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Artigo de método

A Síntese de hidrogéis RGD-funcionalizado como uma ferramenta para aplicações terapêuticas

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DOI:

10.3791/54445

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7 de outubro de 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering "Giulio Natta", Politecnico di Milano

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um protocolo para a síntese de hidrogéis funcionalizados com RGD como dispositivos para liberação de células e fármacos. O procedimento envolve cicloadição de alcino-azida catalisada por cobre (CuAAC) entre ácido poliacrílico modificado com alcino (PAA) e um derivado RGD-azida. Os hidrogéis são formados por policondensação assistida por micro-ondas e suas propriedades físico-químicas são investigadas.

Resumo

O uso de polímeros como biomateriais tem proporcionado vantagens significativas em aplicações terapêuticas. Em particular, a possibilidade de modificar e funcionalizar cadeias poliméricas com compostos capazes de melhorar a biocompatibilidade, as propriedades mecânicas ou a viabilidade celular permite que o design de novos materiais enfrente novos desafios no campo biomédico. Com as estratégias de funcionalização de polímeros, a química do clique é uma ferramenta poderosa para melhorar a compatibilidade celular e as propriedades de entrega de medicamentos de dispositivos poliméricos. Da mesma forma, a necessidade fundamental da biomedicina de usar ferramentas estéreis para evitar potenciais efeitos colaterais adversos, como toxicidade ou contaminação do ambiente biológico, dá origem a um interesse crescente na estratégia assistida por micro-ondas.

A combinação de química de clique e o método assistido por micro-ondas é adequada para produzir hidrogéis biocompatíveis com as funcionalidades desejadas e melhores desempenhos em aplicações biomédicas. Este trabalho tem como objetivo sintetizar hidrogéis funcionalizados com RGD. O RGD (ácido arginilglicilaspártico) é um tripeptídeo que pode imitar proteínas de adesão celular e se ligar a receptores de superfície celular, criando um microambiente hospitaleiro para células dentro da rede polimérica 3D dos hidrogéis. A funcionalização do RGD ocorre por meio da cicloadição 1,3-dipolar de Huisgen. Alguns grupos carboxila PAA são modificados com uma porção alcina, enquanto o RGD é funcionalizado com ácido azido como resíduo terminal da sequência peptídica. Finalmente, ambos os produtos são usados em uma reação de clique catalisada por cobre para vincular permanentemente o peptídeo ao PAA. Este polímero modificado é usado com carbômero, agarose e polietilenoglicol (PEG) para sintetizar uma matriz de hidrogel. A estrutura 3D é formada devido a uma reação de esterificação envolvendo grupos carboxila de PAA e grupos carbômero e hidroxila de agarose e PEG por meio de policondensação assistida por micro-ondas. A eficiência do mecanismo de gelificação garante um alto grau de funcionalização RGD. Além disso, o procedimento para carregar compostos terapêuticos ou ferramentas biológicas dentro dessa rede funcionalizada é muito simples e reprodutível.

Introdução

Os hidrogéis são redes tridimensionais formadas por polímeros reticulados hidrófilos, que são naturais ou sintéticos, e caracteriza-se por uma estrutura tridimensional diferente. Estes dispositivos são cada vez mais atraente nos domínios biomédicos da entrega da droga, engenharia de tecidos, portadores do gene e sensores inteligentes 1,2. Com efeito, o seu elevado teor de água, bem como as suas propriedades reológicas e mecânicas torná-los candidatos adequados para imitar microambientes dos tecidos moles e os tornam ferramentas eficazes para citocina solúvel em água ou entrega do factor de crescimento. Um dos usos mais promissor é como um biomaterial injectável transportando células e compostos bioactivos. Os hidrogeles podem melhorar a sobrevivência de células e o destino celular haste de comando, mantendo e entregar precisamente sinais reguladores de células estaminais de um modo fisiologicamente relevante, tal como observado in vitro e em experiências in vivo 3,4. A vantagem principal da presente é a possibilidadepara manter as células injectadas no interior da zona de inoculação (in situ), minimizando a quantidade de células que deixa a área e extravasa na corrente circulatória, a migração em todo o corpo e perder a baliza 5. A estabilidade das redes tridimensionais de hidrogel é devido aos seus sítios de ligação cruzada, formadas por ligações covalentes ou forças de coesão entre as cadeias de polímero 6.

Neste quadro, química selectiva ortogonal aplicada a cadeias poliméricas é uma ferramenta versátil capaz de melhorar o desempenho de hidrogel 7. Com efeito, a modificação de polímeros com grupos químicos adequados podem contribuir para fornecer químico apropriado, propriedades físicas e mecânicas para aumentar a viabilidade das células e a sua utilização na formação de tecido. Do mesmo modo, entre as técnicas para carregar células ou factores de crescimento no interior da matriz de gel, o uso do péptido RGD permite melhorias na adesão celular e na sobrevivência. RGD é um tripéptido compostade arginina, glicina e ácido aspártico, que é de longe o mais eficaz e, muitas vezes empregue tripéptido devido à sua capacidade para lidar com mais do que um receptor de adesão de célula e o seu impacto na ancoragem biológica de células, o comportamento e a sobrevivência 8,9. Neste trabalho, a síntese de hidrogeles funcionalizada-RGD é estudada com o objectivo de conceber redes caracterizados por propriedades bioquímicas suficientes para um microambiente celular hospitaleiro.

A utilização de radiação de microondas na síntese de hidrogel oferece um procedimento simples para minimizar as reacções laterais e obter taxas de reacção mais elevadas e rendimentos em um período de tempo mais curto em comparação com os processos térmicos convencionais 10. Este método não requer passos de purificação e rendimentos hidrogéis estéreis devido às interacções dos polímeros e na ausência de solvente orgânico no sistema reaccional 11. Por isso, ele garante altas porcentagens de RGD ligados à rede polimérica porque nenhuma modificaçãoficações são necessários para os grupos químicos de polímeros envolvidos na formação de gel. Os grupos carboxilo, a partir de PAA e carbómero, e grupos hidroxilo, a partir de PEG e de agarose, para dar origem a estrutura tridimensional de hidrogel através de uma reacção de policondensação. Os polímeros mencionados são usados para a síntese de hidrogeles na lesão medular tratamentos de reparação 12. Estes dispositivos, como relatado em trabalhos anteriores 13,14, mostram elevada biocompatibilidade, assim como propriedades mecânicas e físico-químicas que se assemelham às de muitos tecidos vivos e na natureza tixotrópica. Além disso, eles permanecem localizadas in situ, na zona de injecção.

Neste trabalho, os grupos carboxilo são PAA modificada com uma porção alcino (Figura 1), e um composto de RGD-azida é sintetizado explorar a reactividade do grupo terminal tripéptido -NH2 com um composto químico com a estrutura preparada (CH 2) n - N 3 ( Figura 2). Subsequentemente, o PAA modificada reage com o derivado azida por meio de RGD CuAAC reacção clique 15-17 (Figura 3). O uso de um catalisador (I) de cobre conduz a uma significativa melhoria tanto na taxa de reacção e a regio-selectividade. A reacção CuAAC é amplamente utilizado em síntese orgânica e em ciência de polímeros. Combina elevada eficiência e elevada tolerância para os grupos funcionais, e não é influenciada pelo uso de solventes orgânicos. A alta seletividade, um tempo de reacção rápida e um procedimento de purificação simples permitem a obtenção de polímeros em estrela, copolímeros em bloco ou cadeias de enxerto fracções desejadas 18. Esta estratégia torna possível clique para modificar polímeros após a polimerização de personalizar as propriedades físico-químicas de acordo com a aplicação bioquímica final. As condições experimentais são CuAAC facilmente reprodutível (a reacção é insensível à água, enquanto que a oxidação de cobre pode ocorrer minimamente), e a natureza dotriazol formado assegura a estabilidade do produto. O uso de metal de cobre pode ser considerado um ponto crítico, devido ao seu possível efeito tóxico contra as células e no microambiente biológica, mas a diálise é utilizado como um método de purificação a fim de permitir a remoção completa dos resíduos catalíticos. Finalmente, o PAA modificada RGD é utilizado na síntese de hidrogel (Figura 4) e as propriedades físico-químicas das redes resultantes são investigados, a fim de verificar o potencial de funcionalidade desses sistemas como células transportadoras ou drogas.

figure-introduction-1
Figura 1: PAA modificado síntese alcino Um esquema de funcionalização PAA com o grupo alcino;. "n" indica os monómeros com um grupo carboxilo reagir com propargilamina. Por favor clique aqui para veruma versão maior desta figura.

figure-introduction-2
Figura 2:.. RGD-azida síntese A síntese de derivado RGD-azida Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-introduction-3
Figura 3: Clique reacção Esquema de reação clique entre derivado RGD-azida e alcino-PAA.. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-introduction-4
Figura 4: Hidrogel Synthesis. RGD funcionalizado procedimento de síntese hidrogel. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocolo

Nota: Os produtos químicos são utilizados como recebidos. Linear RGD é adquirida, mas ele pode ser preparado por síntese de péptidos em fase sólida de Fmoc padrão 16,19. Os solventes são de grau analítico. A diálise requer a utilização de membranas com um M W de corte igual a 3500 Da. Os compostos sintetizados são caracterizados por espectros de 1 H RMN registados num espectrómetro de 400 MHz utilizando clorofórmio (CDCl 3) ou óxido de deutério (D 2 O), como solventes, e os desvios químicos são reportados como valores de ô em partes por milhão. Além disso, os hidrogéis são submetidas a análise por FT-IR utilizando uma técnica grânulo de KBr e sua caracterização física envolve estudos de gelificação avaliadas usando o tubo de ensaio invertido a 37 ° C.

1. Síntese de 4-cloreto de 1 Azidobutanoyl

  1. Dissolve-se 500 mg de 4-azidobutanoic ácido (3,90 mmol) em 10 ml de diclorometano e 0,5 ml de dimetilformamida.
  2. Arrefece-se a solução a 0 ° C, Usando um banho de gelo.
  3. Adicionar 505 ul de cloreto de oxalilo (5,85 mmol) a 5 ml de diclorometano e adiciona-se lentamente gota a gota, ao sistema de reacção, enquanto se agitava.
  4. Após 1 h a 0 ° C usando um banho de gelo, de regresso à temperatura ambiente.
  5. Remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo.
  6. Caracterizar o produto obtido por 1 H-RMN espectroscopia, dissolvendo a amostra em CDCl3 16.

2. Síntese de RGD-azida derivado de 2

  1. Dissolve-se 50 mg de RGD (0,145 mmol) em 1 ml de NaOH 1M.
  2. Dissolve-se 24 mg de 1 (0,16 mmol) em 2 ml de tetra-hidrofurano.
  3. Adicionar toda a solução de RGD a solução 1 gota a gota a 0 ° C usando um banho de gelo.
  4. Regressar até à temperatura ambiente e agitar durante a noite.
  5. Adicionar 1 ml de HCl 1M.
  6. Remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo.
  7. Caracterizar a obtained produto por 1 H-NMR espectroscopia, dissolvendo a amostra em D 2 O 16.

3. PAA Alcino Modificação 3

  1. Dissolve-se 200 mg de 35% w / w solução de PAA (2,8 mmol) em 15 ml de água destilada.
  2. Adicionar 15,4 mg de cloridrato de propargilamina (0,20 mmol).
  3. Dissolve-se 42,8 mg de hidrato de 1-hidroxibenzotriazole (HOBt, 0,28 mmol) em 14 ml de uma mistura 1: 1 v / v de acetonitrilo: solução de água destilada por aquecimento a 50 ° C.
  4. Adicionar toda a solução de HOBt a uma solução de PAA à temperatura ambiente.
  5. Adicionar 53,6 mg de ethyldimethylaminopropylcarbodiimide (EDC, 0,28 mmol) à mistura de reacção.
  6. Use HCl a 1 M para ajustar o pH a 5,5 e agita-se o sistema reaccional durante a noite à temperatura ambiente.
  7. Dializar a solução. Dissolve-se 11,2 g de cloreto de sódio em 2 L de água destilada e, em seguida, adicionar 0,2 ml de 37% w / w de HCl. Dializar a solução através de uma membrana com um M W de corte de 3,5 kDa.
  8. Perfodiálise rm por três dias. Alterar a solução de diálise por dia com 2 L de água destilada recentemente preparada contendo 0,2 ml de 37% w / w de HCl.
  9. Armazenar a solução final à temperatura de -80 ° C. Liofilizar-lo num liofilizador de acordo com os protocolos do fabricante.
  10. Caracterizar o polímero funcionalizado por 1 H-RMN espectroscopia, dissolvendo a amostra em D 2 O 16.

4. Síntese de PAA-RGD 4 Polymer

  1. Dissolve-se 78 mg de PAA modificada alcino 3 (1,083 mmol) em 10 ml de água destilada.
  2. Dissolve-se 25 mg de azida do RGD derivado 2 (0,0722 mmol) em 5 ml de tetra-hidrofurano.
  3. Adicionar toda a solução de RGD com a solução polimérica.
  4. Adicionar 2,2 mg de iodeto de cobre (0,0116 mmol) e 2,2 mg de ascorbato de sódio (0,0111 mmol).
  5. Levar ao refluxo a mistura resultante durante a noite a 60 ° C, com agitação.
  6. Arrefece-se a mistura a 25 ° C.
  7. DialyzE é a solução. Dissolve-se 11,2 g de cloreto de sódio em 2 L de água destilada e, em seguida, adicionar 0,2 ml de 37% w / w de HCl. Dializar a solução através de uma membrana com um M W de corte de 3,5 kDa.
  8. Executar a diálise durante três dias. Alterar a solução de diálise por dia com 2 L de água destilada recentemente preparada contendo 0,2 ml de 37% w / w de HCl.
  9. Armazenar a solução final à temperatura de -80 ° C. Liofilizar-lo num liofilizador de acordo com os protocolos do fabricante.
  10. Caracterizar o produto obtido por 1 H-RMN espectroscopia, dissolvendo a amostra em D 2 O 16.

5. Hidrogel-RGD funcionalizado Síntese

  1. Prepare o PBS. Dissolve-se 645 mg de sal de PBS em 50 ml de água destilada.
  2. Misturar 40 mg de carbómero e 10 mg de 4 PAA funcionalizado em 9 ml de PBS (passo 5.1), à temperatura ambiente, até à dissolução completa (30 min).
  3. Adicionar 400 mg de PEG para a solução e manter a agitação durante 45 min.
  4. Pare a agitação e permitir que o sistema se contentar com 30 min.
  5. Use NaOH 1 N para ajustar o pH para 7,4.
  6. Para 5 ml da mistura obtida, adicionar 25 mg de pó de agarose.
  7. Irradiar o sistema com a radiação de microondas a 500 W até ferver, durante um tempo geralmente entre 30 segundos e 1 minuto, e electromagneticamente aquecer até 80 ° C.
  8. Deixar a mistura exposta a temperatura ambiente até a sua temperatura diminui para 50 ° C e adicionam-se 5 ml de PBS (passo 5.1), a fim de obter uma solução com uma razão de 1: 1 volumétrico.
  9. Prepare 12 placa contendo cilindros de aço com múltiplas cavidades com um diâmetro de 1,1 cm.
  10. Aqui alíquotas de 500 ul da solução e coloca-los uns aos cilindros de aço.
  11. Deixar em repouso durante 45 minutos até completa gelificação do sistema.
  12. Remover os cilindros utilizando um fórceps de aço inoxidável para se obter os hidrogeles.

6. O carregamento de ferramenta terapêutica (Drug ou células)

  1. Repita steps 5,1-5,7.
  2. Quando a mistura (já no estado sol) atinge 37 ° C, adicionam-se 5 ml da solução contendo a cultura de células ou solução de fármaco desejado, a fim de se obter um sistema final numa proporção de 1: 1 volumétrico.
  3. Repita os passos 5,9-5,12 obter redes poliméricas com biocompostos fisicamente retidas dentro do gel.

7. Hidrogel Caracterização

  1. Análise de FT-IR
    1. Após a formação do gel, embeber um dos hidrogéis sintetizados em 2,5 ml de água destilada, durante 24 h.
    2. Retire os meios aquosos, onde hidrogel é submersas e congelar-seco com líquido N 2.
    3. Laminar a amostra de hidrogel de acordo com a técnica de grânulo de KBr.
      1. Adicionar uma espátula cheia de KBr num almofariz de ágata. Aqui uma pequena quantidade da amostra de hidrogel (cerca de 0,1-2% da quantidade KBr, ou apenas o suficiente para cobrir a ponta da espátula) e misturar com o pó de KBr.
      2. Moer a mistura até que o pó é fina e homogênea.
      3. Usar o kit grânulo de KBr para formar o pellet IR. Pressionar o pó usando uma prensa de laboratório manual: durante 3 min a capacidade de pressão igual a 5 toneladas e, em seguida, durante 3 min a capacidade de pressão de 10 toneladas.
      4. Solte a pressão para obter o sedimento final como homogênea e transparente na aparência. Insira o pellet no suporte de amostra do IR e executar o espectro 16.
  2. Estudos de gelificação
    1. Encha 2 ml tubo de microcentrífuga com 900 jil de PBS e equilibrar a 37 ° C.
    2. Adicionar 100 ul da solução de polímero preparada para formar o hidrogel e incubar a 37 ° C.
    3. Inverter o tubo e observar se o gel flui a 1, 2, 5, 10 e 20 min. Gravar o momento em que o gel não flui como o tempo de gelificação.

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Resultados

O derivado de alcino PAA é eficientemente sintetizados a partir do ácido poliacrílico e propargilamina, como mostrado na Figura 1 em que n rotula os monómeros cujos grupos carboxilo reagem com a amina. A identidade do produto é confirmada por 1H-RMN espectroscopia. A Figura 5 mostra o 1 H-RMN espectro de PAA modificada com ligação tripla.

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Discussão

A modificação da pós-polimerização do PAA com porções de alcino e a funcionalização do RGD com o grupo azida garantem a formação de uma ligação estável entre o polímero e o peptídeo. De fato, o triazol serve como uma unidade de ligação rígida entre os átomos de carbono, ligada às posições 1,4 do anel 1,2,3-triazol e não pode ser clivado hidroliticamente ou de outra forma. Além disso, o triazol é extremamente difícil de oxidar e reduzir, ao contrário de outras estruturas cíclicas, como benzenóides e heterociclos aromático...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesse e não receberam nenhum pagamento na preparação deste manuscrito.

Agradecimentos

Autores gostariam de agradecer ao Prof. Maurizio Masi para discussão frutífera e Miss Chiara Allegretti para edição idioma. pesquisa dos autores é apoiado pelo Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero della Salute GR-2010- 2312573).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de poli(ácido acrílico) média Mw ~100.000, 35% em peso em H2OSigma Aldrich523925CAS 9003-01-4
Poli(etilenoglicol) 2.000Sigma Aldrich84797CAS 25322-68-3
Carbomeer 974PFagron1387083
Agarose Invitrogen Corp.16500-500UltraPure Agarose
RGD peptídeoabcamab142698
ácido 4-azidobutanoicoAurum PharmatechZ-2421  CAS 54447-68-6
Cloreto de oxalilaSigma AldrichO8801CAS 79-37-8
Cloridrato de propargilamina 95%Sigma AldrichP50919CAS 15430-52-1
Iodeto de cobre (I)Sigma Aldrich3140CAS 7681-65-4
Ascorbato de sódioSigma AldrichY0000039CAS 134-03-2
Solução salina tamponada com fosfatoSigma AldrichP4417
de Membrana de Diálise, Inc.132725Membrana de Diálise Spectra/POR 3 Tubulação RC padrão
MWCO: 3,5 kD
Laboratórios de Espectro

Referências

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