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Summary

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

Abstract

A diversidade de pequenos RNAs não-codificantes (sRNA) está se expandindo rapidamente e seu papel nos processos biológicos, incluindo a regulação do gene, estão surgindo. Mais interessante, sRNAs também se encontram fora das células e são estavelmente presente em todos os fluidos biológicos. Como tal, sRNAs extracelular representam uma nova classe de biomarcadores da doença e estão provavelmente envolvidos em redes de comunicação intercelular de sinalização celular e. Para avaliar o seu potencial como biomarcadores, sRNAs podem ser quantificados no plasma, urina e outros fluidos. No entanto, para compreender totalmente o impacto de sRNAs extracelulares como sinais endócrinos, que é importante para determinar que os transportadores são transporte e protegendo-os em fluidos biológicos (por exemplo, plasma), que células e tecidos contribuem para piscinas srna extracelulares, e as células e os tecidos capazes de aceitar e utilizando extracelular sRNA. Para atingir essas metas, é fundamental para isolar populações altamente puras de portadores extracelularessRNA para perfilar e quantificação. Temos anteriormente demonstrado que as lipoproteínas, particularmente lipoproteínas de alta densidade (HDL), o transporte de microRNAs funcionais (miRNA) entre as células e HDL-miRNAs são significativamente alterados na doença. Aqui, nós detalhe um novo protocolo que utiliza conjunto de isolamento HDL com ultracentrifugação em gradiente de densidade (DGUC) and-fast-proteína cromatografia líquida (FPLC) para obter HDL elevado grau de pureza para perfilamento a jusante e quantificação de todos os sRNAs, incluindo miRNAs, usando tanto alta sequenciamento -throughput e em tempo real abordagens de PCR. Este protocolo será um recurso valioso para a investigação de sRNAs sobre HDL.

Introduction

Não codificantes pequenos RNAs extracelular (sRNAs) representam uma nova classe de marcadores de doença e potenciais alvos terapêuticos e provavelmente facilitar a comunicação ^uma célula-a-célula. O tipo mais amplamente estudado de sRNA são microRNAs (miRNA), que são cerca de 22 nts de comprimento e são processados de formas precursoras mais longos e transcritos primários ^2. miARNs foram demonstradas para o pós-transcricionalmente regular a expressão do gene através da supressão da tradução de proteínas e a indução do ARNm da degradação ^2. No entanto, os miRNAs são apenas um dos muitos tipos de sRNAs; como sRNAs pode ser clivada a partir tRNAs mãe (sRNAs derivados de tRNA, o TDR), RNAs pequenos nucleares (sRNAs sRNA derivados, sndRNA), pequenos RNAs nucleolares (sRNAs snoRNA derivados, snRNA), RNAs ribossomais (sRNAs, RDR rRNA derivado ), Y (RNAs yDR), e outros RNAs ¹ variado. Alguns exemplos destes novos sRNAs têm sido relatados para funcionar semelhante ao miARNs; No entanto, o fu biológicanctions de muitos destes sRNAs permanece a ser determinada, embora papéis na regulação do gene são provavelmente ^3-6. Mais interessante, miARNs e outros sRNAs são estavelmente presente nos fluidos extracelulares, incluindo a saliva, plasma, urina, e biliar. sRNAs extracelular são provavelmente protegido contra RNases através da sua associação com vesículas extracelulares (EV), lipoproteínas, e / ou complexos de ribonucleoproteína extracelulares.

Anteriormente, relatou que as lipoproteínas, ou seja, lipoproteínas de alta densidade (HDL), miRNAs de transporte no plasma ^7. Neste estudo, o HDL foram isoladas utilizando um método sequencial de ultracentrifugação em gradiente de densidade (DGUC), cromatografia líquida rápida de proteínas (filtração em gel A cromatografia de exclusão de tamanho, FPLC), e imunoprecipitação de cromatografia de afinidade (anti-apolipoproteína AI (apo AI) ) ^7. Utilizando ambas as matrizes de baixa densidade baseada em PCR em tempo real e ensaios de miARN individuais, níveis de miARN foram quantificados em HDL isolada a partir de curarthy e indivíduos com hipercolesterolemia ^7. Usando essa abordagem, fomos capazes de perfil miRNAs e quantificar miRNAs específicos em preparações de HDL altamente puros. Desde 2011, nós determinamos que, apesar de cromatografia de afinidade melhora a pureza HDL, saturação de anticorpo limita grandemente o rendimento, e pode ser um custo proibitivo. Actualmente, o protocolo recomenda um método conjunto sequencial de dois passos de DGUC seguido por FPLC, que também produz amostras de HDL elevado de qualidade para a jusante de isolamento de ARN e sRNA quantificação. Devido aos recentes avanços no sequenciamento de alto rendimento de sRNAs (sRNAseq), por exemplo, os miRNAs, eo aumento da consciência de outras classes não-miRNA Srna, sRNAseq é o atual estado-da-arte em miRNA e sRNA profiling. Como tal, o nosso protocolo recomenda quantificar miRNAs e outros sRNAs em amostras de HDL usando sRNAseq. No entanto, o ARN total isolado a partir de HDL também pode ser utilizado para quantificar miARNs individuais e outros sRNAs ou validar os resultados sRNAseq utilizando PCR em tempo real umpproaches. Aqui nós descrevemos em detalhe um protocolo para a recolha, purificação, quantificação, análise de dados e validação de alta pureza HDL-sRNAs.

O objetivo geral deste trabalho é demonstrar a viabilidade e processo de sRNA quantificação de HDL altamente pura isolada a partir de plasma humano.

Protocol

1. A purificação de HDL (~ 5,5 dias)

1. Gradiente de densidade de Ultracentrifugação (DGUC, ~ 5 dias)
   1. Adicionar 90 uL de 100x anti-oxidantes para 9 ml de plasma isolados a partir de sangue venoso fresco.
   2. Ajustar a densidade de plasma com KBr partir de 1,006 g / mL a 1,025 g / mL por adição de 0,251 g de KBr a 9 mL de plasma a partir do passo 1.1.1 (0,0278 g / ml de plasma de KBr). Balance o plasma até que todo o sal é dissolvido à temperatura ambiente e transferir para tubos de ultracentrífuga e assegurar que todas as bolhas subam para o topo.
   3. Dobre a ponta de uma agulha de 18 G a 90 ° 1 cm da ponta, o lado bisel voltado para cima. Usando uma seringa e a agulha de calibre 18, coloque cuidadosamente 3 mL de solução de sobreposição # 1 sobre o plasma (Tabela 1).
      NOTA: A agulha torta garante todo o VLDL / IDL, LDL e HDL são removidos sem se misturar com a sobreposição.
   4. Remover a maior parte das bolhas na parte superior, deixando 2 – espaço de 3 mm da menisco para a parte superior do tubo e carefully colocar os tubos em baldes SW-40Ti.
   5. Pesar cada balde (com as tampas) sobre o saldo, e exatamente equilibrar com o balde oposto (balde + cap): # 1 a # 4, # 2 e # 5 e # 3 a # 6.
      NOTA: Estes baldes deve ser equilibrado e combinados em todos os momentos.
   6. Coloque rotor em ultracentrífuga (Lista de Materiais). Centrifugar a 274.400 xg durante 24 h a 4 ° C com um freio intermédia # 4.
   7. Remova cuidadosamente baldes de rotor e os tubos de baldes.
   8. remover cuidadosamente 2 mL da camada de topo da sobreposição usando uma seringa e uma agulha dobrada. Esta será a fracção VLDL / IDL que pode ser armazenado a 4 ° C ou -80 ° C.
   9. Após a remoção da fração VLDL / IDL, recolher os restantes 7 mL de amostra (plasma) e colocá-lo em um tubo cônico de 15 mL. Perfazer o volume da amostra até a 9 ml com solução de sobreposição # 2 (Tabela 1).
   10. Ajustar a densidade da amostra de 1,025 g / mL a 1,080 g / ml com KBr usandocerca de 0,746 g de KBr na amostra 9 mL ou 0,0828 g / mL KBr da amostra. Agite suavemente a amostra até que todo o KBr é dissolvido (aproximadamente 20 min) e transferir para ultracentrífuga tubo, enquanto bolhas garantindo subir ao topo.
   11. Com seringa e agulha, coloque cuidadosamente 3 mL de solução de sobreposição # 3 sobre a amostra (Tabela 1). Deixar 2-3 mm de espaço menisco para o topo do tubo.
   12. Remover a maior parte de todas as bolhas restantes na parte superior do tubo e colocar os tubos de ultracentrífuga cuidadosamente cheios em baldes SW-40Ti.
   13. Pesar cada balde (com as tampas) sobre o saldo, e exatamente equilibrar com o balde oposto + cap, como em 1.1.5.
   14. Coloque rotor em ultracentrífuga (veja Lista de Materiais). Centrifugar a 274.400 xg durante 24 h a 4 ° C com um freio intermédia # 4.
   15. Remova cuidadosamente baldes de rotor e os tubos de baldes.
   16. remover cuidadosamente 2 mL da camada de topo da sobreposição usando uma seringa e seragulha nt. Esta será a fracção de LDL, que pode ser armazenado a 4 ° C ou -80 ° C.
   17. Após a remoção da fração LDL, recolher os restantes aproximados 7 ml de amostra (plasma) e colocá-lo em um novo tubo cônico de 15 mL. Perfazer o volume da amostra (plasma) até 9 mL com 1,080 g / mL de solução de # 4 (Tabela 1).
   18. Ajustar a densidade da amostra de 1,080 g / mL a 1,30 g / ml com KBr utilizando 3,33 g de KBr em 9 mL de amostra (plasma) ou 0,37 g de KBr para cada mL de amostra. Rocha ou ligeiramente agitar a amostra até que todo o KBr (sal) é dissolvida e transferir para ultracentrífuga tubo.
   19. Com seringa e agulha, coloque cuidadosamente 3 mL de solução de sobreposição # 5 sobre a amostra (Tabela 1).
   20. Remover a maior parte de todas as bolhas restantes na parte superior do tubo, deixando o ácido 2- espaço de 3 mm da menisco para a parte superior do tubo e colocar os tubos de ultracentrífuga cuidadosamente cheios em baldes SW-40Ti.
   21. Pesar cada balde (com as tampas) sobre o equilíbrio, e exatamente equilibrar com o balde oposto + cap, como em 1.1.5.
   22. Coloque rotor em ultracentrífuga (veja Lista de Materiais). Centrifugar a 274.400 xg durante 48 h a 4 ° C com um freio # 4.
   23. Remova cuidadosamente baldes de rotor e os tubos de baldes.
   24. Cuidadosamente remover cerca de 2 ml a partir da camada de topo da sobreposição usando uma seringa e uma agulha dobrada. Esta é a fracção HDL, o qual pode ser armazenado a 4 ° C ou -80 ° C.
       NOTA: Seguindo DGUC HDL pode ser dialisada para remover as soluções de alto teor salino.
   25. Para diálise, coloque a fração HDL recolhida em uma manga de diálise selado (10.000 MW de corte) e diálise durante a noite em 1 L 1x PBS. tampão mudança de diálise (1x PBS) 3 vezes ao longo de 24 h. perturbação suave do PBS com um agitar-barra magnética irá melhorar diálise.
   26. Determinar a concentração de proteína do DGUC-HDL usando um método BCA ^8.
2. Fast-Protein líquido Chrocromatografia em fase (FPLC) ou cromatografia de exclusão de tamanho (~ 6 h)
   1. Filtro de 1,2 mg de DGUC-HDL (proteína total) em 500 mL através de um filtro de 0,22 um micro-centrífuga (ver Lista de Materiais), imediatamente antes da injecção.
      NOTA: Uma filtragem adicional da amostra DGUC-HDL através de um filtro de 0,45 um micro-centrífuga antes do filtro de 0,22? M podem ser necessários para algumas amostras.
   2. Coletar a amostra DGUC-HDL filtrada, carregar a seringa de injeção FPLC (preenchimento), e garantir que não haja bolhas na seringa antes de injetar na FPLC.
   3. Definir a taxa de fluxo de FPLC de 0,3 mL / min com um limite de pressão de 2,6 MPa. Equilibrar as colunas com 0,2 volumes de coluna (aproximadamente 15 ml) de tampão, antes da amostra de injecção. Injectar a amostra com 3 ml de tampão para o (septo de injecção) instrumento FPLC e iniciar a execução. Recolha fracções de 1,5 mL para um total de 72 fracções.

2. alta taxa de transferência RNA pequenoSequenciamento (sRNAseq, ~ 9 dias)

1. Isolamento de ARN (~ 1 dia)
   1. Identificar as correspondentes fracções de FPLC de DGUC-HDL por meio da determinação dos níveis de colesterol total utilizando um kit colorimétrico de acordo com as instruções do fabricante. Usando este FPLC set-up, espera encontrar 6 – 7 fracções de FPLC contendo DGUC-HDL.
   2. Recolher todo o volume (cerca de 8 -1 0 mL piscina de 1,45 fração mL volumes) a partir de fracções DGUC-HDL FPLC e concentrar usando 10 kDa mw unidades de filtragem centrífuga de corte a 4.000 xg durante 1 h a 4 ° C ou até concentrado HDL é de aproximadamente 100 mL.
   3. Recolhe-se o concentrado de HDL e quantificar a concentração de proteína total de HDL utilizando o método BCA ^8.
   4. Determinar a concentração mais alta de proteína total de HDL, até 1 mg, que pode ser dividido em alíquotas de cada amostra no conjunto. Por exemplo, isolar o ARN a partir da mesma quantidade de proteína total de HDL para cada amostra.
   5. Isolamento de ARN utilizando executarum protocolo modificado (veja Lista de Materiais).
      1. Adicionar 10 x o volume de reagente fenol lise (veja Lista de Materiais) da amostra e vortex por 1 min.
      2. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
      3. Adicionar clorofórmio (20% de volume de reagente de lise de fenol utilizado no passo 2.1.5.1) e agitar vigorosamente durante 15 segundos.
      4. Incubar à temperatura ambiente durante 2-3 minutos.
      5. Centrifugar durante 15 minutos a 12000 xg, a 4 ° C numa centrífuga refrigerada.
      6. Transferir a fase aquosa superior para um novo tubo, evitando a interfase.
      7. Adicionar volume de 1,5 x de 100% de etanol à fase aquosa e agitar com vortex durante 1 min.
      8. Armazenar as amostras de, pelo menos, 1 hora ou durante a noite a -80 ° C.
      9. Continue com o protocolo de isolamento do RNA usando o mini-colunas fornecidas.
      10. Eluir com 30 H mL de RNase ₂ O. Em primeiro lugar, adicionar 15 mL de _H2O directamente para a frita, centrifugação a baixa velocidade (2000 xg) durante 2 min, eem seguida girar a alta velocidade (max) durante 1 min. Repetir esta etapa com um adicional de 15 mL de H ₂ O.
   6. proceder imediatamente a sRNA geração ou armazenamento de biblioteca a -80 ° C.
2. Geração de biblioteca (~ 6 h)
   1. Preparar bibliotecas de ADNc sRNA usando o protocolo do kit sRNA biblioteca geração, conforme as instruções do fabricante, com uma modificação para a amplificação por PCR, conforme detalhado abaixo.
      1. Prepara-se o mastermix PCR em gelo, contendo 0,5 mL de DNase / RNase H ₂ O, 15 ul mistura de PCR (LMP) e 1 uL Iniciador de PCR de ARN (RP1) por amostra (incluem um 10% adicional para a pipetagem de erro).
      2. Adicionar 16.5 ul de mistura de PCR a cada amostra (ADNc).
      3. Atribuir um número de índice / de código de barras de cada amostra para a multiplexação e adicionar 1 mL Índice de iniciador de PCR (com o número correspondente) à amostra.
      4. Executar uma rotação rápida usando o microcentrífuga.
         NOTA: O volume total deveagora ser de 30 mL por amostra.
      5. Efectuar as condições de ciclização para a amplificação por PCR como descrito nos quadros 2 e 3.
3. Tamanho Selecione sRNA Biblioteca remover do adaptador: Adaptadores (~ 1,5 h)
   1. Executar biblioteca de tamanho seleção usando seletor do tamanho do DNA automática de acordo com as instruções do fabricante com os parâmetros de tamanho seguintes: Alvo: 156 pb, de início: 135 pb, End: 177 pb, Bandeira Range: Broad.
4. DNA Clean Up (~ 0,5 h)
   1. Limpar tamanho seleccionado de cDNA sRNA de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Eluir limpo e concentrada cDNA sRNA com 2 x 7 mL DNase / RNase H ₂ O.
5. Quantificar e avaliar sRNA cDNA Biblioteca Rendimento e Qualidade (~ 1 h)
   1. Avaliar a qualidade biblioteca de cDNA sRNA e tamanho usando um chip de DNA de alta sensibilidade em um Bioanalyzer (Lista de Materiais) como por manufactinstruções do Urer.
   2. Quantificar as concentrações individuais biblioteca de ADNc sRNA utilizando um ensaio de ADN de alta sensibilidade (Lista de Materiais), de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: Recomenda-se a ter todas as amostras com índices diferentes ser executados na mesma pista da célula de fluxo, se possível. Se mais do que uma pista é necessário, misturar amostras de casos e de controlo de forma adequada.
6. De alto rendimento sRNA Sequencing (~ 7 dias)
   1. Piscina indivíduo indexados bibliotecas Srna baseado em concentrações equimolares.
   2. Tela reunidas bibliotecas Srna para a qualidade usando chip de DNA de alta sensibilidade no Bioanalyzer e determinar a concentração de DNA biblioteca como em 2.5.1 – 2.5.2.
   3. Executar PCR quantitativo (qPCR) do conteúdo adaptador para garantir profundidade sequência apropriada usando a biblioteca de sequenciamento kit qPCR quantificação de acordo com as instruções do fabricante (Lista de Materiais).
   4. Execute sequenciamento usando uma única leitura, 50 bp protocolo para atingir uma profundidade de cerca de 20 – 25 M leituras / amostra, de acordo com as instruções do fabricante.

3. Análise de Dados (~ 1 dia)

1. Use bcl2fastq2, conforme instruções guia do usuário, para arquivos raw fastq preprocess de amostras desmultiplexados (Lista de Materiais).
2. Use Cutadapt para cortar placas de ⁹ e remover lê <16 nucleótidos (nts) de comprimento, conforme instruções guia do usuário (Lista de Materiais).
3. Remover as sequências de contaminação presente nas bibliotecas Srna, incluindo sequência de solução de paragem (STP: CCACGTTCCCGTGG) e adaptador de carry-over (CTACAGTCCGACGATC) utilizando a função removeSequenceInFastq no quadro NGSPERL, conforme instruções guia do usuário (Lista de Materiais).
4. Execute métricas de controle de qualidade por FastQC usando Centro de Ciências quantitativas (CQS) ferramentas, como por instruções guia do usuário (Lista de Materiais).
5. Gerar lista não redundante de "idêntico" lê (redunda colapsont lê) e números de cópias registro usando CQSTools, conforme instruções guia do usuário (Lista de Materiais).
6. Alinhar lê a genoma humano usando Bowtie1.1.2 permitindo que 1 corresponde (opções: -a -m 100 –best –strata -v 1), conforme instruções guia do usuário (Lista de Materiais).
7. Execute ler alinhamento, contagem e resultar tarefas de compactação usando NGSPERL, conforme instruções Guia do Usuário.
8. Converter tabela de contagem exportado para um arquivo de planilha.
9. Normalize lê de uma classe específica (por exemplo, miRNAs) ao número total de leituras para essa classe (por exemplo, o número total de miRNAs lê) e sinais de relatório como Lê miRNA Per mapeada (RPMM). (Por exemplo, RPMM = (miR-X / Número total de miRNA lê) * 1.000.000).
10. Entrada normalizada tabela de contagem de como a tecnologia única cor genérico para software de baixo nível e diferencial de alto nível analisa como por instruções guia do usuário (Lista de Materiais).
    NOTA: Atualmente, existem genes de limpeza não bem caracterizados / SRNComo para o HDL-sRNA. Um controlo de pico-em podem ser usados, mas pode ser problemático. Normalizando para HDL entrada de proteína total ou volume é aconselhada. Mais importante ainda, é recomendado para validar os resultados de sequenciação de uma das várias estratégias para quantificar miARNs e sRNAs utilizando PCR em tempo real ou PCR quantitativo.

Representative Results

Discussion

Este protocolo é concebido para quantificar miARNs e outros sRNAs por sequenciação de alto rendimento ou PCR em tempo real sobre o HDL altamente pura. Tal como acontece com qualquer abordagem, considerações especiais deve ser dada para cada passo no processo de purificação de HDL e de ARN e, em seguida quantificando sRNAs. Este protocolo é projetado para projetos começando com ≥ 2 mL de plasma. No entanto, análises de ARN de elevada qualidade pode com sucesso ser completado com HDL purificada a partir de tão pouco quanto 80 ul de plasma humano ou de rato utilizando cromatografia de afinidade; no entanto, maiores volumes de plasma de partida produzir melhores dados usando os métodos apresentados aqui. métodos de processamento e extração de amostra podem alterar drasticamente a qualidade miRNA / sRNA e rendimento. O uso de anticoagulantes, embora essencial para a coleta de plasma, provavelmente afeta extracção a jusante. Por exemplo, a heparina não pode ser facilmente removido durante a extracção de ARN ^14,15, e pode inibir a jusante enzimas utilizadas em PCR ^16-18. Além disso, There são os relatórios que o citrato de sódio pode também interferir com as medições qPCR onde miRNAs a partir de amostras de EDTA são mostrados ter melhorado o perfil de expressão em comparação com amostras de citrato de sódio ^16,19,20. Estes estudos demonstram a necessidade de uma análise cuidadosa na escolha de um anticoagulante. Além disso, devido ao aumento do potencial para a lise celular durante a coagulação, as amostras de soro não são recomendados como miARNs celulares lisadas artificialmente podem associar com lipoproteínas. Da mesma forma, o plasma é imediatamente idealmente isolado a partir de sangue total para evitar a contaminação a partir de outras células do sangue periférico, incluindo leucócitos lisados. Como temperatura fria é amplamente conhecido para afectar a activação das plaquetas, as amostras de sangue total são fiadas longe de eritrócitos, leucócitos e plaquetas a 3000 xg durante 15 min à temperatura ambiente. A hemólise é também mal recomendado como eritrócitos rompidas foram relatados para influenciar também miARN ^21,22 resultado, uma vez que contêm miARNs que pode ser derramado durante hemolysis ^23,24. O plasma pode ser então armazenada a 4 ° C durante 2 – 4 semanas, ou, alternativamente, o plasma pode ser congelado a -80 ° C, em que o conteúdo de miARN é estável e viável tanto a curto prazo e armazenamento a longo prazo (máximo 4 anos) ^25. Para nosso conhecimento actual, congelando as amostras de plasma não está previsto para prejudicar HDL-miARNs e as amostras de plasma congeladas são adequados para analisar. Como lipoproteínas e outros componentes de sangue total pode ser afectada pela ingestão de alimentos, prefere-se a colheita de sangue em jejum.

Como mencionado acima, o HDL no plasma pode ser isolado através de uma série de métodos padrão, incluindo DGUC, FPLC e cromatografia de afinidade contra a apoA-I. . Isolamento de lipoproteínas do plasma por DGUC usando KBr, tal como descrito por Redgraves et al ^26, separa VLDL (d = 0,94-1,006 g / ml), colesterol LDL (d = 1,006-1,063 g / mL) e HDL (d = 1,063-1,21 g / ml) e é um método ideal para grandes volumes de plasma (2 – 60 ml por amostra). a limitaçãoa utilização desta abordagem é que por si só exossomas e outros miARN contendo VE são relatados para ter uma densidade semelhante à HDL e pode estar presente em HDL DGUC (Figura 2A). Outras desvantagens incluem a possibilidade de danos estruturais em proteínas de exposição de sal elevado em tampões e forças de ultracentrifugação forte, bem como as estabilidades diferenciais de HDL sub-classes ^27,28. Apesar disso, DGUC é comumente utilizado, uma vez que resulta em um rendimento elevado de proteína de HDL, produzindo cerca de 1 mg de proteína de HDL por 1 mL de plasma ^29. A abordagem de FPLC, que envolve a filtração em gel por exclusão de tamanho, requer menos tempo, dependendo da taxa de fluxo (aproximadamente 6 horas), e tem uma maior precisão de separação HDL de apoB-contendo lipoproteínas (por tamanho) e os seus sub-classes, incluindo os VE que são muito maiores do que a HDL, mas tem densidades semelhantes. Deve notar-se que utilizando os métodos descritos no presente protocolo, vesículas plasma entre cerca de 220-75 nm de diâmetro não fazereliciar uma assinatura lípido ou proteína detectável quando separada por FPLC. Dependendo do set-up, FPLC requer entrada relativamente pequena, 0,3-1 mL, o que é útil para o plasma de roedores e pequenas alíquotas congeladas. ensaios de colesterol colorimétricos rápidas também são importantes seguinte FPLC para confirmar a distribuição de HDL ou outras fracções de lipoproteínas. Fraccionamento dilui amostras e lipoproteínas; No entanto, as amostras podem ser, em seguida, concentrou-se utilizando filtros centrífugos size-padrão (por exemplo, de 10 kDa de PM de filtro). isolamento HDL por apoA I-IP utilizando colunas de spin micro são a mais rápida das três abordagens, mas são limitados pela baixa entrada (0,08-1 mL) de volume e baixo rendimento (aproximadamente 0,1 mg). Enquanto apoA-I IP pode ser trabalhoso, este método é ideal para sobrenadantes de cultura de células de baixo volume. Embora cada um desses métodos tem pontos fortes e fracos, estes podem ser reduzidos se forem utilizados em conjunto (por exemplo, DGUC seguido FPLC). Usando duas abordagens em conjunto, resulta em uma maior pureza deHDL para análise miRNA e sRNA.

Aqui, nós detalhado dos passos necessários para isolar HDL altamente puro, utilizando o método em tandem de DGUC seguido por FPLC e descrito os passos usados ​​para quantificar o HDL-miARNs e sRNAs utilizando quer sequenciação de alto rendimento ou PCR em tempo real. Embora este protocolo foi projetado para HDL, tem grande aplicabilidade na quantificação sRNAs em outras lipoproteínas, incluindo LDL e VLDL, com base em suas densidades e tamanhos.

Materials

Ultracentrifuge 	Beckman Coulter	A99839	Optima XPN-80
Ultracentrifuge Rotor	Beckman Coulter	331362	SW-41Ti
AKTA Pure FPLC System	GE Healthcare	29018224
3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line	GE Healthcare	28990944	10/300 gl
SynergyMx	BioTek Instruments	7191000
Tabletop centrifuge	Thermo Scientific	75004525	Sorvall ST40R
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	22629867	5417R (purchased through USA Scientific)
Microfuge 	USA Scientific	2631-0006
PippenPrep	Sage Science	PIP0001
2100 Bioanalyzer 	Agilent	G2938B
High Sensitivity DNA Assay	Agilent	5067-4626
Sequencing Library qPCR Quantification Kit	Illumina	SY-930-1010
ProFlex Thermal Cycler	Applied Biosystems	4484073
QuantStudio 12k Flex	Applied Biosystems	4471134
EpMotion Robot	Eppendorf	960000111	5070
Ultra-clear centrifuge tubes	Beckman Coulter	344059
Potassium Bromide	Fisher Chemicals	P205-500
15 mL conical tube	Thermo Scientific	339650
Micro-centrifugal filters 0.45 µm	Millipore	UFC30HV00
Micro-centrifugal filters 0.22 µm	Millipore	UFC30GV00
miRNAEasy Total RNA Isolation Kits	Qiagen	217004
Total Cholesterol colormetric kit	Cliniqa (Raichem)	R80035
10,000 m.w. cut-off centrifugation filter	Amicon	UFC801024	purchased through Millipore
PCR strip tubes	Axygen	PCR-0208-C	purchased through Fisher
microRNA RT kit	Life Technologies	4366597	For 1000 reactions
PCR master mix	Life Technologies	4440041	50 mL bottle
Pierce BCA kit	Thermo Scientific	23225
Clean and Concentrator Kit	Zymo	D4014
Dialysis tubing	Spectrum Labs	132118	purchased through Fisher
bcl2fastq2	Illumina	n/a	Software
Cutadapt	https://github.com/marcelm/cutadapt	n/a	Software
NGSPERL	github.com/shengqh/ngsperl	n/a	Software
CQSTools	github.com/shengqh/CQS.Tools	n/a	Software
Bowtie 1.1.2 	http://bowtie-bio.sourceforge.net	n/a	Software
GeneSpringGX13.1.1	Agilent	n/a	Software