "16-bit" para alterar a imidade para uma escala de cinza.
    3. Desenhar um polígono para delimitar uma célula. Vá em "Analisar" → "Measure" para medir a intensidade de fluorescência média da célula.
    4. Repetir para recolher 6.1.3 intensidades de pelo menos 50 células de três experiências independentes, e calcula a intensidade média com erro padrão da média (SEM).
    5. Repita 6.1.1-6.1.4 para cada condição experimental.
  2. Analisar a migração celular.
    1. Executar o software ImageJ. Vá em "Arquivo" → Abrir para carregar uma imagem tirada no momento = 0 a ser analisado.
    2. Desenhar um polígono para delimitar uma célula. Ir para "analisar" → "medida" para medir o centro de massa da célula como (x 1, y 1).
    3. Repetir 6.2.1- 6.2.2 para medir o centro de massa da mesma célula (X 2, Y 2) a partir de uma outra imagem levar ao tempo = t.
    4. Calcular a taxa de migração (em mm / h) deesta célula como figure-protocol-2 .
    5. Repetir 6.2.1-6.2.4 para recolher as taxas de migração de pelo menos 50 células de três experiências independentes, e calcular a taxa de migração significativo com o erro padrão da média (SEM).
    6. A partir de 6.2.2 e 6.2.3, calcular o direcionamento de migração desta célula como θ cosseno ou figure-protocol-3 , Onde θ é o ângulo entre o vector da EF aplicada (de positivo para negativo) e o vector a partir do inicial até à posição final da célula (Figura 2G).
    7. Repetir 6.2.6 direcionamento para recolher a migração a partir de pelo menos 50 células de três experiências independentes, e calcular o direcionamento migração significativo com o erro padrão da média (SEM).
    8. Calcular a taxa de migração média com SEM eo direcionamento migração média com SEM para cada condição experimental.
      NOTA: A directednessde 1 indica que todas as células migram para o cátodo, e um valor de -1 indica que todas as células migram para o ânodo. O direcionamento de um grupo de células que se deslocam aleatoriamente está próxima de 0.
  3. Analisar Alinhamento celular.
    1. Executar o software ImageJ. Vá em "Arquivo" → "Open" para carregar uma imagem a ser analisada.
    2. Tratar a célula como uma elipse e desenhar uma linha para indicar ao eixo longo de uma célula. Vá em "Analisar" → "Measure" para medir o ângulo β entre a linha ea direção EF horizontal.
    3. Repetir 6.3.2 β para recolher a partir de pelo menos 50 células de três experiências independentes, e calcular a média de cosseno β com erro padrão da média (SEM).
    4. Repita 6.3.1-6.3.3 para cada condição experimental.
      NOTA: a cos β de 1 indica que todas as células alinhar paralelamente ao EF aplicada, e um valor de 0 indica que todas as células alinhar perpendicularly à EF aplicada.

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Resultados

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O estresse químico-cisalhamento (CSS) Chip

O chip CSS é feito de três folhas PMMA, cada um de 1 mm de espessura, ligados em conjunto por meio de duas fitas de duas faces, cada uma espessura de 0,07 milímetros (Figura 1A e 1B). A estrutura de "árvore de Natal" gera cinco concentrações relativas de 0, 1/8, 1/2, 7/8 e 1 nas cinco áreas de cultura. Ao conceber a área de cultura como um triângulo, ...

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Discussão

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fritas à base de PMMA são fabricadas usando ablação a laser e escrita que são métodos mais baratos e mais fáceis quando comparado aos chips baseados em PDMS que exigem litografia macia mais complicado. Após a criação de um chip microfluídico, a fabricação e montagem pode ser feito dentro de apenas 5 min. Existem alguns passos importantes que se deve prestar atenção para na realização do experimento. O primeiro é a questão "montagem". As placas deverão ser adequadamente coladas à camada mais superior do chip. C...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan sob o Contrato nº. MOST 104-2311-B-002-026 (KY Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun) e Projeto de Desenvolvimento de Carreira da Universidade Nacional de Taiwan (103R7888) (K. Y. Lo). Os autores também agradecem ao Centro de Materiais Emergentes e Dispositivos Avançados, da Universidade Nacional de Taiwan, pelo uso da sala de cultura de células.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)Gibco11965-092Meio de cultura de células
TripsinaGibco25300-054desprende a célula do prato Soro
fetal bovino (FBS)Gibco10082147Meio de cultura de células
10 cm Placa de PetriNunc150350Cultura de células
Bright-Line  HemacitômetroSigmaZ359629Cell Counting Equipment
PMMAPersonalizadoAdaptadorchip microfluídico
Personalizado Chipmicrofluídicopersonalizado
Fita dupla face de 0,07/0,22 mm 3M8018/9088Microfluídico chip
Baixo ponto de fusão agaroseSigmaA9414Ponte salina
2'-7'-diclorodihidrofluorescência diacetatoSigmaD6883Medição de ROS intracelular
Vidro de óxido de índio e estanho (ITO)Aquecedor Merck300739
Controlador proporcional-integral-derivativo Eletrônica Co. de JETECTTM-J4-R-AB Controlador detemperatura
Acoplador térmicoTECPELTPK-02AControlador de temperatura
CO2 scriber a laserFerramentas a laser e Técnica Corp.Fabricação de chips microfluídicosILS2
Bombas de seringaNew EraNE-300Bombeamento de meios e produtos químicos no chip
Fonte de alimentaçãoCiência Principal MP-300VFornecimento de correntes contínuas
Microscópio invertidoOlympusCKX41Monitoramento da migração celular
Microscópio fluorescente invertidoNikonTS-100Monitoramento de imagens celulares e sinais fluorescentes
Câmera DSLRCanon60DGravação de imagens de campo claro 
Câmera CCDNikonDS-Qi1Gravação de imagens fluorescentes 
super cola3M Scotch7004Anexando adaptadores a substratos de PMMA
AutoCADAutodesk Inc.Projetando chips microfluídicos
DMSOSigmaD8418Dissolução DCFDA
ImageJNational Institutes of HealthQuantificando intensidades fluorescentes e migração celular
de personalizado

Referências

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