Artigo de método

Enumeração de células-tronco neurais Usando clonais Ensaios

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DOI:

10.3791/54456

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4 de outubro de 2016

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1Neural Stem Cell Laboratory, Institute of Medical Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

Neste artigo

Resumo

células-tronco neurais (NCCC) referem-se a células que podem auto-renovar e diferenciar em três linhagens neurais. Aqui, descrevemos um protocolo para determinar a freqüência NSC em uma população de células determinado usando neurosphere formação e diferenciação em condições clonais.

Resumo

células-tronco neurais (NCCC) têm a capacidade de se auto-renovar e gerar os três principais linhagens neurais - astrócitos, neurônios e oligodendrócitos. NSC e progenitores neurais (PN) são comumente cultivados in vitro como neurospheres. Este protocolo descreve em detalhes como para determinar a frequência NSC em uma determinada população de células sob condições clonais. O protocolo começa com a inoculação das células a uma densidade que permite a geração de neuroesferas clonais. As neuroesferas são então transferidos para lamelas septadas e diferenciadas em condições clonais em meio condicionado, o que maximiza o potencial de diferenciação das neuroesferas. Finalmente, a frequência NSC é calculado com base nas capacidades de formação e multipotency neuroesferas. Utilidades deste protocolo incluem a avaliação dos candidatos marcadores NSC, purificação da NSC, e a capacidade de distinguir NSCs de NPS. Este método leva 13 dias para executar, o que é muito sHorter que os métodos atuais para enumerar frequência NSC.

Introdução

As células estaminais neurais (NCCC) são células do sistema nervoso central (SNC), que pode se auto-renovar e são multipotentes. NSC são primeiro especificado durante o desenvolvimento do prosencéfalo embrionário e continuam a persistir no cérebro adulto em regiões específicas, tais como a zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais e o giro dentado (DG) do hipocampo. Um número de linhas NSC estão sendo usados em ensaios clínicos para o tratamento de acidente vascular cerebral e outras doenças neurológicas, como a doença 1 de Batten.

NSC e progenitores neurais (PN) são propagadas em cultura como estruturas flutuantes em 3 dimensões esferóides chamados neurospheres. O sistema de cultura de neuroesferas foi desenvolvido por Reynolds e Weiss no início de 1990, quando se verificou que as células corticais embrionárias e adultos poderia dividir na presença de factor de crescimento epidérmico (EGF) e factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) 2-4. Neurospheres consistem em uma mistura heterogênea de cells composto de subclasses em diferentes estágios de desenvolvimento 5. É um desafio para estudar especificamente NSCs utilizando dados obtidos a partir neurospheres devido à presença de PN. Por isso, é crucial para enriquecer NSCs a partir neurospheres. Actualmente, quatro principais métodos têm sido utilizados para enriquecer para NSC in vitro. Primeiro, é a utilização de marcadores de superfície celular. Lewis-X (LeX) e CD133 (também conhecido como Prominin1) são a superfície da célula mais proeminente NSC marcadores 6-9. Sindecam-1, Notch-1 e integrina-beta1 são outras proteínas de superfície que enriquecem por NSCs 10. O segundo é a exclusão do corante. Tem sido demonstrado que as células lado populacionais, que têm a capacidade única para bombear o corante de ligação a ADN fluorescente Hoechst 33342, são enriquecidas para as NSC 11. A terceira é a utilização de uma selecção morfológica. Tem sido demonstrado que as células com o aumento do tamanho celular e granularidade abrigar mais NSC do que os seus homólogos 5,12,13. Quarta é a adição de NSC sufactores rvival para o meio de cultura. Tem sido demonstrado que a adição de sulfato de condroitina proteoglicano e apolipoproteína E melhora a sobrevivência NSC e, assim, aumenta a frequência NSC 14,15. Embora muitos marcadores, incluindo factores de transcrição têm sido associados com as NSC 16,17, nenhum destes marcadores são capazes de enriquecer as NSC à pureza. Devido à falta de marcadores definitivos NSC, que continua a ser um desafio para quantificar as NSC e distingui-las das NPs in vitro.

Os estudos iniciais usou o ensaio de formação de neurosphere (NFA) para quantificar NSCs 7,11,13. Neste ensaio, as células dissociadas são cultivadas para formar neuroesferas e o número de neuroesferas gerado por cada 100 células plaqueadas é determinada. Este valor é denominado como Unidade de Formação da Neurosphere (NFU). A NFU é igual à frequência NSC se todas as neuroesferas surgir a partir de NSC. No entanto, foi demonstrado que a NFU sobrestima a frequência NSC como neuroesferas são formados por ambos os NSCs e início de NPs 5. Assim, é imprecisa para enumerar NSCs exclusivamente com base na formação neurosphere. Poderia ser possível quantificar NSCs base na sua capacidade de auto-renovação, proliferam extensivamente e gerar neurospheres multipotentes.

NSC, que são EGF e bFGF responsivo, normalmente sobreviver por pelo menos dez passagens e, assim, exibir grande capacidade de auto-renovação na cultura 4,18-20. PN, que são EGF e bFGF responde bem, também poderia gerar neurospheres para algumas passagens, mas não para um longo período de tempo. Por isso, tem sido amplamente aceito que NSCs de boa fé podem ser enumerados, com precisão justa, com base na formação neurosphere por pelo menos dez passagens. Na maioria dos estudos, no entanto, de auto-renovação é geralmente medido com base na formação neuroesfera secundário ou terciário, devido ao tempo necessário para experimental longo de dez passagens. Assim, o NFA secundária pode ser utilizado para comparar a aposta largamente a capacidade de auto-renovaçãopopulações ween, mas não podem ser usadas para enumerar com precisão a frequência NSC.

NSCs têm uma maior capacidade proliferativa em comparação com NPS. Esta propriedade do NSC foi usada por Louis et al. para desenvolver um ensaio para a enumeração NSC - o ensaio neural de formação de colónias de células (NCFCA) 21,22. Neste ensaio, células isoladas são cultivadas durante 3 semanas em uma matriz semi-sólida contendo colagénio. Sob estas condições de cultura, mostrou-se que as células que formam neuroesferas acima de 2 mm de diâmetro são tripotent e pode auto-renovação por longo prazo. Estas células são definidos como NSC. Portanto, as NSC são eficazmente distinguido de PN.

NSC têm a capacidade de se diferenciar em astrócitos, oligodendrócitos e neurónios. Para a diferenciação de neuroesferas, factores de crescimento e soro são removidos é adicionado ao meio de cultura. Se todas as três linhagens neurais são observadas num neuroesfera, em seguida, a célula que iniciou que neuroesfera is uma NSC. No entanto, o ensaio de diferenciação tem algumas limitações. Em primeiro lugar, as condições de cultura utilizadas para a diferenciação pode não ser óptimo para a geração de todas as três linhagens neurais. De fato, em um único processo de diferenciação neurosphere, morte celular significativa ocorre e, principalmente, geração de astrócitos ocorre (Tham M e Ahmed S, não publicado). Em segundo lugar, há a questão de clonalidade. Para a enumeração precisa da NSC, a formação e a diferenciação das neuroesferas tem que ser realizada sob condições clonais, em que cada neuroesfera surge de uma única célula. Em culturas de suspensão em massa, a agregação ocorre em ambos os níveis celulares e neuroesferas 23-25. Portanto, é possível para cada neuroesfera a surgir a partir de várias células ou neuroesferas, o que complica a contagem e avaliação de multipotência neuroesfera. Evidências recentes mostram que a agregação de células não ocorre a baixa densidade de revestimento de 0,5 células / mL ou abaixo, e quando placas de cultura não são movidos durante neuformação rosphere 15. Assim, a cultura de células de baixa densidade tal iria assegurar a clonalidade.

Atualmente, o NCFCA é o método mais comumente usado para distinguir NSCs de NPs e enumerar frequência NSC. O NCFCA, no entanto, requer um tempo relativamente longo de três semanas. Aqui, descrevemos um protocolo para enumerar frequência NSC com base na capacidade de NSCs para formar neurospheres multipotentes. Este protocolo leva apenas 13 dias para executar. A clonalidade NCFCA assegura que a matriz de colagénio impede o movimento das neuroesferas. As condições de cultura utilizadas neste protocolo também permite clonalidade para ser mantida durante todo. Por exemplo, o uso de 50 poços lamelas de câmaras assegura que as neuroesferas irá diferenciar sem contacto uma com a outra. Além disso, usar o meio que fornece factores neurotróficos durante a diferenciação para maximizar o potencial de diferenciação das neuroesferas (Figura 1) condicionado.

Protocolo

O tratamento dos animais foi realizada em conformidade com as directrizes IACUC e NACLAR e aprovadas pelo departamento de animais ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11).
NOTA: As culturas de neuroesferas foram preparados a partir do prosencéfalo de embrionário (E14) ratinhos C57BL / 6, como previamente descrito 5.

1. Cultura de neuroesferas de exemplo clonais (Dia 1)

  1. Prepare meio de crescimento NSC através da combinação de (DMEM / F12) meio de Dulbecco modificado por Eagle Médium / Nutrient F-12 com suplemento B27 (concentração final: 1x), EGF (concentração final: 20 ng / mL), bFGF (concentração final: 10 ng / ml) e penicilina / estreptomicina (concentração final: 1x).
  2. Separar as neuroesferas rato E14.5 em 1 mL de meio de crescimento NSC e 1 mL de hidróxido de sódio 0,05 N durante 7 minutos à TA. células de pipeta cima e para baixo de vez em quando para manter as células em suspensão. Adicione 1 mL de 0,05 N de ácido clorídrico para neutroize a alcalino.
    NOTA: Neurosphere células são semeadas a 20000 células / ml num prato de cultura de 10 centímetros e são cultivadas durante 5 d, a 37 ° C, 5% de CO 2. O rendimento esperado após é de cerca de 10 milhões de células por placa de 10 cm. Estas células são então dissociados e semeadas a uma densidade clonal conforme descrito nas etapas 1.2 e 1.3, respectivamente.
    1. Efectuar a contagem de células por meio da coloração com azul de tripano e um hemocitómetro.
  3. células de rato E14.5 neuroesferas única semente, a uma densidade de 50 células / ml ou inferior a 100 em meio de crescimento NSC ul numa placa de 96 poços. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 1 W para gerar neuroesferas clonais.
    NOTA: é assegurada durante a clonalidade neuroesfera formação neste densidade como as células não contactam entre si.

2. Cultura de neuroesferas de meio condicionado (dia 3)

  1. Separar as neuroesferas rato E14.5, tal como descrito na etapa 1.2.
  2. células isoladas de sementes de E14,5 neuroesferas do rato, a uma densidade de 20.000 células / ml num meio de crescimento 10 mL NSC numa placa de cultura de 10 cm. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 5 d para gerar neuroesferas cultivadas em massa.

3. Preparação de Neurosphere meio condicionado (dia 8)

  1. Preparar a solução de revestimento por mistura de 700 mL de 0,01% de poli-L-lisina (PLL), 70 ul de 1 mg / mL de laminina e 6230 mL de tampão fosfato salino (PBS).
  2. Bata de um prato de cultura de 10 cm, com 7 ml de solução de PLL / laminina, durante 2 h a 37 ° C.
  3. Usando uma pipeta sorológica 10 mL, transferir todos os neurospheres cultivadas em massa para um mL tubo de 15 cônico centrífuga. Centrifugar as neuroesferas a 171 xg durante 1 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante completamente.
  4. Prepare meio de diferenciação NSC através da combinação de meio DMEM / F12 com B27 (concentração final: 1x) e Soro Fetal de Bovino (FBS) (concentração final: 0,5%) Add 10 mL de NSC diferenciação médio a neurospheres. Pipeta cima e para baixo algumas vezes para voltar a suspender as neurospheres.
  5. Aspirar PLL / laminina a partir do prato de cultura de 10 cm e lavar uma vez com 10 mL de PBS. Transferir todas as neuroesferas para o prato de cultura de PLL / laminina-revestido de 10 cm. Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2 para as neuroesferas a aderir ao prato.

4. Determinação da NFU da Amostra neuroesferas (dia 8)

  1. Contar o número de neuroesferas (semeadas no dia 1; secção 1) formada em cada poço sob um microscópio.
    NOTA: Determinar o número de neurospheres formadas por 100 células plaqueadas, que dá a NFU.

5. Transferência de neuroesferas exemplo para 50 poços Chambered lamela (dia 8)

  1. Revestimento cada poço de uma lamela de 50 poços compartimentado com 10 mL de solução de revestimento de PLL / laminina, durante 2 h a 37 ° C.
    NOTA: Preparar a solução de revestimento como descrito emo passo 3.1.
  2. Preparar 3 x 50 ml de tubos de centrífuga cónico contendo 30 mL de PBS cada uma. Utilizando uma pinça estéril, retire o revestido lamela de 50 bem compartimentado. Mergulhar o lamela compartimentado para dentro do primeiro tubo de PBS, seguido por um segundo e, em seguida, o terceiro tubo de PBS, para lavar a solução de revestimento.
  3. Aspirar todo o líquido restante das cavidades da lamela septadas.
  4. Pipeta suavemente todo o meio e neuroesferas de cada poço da placa de 96 poços e transferi-lo para uma única placa de cultura de 10 cm.
  5. Sob um microscópio, escolher um neurosphere amostra usando uma micropipeta P10 equipado com uma ponta de pipeta 10 mL. Assegure-se que apenas um único neuroesfera é recolhido de cada vez, definindo a coluna pipeta de 2 mL. Utilize uma nova ponta de pipeta para cada neurosphere.
  6. Transferir a neuroesfera para o centro de um poço revestido da lamela 50 poços septadas.
  7. Repita os passos 5.5 e 5.6 até que cada uma das cavidades da Conta lamela septadasins um neurosphere.
    NOTA: As neuroesferas podem ser retirados sob um microscópio colocada numa câmara de fluxo laminar ou em uma bancada.
  8. Adicionar 10 uL de NSC meio de diferenciação em cada poço da lamela câmaras. Coloque a lamela compartimentado em um prato de cultura de 10 centímetros e pipeta de PBS ao longo das bordas do recipiente para evitar a secagem do meio de diferenciação NSC. Coloque até duas lamelas câmaras em uma placa de cultura de 10 cm. Incubar a lamela câmaras (contida no prato de cultura de 10 cm) durante a noite a 37 ° C, 5% de CO 2.

6. Diferenciação de neuroesferas de exemplo (dia 9)

  1. Transferir o meio de diferenciação das neuroesferas cultivadas em massa (de secção 3) a um tubo de 15 mL cônico centrífuga. Assegure-se que 2-3 mL de meio de diferenciação permanece no prato de cultura para evitar que as células aderiram se desprendam. Utilizando uma seringa estéril de 20 mL, passar o meio de diferenciação através de um 0,2 μm filtro para remover quaisquer células ou detritos.
  2. Transferir o meio de diferenciação filtrada de volta para o prato de cultura de 10 cm, que inclua as células aderidas.
  3. Utilizando uma pinça estéril, coloque delicadamente a lamela chambered para o meio de diferenciação de uma forma invertida de modo que os neurospheres amostra estão virados para baixo. Incubar a lamela compartimentado com o meio de diferenciação durante 3 d a 37 ° C, 5% de CO 2.
    NOTA: Os neurospheres amostra estão em contacto com o meio de diferenciação, mas não em contacto com as células de diferenciação abaixo.

7. Reparação de Diferenciada neuroesferas (dia 12)

  1. Remova cuidadosamente a lamela câmaras da placa de cultura 10 cm, usando uma pinça estéril. Delicadamente mergulhe a lamela em PBS para lavar o meio condicionado.
  2. Retire a junta de silicone a partir da lamela. Executar esta suave e lentamente para evitar a quebra da lamela. Tome nota do lado onde the diferenciado neurospheres são respeitados.
  3. Pipete 1 mL de 4% de paraformaldeído (PFA) sobre um pedaço de película de parafina corte ao tamanho da lamela. Delicadamente, coloque a lamela no filme de parafina com as neurospheres virados para baixo em contacto com o PFA. Fixar as neuroesferas durante 20 min à TA.
    Cuidado: PFA é tóxico tanto na forma líquida e de vapor e é inflamável. Evitar a inalação de vapor e entre em contato com a pele e os olhos. Sempre lidar com PFA em um exaustor ventilado.
  4. Pipete 1 mL de PBS para um pedaço de película de parafina. Lavar as neuroesferas, colocando suavemente as lamelas com as neuroesferas virada para baixo em contacto com PBS durante 10 min à temperatura ambiente.
  5. Repita o passo 7.4 mais duas vezes.

8. O4 Coloração de Diferenciada neuroesferas (dia 12)

  1. Prepare a 3% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS. Pipete 1 mL de BSA a 3% para um pedaço de película de parafina. Bloquear os neurospheres por placin gentilmenteg a lamela (com as neuroesferas voltada para baixo) em contacto com o de BSA durante 30 min à temperatura ambiente.
  2. Pipete 1 mL de anticorpo de ratinho anti-IgM O4 (1: 300 de diluição em BSA a 3%) sobre um pedaço de película de parafina e colocar as lamelas sobre a película de parafina com as neuroesferas virados para baixo em contacto com o anticorpo. Permitir O4 coloração para ocorrer durante 2 horas à TA.
  3. Lava-se a lamela duas vezes com PBS como descrito no passo 7.4.
  4. Pipete 1 mL de anticorpo verde corante fluorescente conjugado anti-IgM de ratinho secundário (diluição 1: 500 em BSA a 3%) sobre um pedaço de película de parafina e colocar as lamelas sobre a película de parafina com as neuroesferas virados para baixo em contacto com o anticorpo . Deixar durante 1 h à TA no escuro.
    Nota: Execute imunocoloração em um ambiente escuro a partir desta etapa em diante.
  5. Lava-se a lamela duas vezes com PBS como descrito no passo 7.4.

9. TUJ1 e glial fibrilar ácida proteína (GFAP) ColoraçãoDiferenciadas de neuroesferas (dia 12)

  1. Preparar a solução de permeabilização através da adição de Triton X-100 (concentração final: 0,5%) para a BSA 3%. Pipete 1 mL de solução de permeabilização sobre uma folha de película de parafina. Coloque lamela sobre a película de parafina com as neuroesferas virados para baixo em contacto com a solução de permeabilização durante 20 min à TA.
  2. Lava-se a lamela duas vezes com PBS como descrito no passo 7.4.
  3. Pipete 1 mL de rato anticorpo anti-TuJ1 IgG 2a (diluição de 1: 500 em BSA a 3%) de anticorpo IgG e de coelho anti-GFAP (1: 1000 de diluição no BSA a 3%) sobre um pedaço de película de parafina e lugar lamela sobre o filme de parafina com as neuroesferas virados para baixo em contacto com os anticorpos. Permitir TUJ1 e coloração GFAP a ocorrer durante 2 horas à TA.
    NOTA: ambos os anticorpos podem ser preparados como uma solução única.
  4. Lava-se a lamela duas vezes com PBS como descrito no passo 7.4.
  5. Pipete 1 mL de corante fluorescente vermelhoconjugado anti-ratinho IgG 2a (diluição de 1: 500 em BSA a 3%) e IgG de corante fluorescente conjugado anti-coelho vermelho longe (diluição de 1: 500 em BSA a 3%) anticorpos secundários sobre uma folha de película de parafina e lugar lamela sobre a película de parafina com as neuroesferas virados para baixo em contacto com os anticorpos. Deixar durante 1 h a RT.
    NOTA: ambos os anticorpos podem ser preparados como uma solução única.
  6. Lava-se a lamela duas vezes com PBS como descrito no passo 7.4.
  7. Solução diluída de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) estoque a 300 nM em PBS. Pipete 1 mL de DAPI sobre uma folha de película de parafina e lugar lamela sobre a película de parafina com as neuroesferas virados para baixo em contacto com DAPI durante 2 min à temperatura ambiente para a coloração de núcleos.
  8. Lava-se a lamela uma vez com PBS e duas vezes com água desionizada, como descrito no passo 7.4. Monte a lamela numa lâmina de vidro usando um meio de montagem adequado e deixar secar O / N à temperatura ambiente.

10. Imaging de Diferenciada neuroesferas (dia 13)

  1. neurospheres imagem sob um microscópio confocal utilizando uma 40X. Use os lasers a 488 nm, 594 nm e 647 nm para detectar oligodendrócitos, neurónios e astrócitos, respectivamente.
  2. Determinar a percentagem de unipotente, bipotent e tripotent neurospheres.
    NOTA: potência é determinada pela capacidade da neuroesfera de se diferenciar em linhagens as três neurais - oligodendrócitos, neurónios e astrócitos 5,14,15,26. Os oligodendrócitos são identificados por coloração positiva para O4 (secção 8). Os neurônios são identificados por coloração positiva para TuJ1 (secção 9). Os astrócitos são identificados por coloração positiva para GFAP (secção 9). A neurosphere unipotentes diferencia em apenas um da linhagem e deve manchar positivamente para qualquer O4, GFAP ou TuJ1. A neurosphere bipotent diferencia em quaisquer duas linhagens e deve manchar positivamente para O4 e GFAP ou O4 e TuJ1 ou GFAP e TuJ1. A neurosphere tripotent diferenteIates em todas as três linhagens e deve manchar positivamente para O4, GFAP e TuJ1.
  3. Determinar a freqüência NSC na população de interesse, utilizando a seguinte fórmula:
    NSC frequência = (NFU x% do neurospheres tripotent) / 100%.

Resultados

Nós temos usado este protocolo para avaliar a capacidade de o Lex, uma superfície celular conhecido NSC marcador 7, para enriquecer NSC. Os dados deste estudo serão utilizados para ilustrar como NSC são enumeradas utilizando os ensaios clonais no protocolo. células de ratinho E14.5 neuroesferas foram incubadas com anticorpo anti-Lex. Subsequentemente, as células que expressam Lex (LeX +) e células que não expressam Lex (Lex -) foram semeadas a 50 células / ml por meio de fluorescência celular-Activated (FACS) e deixado para gerar neuroesferas clonais para uma semana. Imagiologia de lapso de tempo mostra que as neuroesferas gerado em 50 células / ml são clonais (Figura 2). A NFU para LeX + e Lex - células foi determinada. Mostrou-se que células + lex tem uma capacidade significativamente mais elevada em comparação com a formação de neuroesfera Lex - células (Figura 3G). As neuroesferas diferenciadas foram então geradossob condições clonais, posteriormente histoquímica e fotografada (Figura 3a-e). Células Lex + gerar significativamente mais neurospheres tripotent que Lex - células (Figura 3F). A frequência NSC foi então calculado com base na NFU e% de neuroesferas tripotent (Figura 3G). Selecção com base em lex enriquece frequência NSC por mais de 14 vezes, validando LeX como um marcador NSC. Nós também determinaram a freqüência NSC de neurospheres rato E14.5 usando este protocolo 27 e NCFCA 28. Ambos os métodos relatam frequência NSC comparável de cerca de 2% em neurospheres rato E14.5.

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Figura 1. Protocolo para Neurosphere Diferenciação em Condições clonais. Neurospheres Amostra cultivadas sob condições clonais são colocados individualmente em cada PLL / laminina-coated poço de uma lamela de 50 poços câmaras, e deixadas aderir S / N. No mesmo dia, neuroesferas cultivadas a granel são plaqueadas em meio de diferenciação em um PLL / revestidos por Laminina placa de 10 cm e deixadas a aderir S / N. No dia seguinte, o meio condicionado a partir das neuroesferas cultivadas em massa é filtrada e colocada de volta na placa de 10 cm. Os neurospheres amostras são então invertido para o meio condicionado e permitiu diferenciar por 3-4 dias 28. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. Crescimento de um clonal Neurosphere. As células derivadas de neuroesferas foram dissociadas E14.5 e semeadas a 50 células / mL em 96 poços prato. As células individuais foram rastreados para 6 d por imagem time-lapse. Imagens de one tal célula crescer em um neurosphere é mostrado. Note-se que o neuroesfera mantém clonalidade. (A) 0 dias; (B) 1.19.45; (C) 2.95.37; (D) 3.32.76; (E) 4.46.53; (F) 5.61.44; onde o primeiro número refere-se ao dia, segundo número refere-se à fracção do dia, e o terceiro número refere-se à fracção do h. ampliação de 10x. Barra de escala, 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Diferenciação de neuroesferas Clonal e contagem de NSC Frequência. Neurospheres individuais foram escolhidas e diferenciados em lamela de 50 bem compartimentado para 3 d. A imagem representativa de um sta tripotent neurosphereinada com (a) DAPI e imunocoradas para (b) GFAP, (c) TUJ1 e (d) O4. (E) mostra a sobreposição de (a) - (d). Barra de escala, 65 mm. (F) A% de unipotente, bipotent e tripotent neuroesferas gerados por Lex + e Lex - células (média ± SEM; n = 3). (G) a frequência NSC em Lex + e Lex -. Células calculadas como o produto da NFU e% do neurospheres tripotent Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Descrevemos hee a enumeração de NSCs em condições clonais. As etapas críticas incluem a utilização de meio de crescimento e diferenciação NSC fresco, e também o uso da solução de PLL / laminina recentemente preparada para revestir as lamelas de câmaras, bem como as placas de cultura. Isso garante condições de crescimento e diferenciação ótimas de neurospheres. A utilização de anticorpos de boa qualidade para detectar eficazmente os neurónios e glia, bem como a colheita selectiva de neuroesferas clonais que não estão em contacto com outros neuroesferas, são críticos. Além disso, é importante para assegurar as neuroesferas escolhidas não secam. Recomenda-se adicionar 10 pL de meio de diferenciação em cada poço após a colheita cada 10 neuroesferas. É importante a utilização de uma lamela compartimentado em um prato de 10 cm por exemplo para evitar conversas cruzadas entre diferentes amostras de neuroesferas. Se duas lamelas (cada um contendo a partir de neuroesferas amostras diferentes) são colocados namesma placa de 10 cm, neurospheres de uma lamela pode liberar fatores que podem alterar a propensão dos neurospheres na outra lamela de se diferenciar em linhagens específicas. Duas lamelas na mesma placa de 10 cm pode também resultar em mistura entre amostras.

No caso de a NFU ou a frequência NSC é menor do que o esperado, garantir que o número baixo de passagem neurospheres são usados. É também importante que saudáveis ​​neuroesferas baixa passagem são utilizados para gerar o meio condicionado. Em seguida, se as neuroesferas são cultivadas em poços com pequeno diâmetro, tal como em 96 poços prato, então será mais difícil de manobrar e escolher neuroesferas utilizando uma micropipeta. Neste caso, as neuroesferas transferir para um prato de cultura maior, tal como um prato de 6 poços, antes da colheita. Alguns dos neurospheres escolhidos podem levantar da lamela chambered durante a cultura e imunocoloração. Minimizando o movimento da lamela septadas durante a cultura, e menos lavagem intensivaing durante a imunocoloração, ajudaria a evitar o destacamento de neurospheres.

Estudos iniciais quantificados NSCs usando apenas a NFA 7,11,13. No entanto, a NFA superestima a freqüência NSC como ambos NSCs e início NPs gerar neurospheres 5. Louis et ai. Desenvolveram um outro método para quantificar as NSC conhecido como o NCFCA 21,22. O NCFCA envolve a cultura de células isoladas numa matriz à base de colagénio para assegurar a clonalidade, e foi mostrado que neuroesferas acima de 2 mm de diâmetro são formadas por apenas NSC. Semelhante ao NCFCA, clonalidade é assegurada durante todo esse protocolo. Isto é conseguido através da geração de neuroesferas com uma densidade clonal e a diferenciação das neuroesferas em lamelas de câmaras. A utilização de lamelas septadas confere um número de vantagens. A lamela câmaras permite que cada neurosphere amostra para diferenciar sem ter contato físico com outros neurospheres amostra, garantindo assim clonalidade durante a diferenciação.A lamela câmaras podem ser colocados em suspensão no meio de diferenciação para permitir que as neuroesferas amostra a ser continuamente condicionado e para assegurar a diferenciação máxima. Na ausência de meio condicionado e soro durante a diferenciação, a sobrevivência das neuroesferas diminui e as neuroesferas principalmente gerar astrócitos (Tham M e Ahmed S, não publicado). Além disso, as neuroesferas imunocoradas pode ser convenientemente armazenado por um longo período de tempo e as lamelas de câmaras pode ser montado directamente sobre as lâminas de vidro de microscópio. Além disso, a imagem latente dos neurospheres imunocoradas é feita fácil como se pode localizar rapidamente o neurosphere na pequena bem compartimentado, capturar uma imagem, e passar para a próxima também.

Nós determinamos a freqüência NSC em E14.5 cultura rato neurosphere usando tanto o protocolo descrito neste manuscrito 27 e NCFCA 28. A freqüência NSC em neurospheres rato E14.5 determinado tanto methods são comparáveis. O NCFCA enumera as NSC que são multipotentes e têm capacidade de auto-renovação a longo prazo. Como a freqüência NSC do nosso método é comparável à de NCFCA, a leitura do nosso protocolo não parece superestimar a freqüência NSC. O NCFCA requer três semanas para ser concluída e, principalmente, envolve plaqueamento celular e reposição médio. O protocolo aqui descrito requer 13 dias de executar e envolve uma série de passos diferente, por exemplo, colheita de neuroesfera e imunocoloração. Este protocolo pode servir como um método alternativo para enumerar NSC. Os pesquisadores podem usar tanto NCFCA e este protocolo para verificar a frequência NSC em suas amostras.

Uma limitação deste protocolo é que uma série de passos importantes têm de ser todos realizados no dia 8. A preparação do meio condicionado, a determinação do NFU de neurospheres amostra e transferência de neurospheres de exemplo para a lamela 50 poços Chambered tem que ser realizada sobre day 8. Pode levar algum tempo para concluir essas etapas. Além disso, requer a prática de realizar estes passos de uma maneira eficiente.

Neurospheres têm sido amplamente utilizados para estudar a função e comportamento NSC. No entanto, neurospheres consistem em ambas as NSCs e NPS. Por isso, é importante para enriquecer a partir de neuroesferas NSC para estudar a biologia NSC. Actualmente, marcadores de superfície celular, de propriedades de exclusão de corante assim como o tamanho celular e granularidade foram usadas para enriquecer para NSC 6,7,9-13,29,30. Este protocolo pode ser usado para quantificar o enriquecimento de NSCs por potenciais marcadores NSC, e para facilitar a busca por um marcador NSC definitiva. Quatro estudos recentes têm utilizado este protocolo para enumerar NSC frequência 5,14,15,26.

Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos a Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa (A * STAR), Cingapura para financiar esta investigação.

Materiais

2
Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de centrífuga cônicos de 15 mL BD352096
tubos de centrífuga cônicos de 50 mL BD352070
Seringa estéril de 20 mL   Seringa estéril BD300141
50 mL BD300144
Soro Fetal Bovino (FBS) BiowestS1810
Camundongo anti-Tuj1 IgG2a anticorpoCovanceMMS-435P-100
Coelho anti-GFAP
Hemocitômetro Microscópio Hausser Scientific3100
instalado na capa de fluxo laminar LeicaMZ6
Marienfeld-superior1000200
Anticorpo anti-O4 IgM para camundongos Microscópio Merck MilliporeMAB345
HydromountNational DiagnosticsHS-106
Nikon EclipseTS100-F
culturaNuAireNU-543
96 poçosNUNC167008
placas de cultura de 10 cm NUNC150350
Filme de parafinaParafilmPM999
Fator de crescimento epidérmico humano (EGF) PeprotechAF-100-15
Fator de Crescimento de Fibroblastos Humanos Básicos Recombinantes (bFGF) Peprotech100-18B
0.2 µ Filtro M Sartorius Stedim16534-K
0.45 µ filtro mSartorius Stedim16555-K
1.0 N Hidróxido de Sódio (NaOH) Sigma-AldrichS2770
1.0 N Ácido clorídrico (HCl) Sigma-AldrichH9892
Trypan Azul Sigma-AldrichT8154
Poli-L-Lisina (PLL) Sigma-AldrichP8920
 Sigma-AldrichP6148
Albumina de Soro Bovino Tóxico (BSA) em pó Sigma-AldrichA7906
Lamínulas com câmara de 50 poços Placa de agitação Sigma-AldrichC7735
com função de aquecimento StuartUC152
DMEM/F12 médioThermo Fisher Scientific11320-033
Suplemento B27Thermo Fisher Scientific17504044
Penicilina-Estreptomicina Thermo Fisher Scientific15140-122
LamininaThermo Fisher Scientific23017-015
1x Solução salina tamponada com fosfato sem Ca2+ e Mg2+ (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190144
Alexa Fluor 488 anticorpo IgM de cabra anti-ratoThermo Fisher ScientificA21042
Alexa Fluor 594 anti-rato de cabra IgG2a anticorpoThermo Fisher ScientificA21135
Alexa Fluor 647 anti-coelho de cabra IgGThermo Fisher ScientificA31573
4',6'-diamidino-2-fenilindol dicloridrato (DAPI) Thermo Fisher ScientificD3571
Thermo Fisher Scientific  RT1 75002383
Pipetas PasteurThermo Fisher Scientific10006021
Incubadora
Hotte Capela-exaustão
Aspirador
Microscópio
Micropipetas
Pontas de
Pipetas de plástico Pipetas
multicanal
Copo
Pinça
Medidor de
IgG Dako Z033401 Lâminas de vidro Capa de fluxo laminar Placas de de Pó de Paraformaldeído (PFA) Centrífuga de cultura de células de COventiladaconfocalmicropipetade vidroestéril pH

Referências

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