Este protocolo descreve o isolamento e quantificação de pequenos RNAs de lipoproteína de alta densidade.
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Artigo de método
O isolamento de lipoproteínas de alta densidade para não codificante pequeno ARN Quantificação
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A diversidade de pequenos RNAs não-codificantes (sRNA) está se expandindo rapidamente e seu papel nos processos biológicos, incluindo a regulação do gene, estão surgindo. Mais interessante, sRNAs também se encontram fora das células e são estavelmente presente em todos os fluidos biológicos. Como tal, sRNAs extracelular representam uma nova classe de biomarcadores da doença e estão provavelmente envolvidos em redes de comunicação intercelular de sinalização celular e. Para avaliar o seu potencial como biomarcadores, sRNAs podem ser quantificados no plasma, urina e outros fluidos. No entanto, para compreender totalmente o impacto de sRNAs extracelulares como sinais endócrinos, que é importante para determinar que os transportadores são transporte e protegendo-os em fluidos biológicos (por exemplo, plasma), que células e tecidos contribuem para piscinas srna extracelulares, e as células e os tecidos capazes de aceitar e utilizando extracelular sRNA. Para atingir essas metas, é fundamental para isolar populações altamente puras de portadores extracelularessRNA para perfilar e quantificação. Temos anteriormente demonstrado que as lipoproteínas, particularmente lipoproteínas de alta densidade (HDL), o transporte de microRNAs funcionais (miRNA) entre as células e HDL-miRNAs são significativamente alterados na doença. Aqui, nós detalhe um novo protocolo que utiliza conjunto de isolamento HDL com ultracentrifugação em gradiente de densidade (DGUC) and-fast-proteína cromatografia líquida (FPLC) para obter HDL elevado grau de pureza para perfilamento a jusante e quantificação de todos os sRNAs, incluindo miRNAs, usando tanto alta sequenciamento -throughput e em tempo real abordagens de PCR. Este protocolo será um recurso valioso para a investigação de sRNAs sobre HDL.
Introdução
Não codificantes pequenos RNAs extracelular (sRNAs) representam uma nova classe de marcadores de doença e potenciais alvos terapêuticos e provavelmente facilitar a comunicação uma célula-a-célula. O tipo mais amplamente estudado de sRNA são microRNAs (miRNA), que são cerca de 22 nts de comprimento e são processados de formas precursoras mais longos e transcritos primários 2. miARNs foram demonstradas para o pós-transcricionalmente regular a expressão do gene através da supressão da tradução de proteínas e a indução do ARNm da degradação 2. No entanto, os miRNAs são apenas um dos muitos tipos de sRNAs; como sRNAs pode ser clivada a par....
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Protocolo
1. A purificação de HDL (~ 5,5 dias)
- Gradiente de densidade de Ultracentrifugação (DGUC, ~ 5 dias)
- Adicionar 90 uL de 100x anti-oxidantes para 9 ml de plasma isolados a partir de sangue venoso fresco.
- Ajustar a densidade de plasma com KBr partir de 1,006 g / mL a 1,025 g / mL por adição de 0,251 g de KBr a 9 mL de plasma a partir do passo 1.1.1 (0,0278 g / ml de plasma de KBr). Balance o plasma até que todo o sal é dissolvido à temperatura ambiente e transferir para tubos de ultracentrífuga e assegurar que todas as bolhas subam para o topo.
- Dobre a ponta de uma agulha de 18 G a 90 ° 1 cm da ponta, o lado bisel voltado para cima....
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Resultados
Este protocolo é uma série de métodos estabelecidos ligados em conjunto para permitir a quantificação de HDL em sRNAs altamente pura por sequenciação de alto rendimento ou PCR em tempo real (Figura 1). Para demonstrar a viabilidade eo impacto deste protocolo, HDL foi purificada a partir de plasma humano pelo conjunto método DGUC e FPLC. As fracções recolhidas correspondentes a FPLC de HDL (colesterol) por distribuição foram concentradas e o ARN total foi isolado a partir.......
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Discussão
Este protocolo é concebido para quantificar miARNs e outros sRNAs por sequenciação de alto rendimento ou PCR em tempo real sobre o HDL altamente pura. Tal como acontece com qualquer abordagem, considerações especiais deve ser dada para cada passo no processo de purificação de HDL e de ARN e, em seguida quantificando sRNAs. Este protocolo é projetado para projetos começando com ≥ 2 mL de plasma. No entanto, análises de ARN de elevada qualidade pode com sucesso ser completado com HDL purificada a partir de tão pouco quant.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por prêmios do National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute para K.C.V. HL128996, HL113039 e HL116263. Este trabalho também foi apoiado por prêmios da American Heart Association para K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003 e R.M.A. POST25710170.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ultracentrífuga | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti | |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3x FPLC Superdex 200 Colunas de Aumento em Linha | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tampo de mesa centrífuga | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Centrífuga refrigerada | Eppendorf | 22629867 | 5417R (comprada através da USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| Ensaio de DNA de alta sensibilidade | Agilent | 5067-4626 | |
| Biblioteca de sequenciamento Kit de quantificação qPCR | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Termociclador | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Tubos de centrífuga ultra-claros | Beckman Coulter | 344059 | |
| Brometo de Potássio | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| Tubo cônico de 15 mL | Thermo Scientific | 339650 | |
| Filtros microcentrífugos 0.45 µ m | Millipore | ||
| 0.22 µ m | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Kits de isolamento de RNA total | Qiagen | 217004 | |
| Kit colormétrico de colesterol total | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| Filtro de centrifugação de corte de 10.000 m.w. | Amicon | UFC801024 | adquirido através |
| de tubos de tira de PCR | Millipore Axygen | PCR-0208-C | comprado através de Fisher |
| kit de microRNA RT | Life Technologies | 4366597 | Para 1000 reações |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | garrafa de 50 mL |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Tubo de diálise | Spectrum Labs | 132118 | adquirido através da Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
Referências
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
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Reimpressões e permissões
