Criação de abdominais aderências em Ratos

Resumo

As aderências abdominais que se formam após a cirurgia são uma das principais causas de dor, infertilidade e hospitalização e reoperação por obstrução do intestino delgado. Nosso procedimento cirúrgico para criar aderências abdominais em camundongos é uma ferramenta confiável para estudar os mecanismos subjacentes à formação de aderências.

Resumo

As aderências abdominais consistem em tecido fibrótico que se forma no espaço peritoneal em resposta a um insulto inflamatório, geralmente cirurgia ou infecção intra-abdominal. Os mecanismos precisos subjacentes à formação de aderências são pouco compreendidos. Muitos compostos e barreiras físicas foram testados quanto à sua capacidade de prevenir aderências após a cirurgia com níveis variados de sucesso. O camundongo e o rato são modelos importantes para o estudo das aderências abdominais. Várias técnicas diferentes para a criação de aderências em camundongos e ratos existem na literatura. Descrevemos aqui um protocolo utilizando abrasão do ceco com lixa e suturas colocadas na parede lateral abdominal direita. O camundongo é anestesiado e o abdômen é preparado. Uma laparotomia da linha média é criada e o ceco é identificado. A lixa é usada para lixar suavemente a superfície do ceco. Em seguida, várias suturas em forma de oito são colocadas no peritônio da parede lateral abdominal direita. A cavidade abdominal é irrigada, uma pequena quantidade de amido é aplicada e a incisão é fechada. Descobrimos que essa técnica produz as aderências mais consistentes com a menor taxa de mortalidade.

Introdução

adesões abdominais são uma forma de tecido cicatricial que se formam no abdómen em resposta à inflamação, tipicamente, após a cirurgia ou a infecção intra-abdominal. As aderências são uma das principais causas de dor abdominal crônica e infertilidade, e são a causa mais comum de obstrução do intestino delgado ^1. A presença de aderências torna a executar uma segunda operação abdominal mais difícil e aumenta a probabilidade de complicações ^2.

Apesar de anos de investigação, os mecanismos subjacentes à formação de aderências permanecem pouco compreendidos. Sabe-se que uma lesão inicial à superfície peritoneal provoca uma exsudação de fluido rica em fibrina, o qual forma um coágulo que se liga as superfícies do intestino e a parede abdominal juntamente ^3. Mais tarde, os fibroblastos e outras células migram para o espaço adesiva e secretar tecido conjuntivo ^4. Ao longo de meses ou anos a adesão amadurece através do desenvolvimento de vasos sanguíneos e nervos ^5.

Vários produtos comerciais existentes que foram concebidos para reduzir a formação de adesões após cirurgia abdominal (por exemplo, Seprafilm). Todos estes produtos actuam como barreiras mecânicas e parar a formação de aderência, impedindo o contacto físico entre alças intestinais e a parede abdominal ^6,7. Apesar das evidências de um estudo controlado que uma barreira de adesão cirúrgica reduz a formação de aderências ^8, muitos cirurgiões anecdotally foram decepcionado com a eficácia dos produtos barreira mecânica.

Actualmente não há terapias anti-adesão à base de drogas, o qual reflecte o facto de que os processos precisos envolvidos na formação de aderências são mal compreendidos. O desenvolvimento de uma terapia que visa especificamente agentes celulares e moleculares envolvidas na formação de aderências exigirá uma melhor compreensão dos eventos que estão envolvidas na formação da adesão. vários gruposs identificaram vias moleculares que podem ser importantes para a formação de aderências ^9-11. Os modelos animais proporcionam um meio ambiente excelente para o estudo da formação de aderências. Muitos estudos foram publicados descrevendo a criação cirúrgica de adesão em vários animais, em particular o rato e ratinho ^6,12-14. Dada a nossa experiência com o estudo fibrose no mouse e a ampla disponibilidade de ratinhos transgénicos e anticorpos baseado no mouse, escolhemos o rato como modelo para o estudo de aderências. Relata-se a técnica que desenvolvemos para criar reprodutível e confiável aderências abdominais no rato.

Protocolo

O protocolo a seguir foi aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade de Stanford (IACUC) e está em conformidade com todas as normas éticas institucionais sobre o uso de animais de pesquisa.

1. Criação de abdominais aderências

1. Inicie o rato na dieta de ração de antibiótico, uma semana antes do procedimento.
2. Autoclave os instrumentos cirúrgicos e pré-aquecer a solução de irrigação salina.
3. Anestesiar o mouse usando 2% de isoflurano inalado.
4. Usando uma máquina de cortar cabelo, seguido por uma aplicação rápida (5-10 segundos) de agente depilatório, remover o cabelo de a maioria da superfície do abdómen. Cuidadosamente remover o agente depilatório esfregando suavemente com uma gaze molhada e, opcionalmente, por molhando cuidadosamente a metade inferior do rato em água quente. Seque bem a animal.
5. Coloque o focinho do animal para o cone do nariz anestésico. Durante toda a cirurgia, acompanhar atentamente a rtaxa espiratory do animal e titula-se a taxa de fluxo do anestésico, conforme necessário.
6. Usar um dispositivo de aquecimento, tal como uma almofada de aquecimento ou uma lâmpada de aquecimento, para evitar a hipotermia.
7. Antes de preparar o abdómen, garantir o mouse com tiras de fita colocadas acima e abaixo do abdômen para impedir o mouse de deslocamento durante a cirurgia. Desinfectar o abdômen com betadine, então siga com etanol 70%. Incluem a maior área possível na preparação, incluindo o cabelo nas bordas da área rapada. Coloque uma cortina estéril sobre o mouse. (Figura 1)
8. Injectar por via subcutânea 0,1 mg / kg de buprenorfina, ou 3 ug para um ratinho de 30 g.
9. Fazer a incisão na pele.
   1. Começando na linha média abdominal inferior, segure a pele com uma pinça e fazer um corte vertical rasa na pele usando uma tesoura afiada.
   2. Realizar o corte superiormente ao xifóide com a tesoura. Tome cuidado para entrar apenas a pele.
10. À medida que a musculatura abdominal é now visível cobrindo as vísceras, segure a linha média da musculatura com uma pinça e cuidadosamente fazer um pequeno corte nele usando uma tesoura afiada. Certifique-se de não cortar acidentalmente em um órgão abdominal.
11. Depois de entrar no espaço peritoneal com um pequeno corte e vendo a camada muscular afastar os órgãos abdominais, estender o corte superior e inferiormente, inserindo a tesoura na abertura e cuidadosamente corte em ambas as direções. Estender a incisão do xifóide superiormente acima da bexiga inferiormente. (Figura 2)
12. Agora que os intestinos são expostos, localizar o ceco e suavemente exteriorização. Evitar agarrar o ceco com pinças dentadas ou afiadas. Em vez disso use uma pinça atraumática, como um Adson forceps serrilhadas.
13. Raspe o ceco com uma lixa.
    1. Suavemente raspe toda a superfície de ambos os lados do ceco com lixa de grão 100 para 30 - 60 segundos até que a superfície torna-se brilhante e appea menos petéquiasR na superfície. Se o cirurgião é destro, que ajuda a orientar o ceco com a ponta virada para a direita e armar o ceco sobre o dedo indicador esquerdo do cirurgião. (Figura 3)
    2. Realizar a lixar suavemente, uma vez que é fácil de fazer com que acidentalmente uma perfuração da parede cecal fina. Uma pequena quantidade de arenosidade deve ser sentida como a lixa é movido ao longo da superfície do ceco. Se a lixa é sentida repetidamente travamento no ceco, isso irá provavelmente provocar um rasgo na parede cecal. Observe com cuidado para garantir que as partículas de lixa não desalojar e permanecer no abdómen, pois isso pode causar reação de corpo estranho excessiva.
    3. Se um rasgo na parede cecal ocorre, encerrar o procedimento e eutanásia do animal.
    4. Se um vaso sanguíneo cecal é cortado pela lixa e causa sangramento, mantenha a pressão por até dois minutos com gaze. No entanto, se o sangramento persistir após esse tempo, coloque uma figura de oito 7-0 monofilamento de sutura em torno doponto de sangramento. Isto irá parar o sangramento de forma fiável em quase todos os casos. Tome cuidado para não incorporar uma grande quantidade de parede cecal para a sutura, já que esta corre o risco de provocar necrose da parte envolvida da parede.
14. Ferir a parede lateral abdominal direita.
    1. Use uma tira de lixa para lixar a superfície peritoneal do músculo da parede lateral abdominal direita. Seja mais agressivo com o lixamento aqui do que no ceco e continuar até que toda a superfície da parede lateral abdominal direita parece agredido. Evitar lixar tão difícil que a pele é visível através de aberturas na camada muscular. (Figura 4)
    2. Usando um motorista de agulha Castro-Viejo, coloque entre dois e quatro figura de oito 4-0 pontos de seda para a camada muscular da parede lateral abdominal direita. Deixar as caudas de cerca de 5 mm de comprimento. Tome cuidado para não pegar acidentalmente parede do intestino para a sutura. (Figura 5)
15. Usando uma seringa de 10 ml cheia wom aquecido salina, irrigar o intestino várias vezes. Dirigir a corrente de soro fisiológico na cavidade abdominal para irrigar o interior bem. Se a superfície inferior do mouse torna-se encharcado, mova o mouse sobre ou substituir a superfície, a fim de evitar a hipotermia.
16. Use uma gaze estéril colocado sobre a incisão para absorver o excesso de irrigação.
17. Aqui uma pitada de amido e aspergi-lo sobre a superfície da parede lateral abdominal direita e para ambos os lados do ceco. (Figura 6)
18. Certifique-se de que não há sangramento ativo. Se não é, utilizar uma esponja de gaze para aplicar pressão directamente sobre o ponto de sangramento até parar. Se o sangramento não parar imediatamente, coloque uma sutura hemostática como descrito acima.
19. Usando a extremidade cega da pinça e um dedo, suavemente empurrar o intestino de volta para a cavidade abdominal. Posicionar o ceco ao lado das suturas na parede lateral abdominal direita, a fim de maximizar a formação de aderências.
20. Cperder a incisão abdominal.
    1. Usando 6-0 sutura entrelaçada absorvível, colocar um ponto corrido para a camada muscular na parte superior da incisão.
    2. Executar a sutura para baixo em direcção ao fundo da incisão, reunindo a camada muscular. Viajar de cerca de 3 mm e tomar picadas de 3 mm a cada novo ponto. Tome cuidado para não tomar acidentalmente um pedaço de intestino ao colocar suturas.
    3. Na parte inferior da incisão, deixou um laço de sutura a partir da mordida anterior e utilizar este instrumento para atar o fio de sutura. Corte a sutura deixando 5 mm caudas.
    4. Repita os três passos anteriores com 6-0 nylon monofilamento de sutura para fechar a pele.
21. Administrar um 20 ml / kg de solução salina de bolus subcutâneo (cerca de 0,5 ml para um rato de 30 g).
22. Usando uma gaze seca, secar completamente todo o animal, como a pele dorsal tende a ficar molhada durante a irrigação.
23. Vagamente embrulhar um adesivo curativo em torno do abdômen para cobrir a incisão. Tome cuidado para não restringir a umAs pernas de nimal ou mecânica de respiração com o curativo.
24. acompanhar atentamente o animal como ele se recupera da anestesia. Administrar buprenorfina cada 12 horas durante 2-3 dias após o procedimento para controle da dor.

2. A colheita adesão tecidual

1. Espere um mínimo de sete dias após a cirurgia inicial. Mais uma vez, autoclave instrumentos cirúrgicos e anestesiar o rato com isoflurano.
2. Esterilizar o abdômen com betadine seguido por 70% de etanol. Raspar e depilar cabelo adicional a partir do lado direito do abdómen de modo a que a amostra de adesão contendo pele não irá ser coberto no cabelo, o que torna mais difícil a histologia.
3. Use uma incisão paramediana esquerda, desde intestino é muitas vezes preso à incisão inicial. Começando na extremidade inferior do abdómen, cerca de 5 mm para a esquerda do fundo da incisão original, compreender a pele com pinças dentadas pequenas e corte na pele, com uma tesoura afiada. Estender este corte superior,ly à caixa torácica. (Figura 7)
4. Com uma tesoura, para cortar a camada muscular e depois de entrar na cavidade peritoneal, alargar o corte no topo e no fundo da incisão. Haverá tecido adesivo causando o ceco e no intestino delgado para aderir à parede lateral direita do abdómen e, eventualmente, também para a incisão inicial. (Figura 8)
5. Usando as tesouras e a partir da borda da incisão, acima do nível do ceco, iniciar o corte na parede abdominal em círculo em torno da área onde o intestino é aderente.
6. Alternando acima e abaixo do nível do ceco, reduzir gradualmente a toda a volta a adesão e completar o círculo, dando origem a uma "ilha" da pele e aderente parede abdominal para o intestino. (Figura 9)
7. Novamente usando a tesoura, cortado no intestino e separar a parte aderente a partir do restante do intestino, obtendo-se uma sanduíche de tecido que consiste em pele e parede abdominalde um lado, do intestino, do outro lado, e o tecido adesivo que liga os dois no meio. (Figura 10)
8. Opcionalmente, utilizar tesouras de pontas para separar nitidamente da pele a partir do músculo da parede abdominal. Para a histologia considerar deixar a pele em anexo, mas para a digestão e isolamento de células a pele pode ser removido. Se o tecido vai ser utilizado para a histologia, certifique-se para remover o material de sutura, tanto quanto possível, sem perturbar excessivamente a interface adesiva. Para a digestão e o isolamento de células é aceitável para deixar as suturas no lugar, desde que o tecido digerido é filtrado.
9. Após excisão de tecido de adesão, eutanásia do mouse usando um método humano aprovado pelo seu comitê de uso de animais institucional.

Resultados

Aos sete dias após a cirurgia, o ceco e, possivelmente, cólon ascendente, fígado e alças de intestino delgado deve ser aderente à parede abdominal do lado direito. (Figura 8) tecido excisado pode ser embebida e seccionada e irá produzir excelentes preparações histológicas. (Figura 11, 12)

Quando o processo é realizado adequadamente, 100% dos murganhos deveria ter aderências substanciais ...

Discussão

Os passos críticos neste processo são: abrasão completamente o ceco sem causar perfuração, colocando-se suturas na parede lateral abdominal, e aplicar a quantidade certa de amido. Apenas se aplicam lixa ao ceco, ou a uma pequena porção específica do intestino. Amplo uso de lixa em grandes quantidades de intestino delgado tende a causar íleo significativa. Tome cuidado para raspar o ceco com força suficiente para que a superfície torna-se áspera, mas não tanto que as lágrimas de parede. Encontrar esse equilíbrio pode lev...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Absorventes Fisherbrand, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Poliforrado Estéril Campo, 18" x 24"	Busse Hospital Descartáveis	696	Corte um buraco retangular do tamanho apropriado
Isothesia isoflurane	Henry Schein
Fisherbrand Almofada de gaze de algodão estéril, 4 "x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Pomada oftálmica Puralube petrolato, tubo de 1/8 onças	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Creme depilatório Nair	Church & Fornecedor:Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorfina  0,3 mg/ml	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-5
Seringa de insulina de 1 cc, 27  G	Becton Dickinson	329412
Solução de Preparação de Iodopovidona	Medline	MDS093944H
Webcol cotonetes de preparação de álcool	Covidien	6818
Fita de rotulagem Labarotory de uso geral	VWR	89097-912
Luvas cirúrgicas BioGel PI	Mö lnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Fórceps com dentes	Roboz	RS-5150
Tesouras finas- afiadas	Ferramentas de Belas Ciências	14060-09
Pinças serrilhadas retas	Ferramentas de Belas Ciências	11050-10
Chave de agulha Castro-Viejo	Ferramentas de Belas Ciências	12565-14
Lixa de 1/4 folha de grão 100	ACE Hardware	1010446	Corte em tiras
4-0 sutura de seda, 30", agulha SH	Sutura	K831
7-0 PDS II, agulha 30", BV-1	Ethicon	Z135	Geralmente vem com braço duplo. Corte a sutura no meio do caminho para gerar duas suturas utilizáveis.
Amido	de arroz MP Biomedicals	102955
0,9% Cloreto de sódio Irrigação	Baxter	BHL2F7121	Quente para 37 > C antes de usar
seringa de 10 ml	Becton Dickinson	309604
6-0 Vicryl sutura trançada absorvível, agulha cônica RB-1 de 18",	Ethicon	J212H
6-0 Monofilamento de nylon de etileno, sutura de 18", agulha P-3,	Ethicon	1698G
Tegaderm Filme Transparente Estilo de Moldura de Curativo, 6 cm x 7 cm	3M	1624W	Corte ao meio no sentido do comprimento

050033 monofilamento absorvível Ethicon