Artigo de método

O isolamento de lipoproteínas de alta densidade para não codificante pequeno ARN Quantificação

DOI:

10.3791/54488

⸱

28 de novembro de 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Center for Quantitative Sciences, Vanderbilt University School of Medicine, 3Department of Cancer Biology, Vanderbilt University School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve o isolamento e quantificação de pequenos RNAs de lipoproteína de alta densidade.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A diversidade de pequenos RNAs não-codificantes (sRNA) está se expandindo rapidamente e seu papel nos processos biológicos, incluindo a regulação do gene, estão surgindo. Mais interessante, sRNAs também se encontram fora das células e são estavelmente presente em todos os fluidos biológicos. Como tal, sRNAs extracelular representam uma nova classe de biomarcadores da doença e estão provavelmente envolvidos em redes de comunicação intercelular de sinalização celular e. Para avaliar o seu potencial como biomarcadores, sRNAs podem ser quantificados no plasma, urina e outros fluidos. No entanto, para compreender totalmente o impacto de sRNAs extracelulares como sinais endócrinos, que é importante para determinar que os transportadores são transporte e protegendo-os em fluidos biológicos (por exemplo, plasma), que células e tecidos contribuem para piscinas srna extracelulares, e as células e os tecidos capazes de aceitar e utilizando extracelular sRNA. Para atingir essas metas, é fundamental para isolar populações altamente puras de portadores extracelularessRNA para perfilar e quantificação. Temos anteriormente demonstrado que as lipoproteínas, particularmente lipoproteínas de alta densidade (HDL), o transporte de microRNAs funcionais (miRNA) entre as células e HDL-miRNAs são significativamente alterados na doença. Aqui, nós detalhe um novo protocolo que utiliza conjunto de isolamento HDL com ultracentrifugação em gradiente de densidade (DGUC) and-fast-proteína cromatografia líquida (FPLC) para obter HDL elevado grau de pureza para perfilamento a jusante e quantificação de todos os sRNAs, incluindo miRNAs, usando tanto alta sequenciamento -throughput e em tempo real abordagens de PCR. Este protocolo será um recurso valioso para a investigação de sRNAs sobre HDL.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Não codificantes pequenos RNAs extracelular (sRNAs) representam uma nova classe de marcadores de doença e potenciais alvos terapêuticos e provavelmente facilitar a comunicação uma célula-a-célula. O tipo mais amplamente estudado de sRNA são microRNAs (miRNA), que são cerca de 22 nts de comprimento e são processados de formas precursoras mais longos e transcritos primários 2. miARNs foram demonstradas para o pós-transcricionalmente regular a expressão do gene através da supressão da tradução de proteínas e a indução do ARNm da degradação 2. No entanto, os miRNAs são apenas um dos muitos tipos de sRNAs; como sRNAs pode ser clivada a partir tRNAs mãe (sRNAs derivados de tRNA, o TDR), RNAs pequenos nucleares (sRNAs sRNA derivados, sndRNA), pequenos RNAs nucleolares (sRNAs snoRNA derivados, snRNA), RNAs ribossomais (sRNAs, RDR rRNA derivado ), Y (RNAs yDR), e outros RNAs 1 variado. Alguns exemplos destes novos sRNAs têm sido relatados para funcionar semelhante ao miARNs; No entanto, o fu biológicanctions de muitos destes sRNAs permanece a ser determinada, embora papéis na regulação do gene são provavelmente 3-6. Mais interessante, miARNs e outros sRNAs são estavelmente presente nos fluidos extracelulares, incluindo a saliva, plasma, urina, e biliar. sRNAs extracelular são provavelmente protegido contra RNases através da sua associação com vesículas extracelulares (EV), lipoproteínas, e / ou complexos de ribonucleoproteína extracelulares.

Anteriormente, relatou que as lipoproteínas, ou seja, lipoproteínas de alta densidade (HDL), miRNAs de transporte no plasma 7. Neste estudo, o HDL foram isoladas utilizando um método sequencial de ultracentrifugação em gradiente de densidade (DGUC), cromatografia líquida rápida de proteínas (filtração em gel A cromatografia de exclusão de tamanho, FPLC), e imunoprecipitação de cromatografia de afinidade (anti-apolipoproteína AI (apo AI) ) 7. Utilizando ambas as matrizes de baixa densidade baseada em PCR em tempo real e ensaios de miARN individuais, níveis de miARN foram quantificados em HDL isolada a partir de curarthy e indivíduos com hipercolesterolemia 7. Usando essa abordagem, fomos capazes de perfil miRNAs e quantificar miRNAs específicos em preparações de HDL altamente puros. Desde 2011, nós determinamos que, apesar de cromatografia de afinidade melhora a pureza HDL, saturação de anticorpo limita grandemente o rendimento, e pode ser um custo proibitivo. Actualmente, o protocolo recomenda um método conjunto sequencial de dois passos de DGUC seguido por FPLC, que também produz amostras de HDL elevado de qualidade para a jusante de isolamento de ARN e sRNA quantificação. Devido aos recentes avanços no sequenciamento de alto rendimento de sRNAs (sRNAseq), por exemplo, os miRNAs, eo aumento da consciência de outras classes não-miRNA Srna, sRNAseq é o atual estado-da-arte em miRNA e sRNA profiling. Como tal, o nosso protocolo recomenda quantificar miRNAs e outros sRNAs em amostras de HDL usando sRNAseq. No entanto, o ARN total isolado a partir de HDL também pode ser utilizado para quantificar miARNs individuais e outros sRNAs ou validar os resultados sRNAseq utilizando PCR em tempo real umpproaches. Aqui nós descrevemos em detalhe um protocolo para a recolha, purificação, quantificação, análise de dados e validação de alta pureza HDL-sRNAs.

O objetivo geral deste trabalho é demonstrar a viabilidade e processo de sRNA quantificação de HDL altamente pura isolada a partir de plasma humano.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. A purificação de HDL (~ 5,5 dias)

  1. Gradiente de densidade de Ultracentrifugação (DGUC, ~ 5 dias)
    1. Adicionar 90 uL de 100x anti-oxidantes para 9 ml de plasma isolados a partir de sangue venoso fresco.
    2. Ajustar a densidade de plasma com KBr partir de 1,006 g / mL a 1,025 g / mL por adição de 0,251 g de KBr a 9 mL de plasma a partir do passo 1.1.1 (0,0278 g / ml de plasma de KBr). Balance o plasma até que todo o sal é dissolvido à temperatura ambiente e transferir para tubos de ultracentrífuga e assegurar que todas as bolhas subam para o topo.
    3. Dobre a ponta de uma agulha de 18 G a 90 ° 1 cm da ponta, o lado bisel voltado para cima. Usando uma seringa e a agulha de calibre 18, coloque cuidadosamente 3 mL de solução de sobreposição # 1 sobre o plasma (Tabela 1).
      NOTA: A agulha torta garante todo o VLDL / IDL, LDL e HDL são removidos sem se misturar com a sobreposição.
    4. Remover a maior parte das bolhas na parte superior, deixando 2 - espaço de 3 mm da menisco para a parte superior do tubo e carefully colocar os tubos em baldes SW-40Ti.
    5. Pesar cada balde (com as tampas) sobre o saldo, e exatamente equilibrar com o balde oposto (balde + cap): # 1 a # 4, # 2 e # 5 e # 3 a # 6.
      NOTA: Estes baldes deve ser equilibrado e combinados em todos os momentos.
    6. Coloque rotor em ultracentrífuga (Lista de Materiais). Centrifugar a 274.400 xg durante 24 h a 4 ° C com um freio intermédia # 4.
    7. Remova cuidadosamente baldes de rotor e os tubos de baldes.
    8. remover cuidadosamente 2 mL da camada de topo da sobreposição usando uma seringa e uma agulha dobrada. Esta será a fracção VLDL / IDL que pode ser armazenado a 4 ° C ou -80 ° C.
    9. Após a remoção da fração VLDL / IDL, recolher os restantes 7 mL de amostra (plasma) e colocá-lo em um tubo cônico de 15 mL. Perfazer o volume da amostra até a 9 ml com solução de sobreposição # 2 (Tabela 1).
    10. Ajustar a densidade da amostra de 1,025 g / mL a 1,080 g / ml com KBr usandocerca de 0,746 g de KBr na amostra 9 mL ou 0,0828 g / mL KBr da amostra. Agite suavemente a amostra até que todo o KBr é dissolvido (aproximadamente 20 min) e transferir para ultracentrífuga tubo, enquanto bolhas garantindo subir ao topo.
    11. Com seringa e agulha, coloque cuidadosamente 3 mL de solução de sobreposição # 3 sobre a amostra (Tabela 1). Deixar 2-3 mm de espaço menisco para o topo do tubo.
    12. Remover a maior parte de todas as bolhas restantes na parte superior do tubo e colocar os tubos de ultracentrífuga cuidadosamente cheios em baldes SW-40Ti.
    13. Pesar cada balde (com as tampas) sobre o saldo, e exatamente equilibrar com o balde oposto + cap, como em 1.1.5.
    14. Coloque rotor em ultracentrífuga (veja Lista de Materiais). Centrifugar a 274.400 xg durante 24 h a 4 ° C com um freio intermédia # 4.
    15. Remova cuidadosamente baldes de rotor e os tubos de baldes.
    16. remover cuidadosamente 2 mL da camada de topo da sobreposição usando uma seringa e seragulha nt. Esta será a fracção de LDL, que pode ser armazenado a 4 ° C ou -80 ° C.
    17. Após a remoção da fração LDL, recolher os restantes aproximados 7 ml de amostra (plasma) e colocá-lo em um novo tubo cônico de 15 mL. Perfazer o volume da amostra (plasma) até 9 mL com 1,080 g / mL de solução de # 4 (Tabela 1).
    18. Ajustar a densidade da amostra de 1,080 g / mL a 1,30 g / ml com KBr utilizando 3,33 g de KBr em 9 mL de amostra (plasma) ou 0,37 g de KBr para cada mL de amostra. Rocha ou ligeiramente agitar a amostra até que todo o KBr (sal) é dissolvida e transferir para ultracentrífuga tubo.
    19. Com seringa e agulha, coloque cuidadosamente 3 mL de solução de sobreposição # 5 sobre a amostra (Tabela 1).
    20. Remover a maior parte de todas as bolhas restantes na parte superior do tubo, deixando o ácido 2- espaço de 3 mm da menisco para a parte superior do tubo e colocar os tubos de ultracentrífuga cuidadosamente cheios em baldes SW-40Ti.
    21. Pesar cada balde (com as tampas) sobre o equilíbrio, e exatamente equilibrar com o balde oposto + cap, como em 1.1.5.
    22. Coloque rotor em ultracentrífuga (veja Lista de Materiais). Centrifugar a 274.400 xg durante 48 h a 4 ° C com um freio # 4.
    23. Remova cuidadosamente baldes de rotor e os tubos de baldes.
    24. Cuidadosamente remover cerca de 2 ml a partir da camada de topo da sobreposição usando uma seringa e uma agulha dobrada. Esta é a fracção HDL, o qual pode ser armazenado a 4 ° C ou -80 ° C.
      NOTA: Seguindo DGUC HDL pode ser dialisada para remover as soluções de alto teor salino.
    25. Para diálise, coloque a fração HDL recolhida em uma manga de diálise selado (10.000 MW de corte) e diálise durante a noite em 1 L 1x PBS. tampão mudança de diálise (1x PBS) 3 vezes ao longo de 24 h. perturbação suave do PBS com um agitar-barra magnética irá melhorar diálise.
    26. Determinar a concentração de proteína do DGUC-HDL usando um método BCA 8.
  2. Fast-Protein líquido Chrocromatografia em fase (FPLC) ou cromatografia de exclusão de tamanho (~ 6 h)
    1. Filtro de 1,2 mg de DGUC-HDL (proteína total) em 500 mL através de um filtro de 0,22 um micro-centrífuga (ver Lista de Materiais), imediatamente antes da injecção.
      NOTA: Uma filtragem adicional da amostra DGUC-HDL através de um filtro de 0,45 um micro-centrífuga antes do filtro de 0,22? M podem ser necessários para algumas amostras.
    2. Coletar a amostra DGUC-HDL filtrada, carregar a seringa de injeção FPLC (preenchimento), e garantir que não haja bolhas na seringa antes de injetar na FPLC.
    3. Definir a taxa de fluxo de FPLC de 0,3 mL / min com um limite de pressão de 2,6 MPa. Equilibrar as colunas com 0,2 volumes de coluna (aproximadamente 15 ml) de tampão, antes da amostra de injecção. Injectar a amostra com 3 ml de tampão para o (septo de injecção) instrumento FPLC e iniciar a execução. Recolha fracções de 1,5 mL para um total de 72 fracções.

2. alta taxa de transferência RNA pequenoSequenciamento (sRNAseq, ~ 9 dias)

  1. Isolamento de ARN (~ 1 dia)
    1. Identificar as correspondentes fracções de FPLC de DGUC-HDL por meio da determinação dos níveis de colesterol total utilizando um kit colorimétrico de acordo com as instruções do fabricante. Usando este FPLC set-up, espera encontrar 6 - 7 fracções de FPLC contendo DGUC-HDL.
    2. Recolher todo o volume (cerca de 8 -1 0 mL piscina de 1,45 fração mL volumes) a partir de fracções DGUC-HDL FPLC e concentrar usando 10 kDa mw unidades de filtragem centrífuga de corte a 4.000 xg durante 1 h a 4 ° C ou até concentrado HDL é de aproximadamente 100 mL.
    3. Recolhe-se o concentrado de HDL e quantificar a concentração de proteína total de HDL utilizando o método BCA 8.
    4. Determinar a concentração mais alta de proteína total de HDL, até 1 mg, que pode ser dividido em alíquotas de cada amostra no conjunto. Por exemplo, isolar o ARN a partir da mesma quantidade de proteína total de HDL para cada amostra.
    5. Isolamento de ARN utilizando executarum protocolo modificado (veja Lista de Materiais).
      1. Adicionar 10 x o volume de reagente fenol lise (veja Lista de Materiais) da amostra e vortex por 1 min.
      2. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
      3. Adicionar clorofórmio (20% de volume de reagente de lise de fenol utilizado no passo 2.1.5.1) e agitar vigorosamente durante 15 segundos.
      4. Incubar à temperatura ambiente durante 2-3 minutos.
      5. Centrifugar durante 15 minutos a 12000 xg, a 4 ° C numa centrífuga refrigerada.
      6. Transferir a fase aquosa superior para um novo tubo, evitando a interfase.
      7. Adicionar volume de 1,5 x de 100% de etanol à fase aquosa e agitar com vortex durante 1 min.
      8. Armazenar as amostras de, pelo menos, 1 hora ou durante a noite a -80 ° C.
      9. Continue com o protocolo de isolamento do RNA usando o mini-colunas fornecidas.
      10. Eluir com 30 H mL de RNase 2 O. Em primeiro lugar, adicionar 15 mL de H2O directamente para a frita, centrifugação a baixa velocidade (2000 xg) durante 2 min, eem seguida girar a alta velocidade (max) durante 1 min. Repetir esta etapa com um adicional de 15 mL de H 2 O.
    6. proceder imediatamente a sRNA geração ou armazenamento de biblioteca a -80 ° C.
  2. Geração de biblioteca (~ 6 h)
    1. Preparar bibliotecas de ADNc sRNA usando o protocolo do kit sRNA biblioteca geração, conforme as instruções do fabricante, com uma modificação para a amplificação por PCR, conforme detalhado abaixo.
      1. Prepara-se o mastermix PCR em gelo, contendo 0,5 mL de DNase / RNase H 2 O, 15 ul mistura de PCR (LMP) e 1 uL Iniciador de PCR de ARN (RP1) por amostra (incluem um 10% adicional para a pipetagem de erro).
      2. Adicionar 16.5 ul de mistura de PCR a cada amostra (ADNc).
      3. Atribuir um número de índice / de código de barras de cada amostra para a multiplexação e adicionar 1 mL Índice de iniciador de PCR (com o número correspondente) à amostra.
      4. Executar uma rotação rápida usando o microcentrífuga.
        NOTA: O volume total deveagora ser de 30 mL por amostra.
      5. Efectuar as condições de ciclização para a amplificação por PCR como descrito nos quadros 2 e 3.
  3. Tamanho Selecione sRNA Biblioteca remover do adaptador: Adaptadores (~ 1,5 h)
    1. Executar biblioteca de tamanho seleção usando seletor do tamanho do DNA automática de acordo com as instruções do fabricante com os parâmetros de tamanho seguintes: Alvo: 156 pb, de início: 135 pb, End: 177 pb, Bandeira Range: Broad.
  4. DNA Clean Up (~ 0,5 h)
    1. Limpar tamanho seleccionado de cDNA sRNA de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Eluir limpo e concentrada cDNA sRNA com 2 x 7 mL DNase / RNase H 2 O.
  5. Quantificar e avaliar sRNA cDNA Biblioteca Rendimento e Qualidade (~ 1 h)
    1. Avaliar a qualidade biblioteca de cDNA sRNA e tamanho usando um chip de DNA de alta sensibilidade em um Bioanalyzer (Lista de Materiais) como por manufactinstruções do Urer.
    2. Quantificar as concentrações individuais biblioteca de ADNc sRNA utilizando um ensaio de ADN de alta sensibilidade (Lista de Materiais), de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: Recomenda-se a ter todas as amostras com índices diferentes ser executados na mesma pista da célula de fluxo, se possível. Se mais do que uma pista é necessário, misturar amostras de casos e de controlo de forma adequada.
  6. De alto rendimento sRNA Sequencing (~ 7 dias)
    1. Piscina indivíduo indexados bibliotecas Srna baseado em concentrações equimolares.
    2. Tela reunidas bibliotecas Srna para a qualidade usando chip de DNA de alta sensibilidade no Bioanalyzer e determinar a concentração de DNA biblioteca como em 2.5.1 - 2.5.2.
    3. Executar PCR quantitativo (qPCR) do conteúdo adaptador para garantir profundidade sequência apropriada usando a biblioteca de sequenciamento kit qPCR quantificação de acordo com as instruções do fabricante (Lista de Materiais).
    4. Execute sequenciamento usando uma única leitura, 50 bp protocolo para atingir uma profundidade de cerca de 20 - 25 M leituras / amostra, de acordo com as instruções do fabricante.

3. Análise de Dados (~ 1 dia)

  1. Use bcl2fastq2, conforme instruções guia do usuário, para arquivos raw fastq preprocess de amostras desmultiplexados (Lista de Materiais).
  2. Use Cutadapt para cortar placas de 9 e remover lê <16 nucleótidos (nts) de comprimento, conforme instruções guia do usuário (Lista de Materiais).
  3. Remover as sequências de contaminação presente nas bibliotecas Srna, incluindo sequência de solução de paragem (STP: CCACGTTCCCGTGG) e adaptador de carry-over (CTACAGTCCGACGATC) utilizando a função removeSequenceInFastq no quadro NGSPERL, conforme instruções guia do usuário (Lista de Materiais).
  4. Execute métricas de controle de qualidade por FastQC usando Centro de Ciências quantitativas (CQS) ferramentas, como por instruções guia do usuário (Lista de Materiais).
  5. Gerar lista não redundante de "idêntico" lê (redunda colapsont lê) e números de cópias registro usando CQSTools, conforme instruções guia do usuário (Lista de Materiais).
  6. Alinhar lê a genoma humano usando Bowtie1.1.2 permitindo que 1 corresponde (opções: -a -m 100 --best --strata -v 1), conforme instruções guia do usuário (Lista de Materiais).
  7. Execute ler alinhamento, contagem e resultar tarefas de compactação usando NGSPERL, conforme instruções Guia do Usuário.
  8. Converter tabela de contagem exportado para um arquivo de planilha.
  9. Normalize lê de uma classe específica (por exemplo, miRNAs) ao número total de leituras para essa classe (por exemplo, o número total de miRNAs lê) e sinais de relatório como Lê miRNA Per mapeada (RPMM). (Por exemplo, RPMM = (miR-X / Número total de miRNA lê) * 1.000.000).
  10. Entrada normalizada tabela de contagem de como a tecnologia única cor genérico para software de baixo nível e diferencial de alto nível analisa como por instruções guia do usuário (Lista de Materiais).
    NOTA: Atualmente, existem genes de limpeza não bem caracterizados / SRNComo para o HDL-sRNA. Um controlo de pico-em podem ser usados, mas pode ser problemático. Normalizando para HDL entrada de proteína total ou volume é aconselhada. Mais importante ainda, é recomendado para validar os resultados de sequenciação de uma das várias estratégias para quantificar miARNs e sRNAs utilizando PCR em tempo real ou PCR quantitativo.

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Resultados

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Este protocolo é uma série de métodos estabelecidos ligados em conjunto para permitir a quantificação de HDL em sRNAs altamente pura por sequenciação de alto rendimento ou PCR em tempo real (Figura 1). Para demonstrar a viabilidade eo impacto deste protocolo, HDL foi purificada a partir de plasma humano pelo conjunto método DGUC e FPLC. As fracções recolhidas correspondentes a FPLC de HDL (colesterol) por distribuição foram concentradas e o ARN total foi isolado a partir...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo é concebido para quantificar miARNs e outros sRNAs por sequenciação de alto rendimento ou PCR em tempo real sobre o HDL altamente pura. Tal como acontece com qualquer abordagem, considerações especiais deve ser dada para cada passo no processo de purificação de HDL e de ARN e, em seguida quantificando sRNAs. Este protocolo é projetado para projetos começando com ≥ 2 mL de plasma. No entanto, análises de ARN de elevada qualidade pode com sucesso ser completado com HDL purificada a partir de tão pouco quant...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado por prêmios do National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute para K.C.V. HL128996, HL113039 e HL116263. Este trabalho também foi apoiado por prêmios da American Heart Association para K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003 e R.M.A. POST25710170.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
UltracentrífugaBeckman CoulterA99839Optima XPN-80
Beckman Coulter331362SW-41Ti
AKTA Pure FPLC SystemGE Healthcare29018224
3x FPLC Superdex 200 Colunas de Aumento em LinhaGE Healthcare2899094410/300 gl
SynergyMxBioTek Instruments7191000
Tampo de mesa centrífugaThermo Scientific75004525Sorvall ST40R
Centrífuga refrigeradaEppendorf226298675417R (comprada através da USA Scientific)
Microfuge USA Scientific2631-0006
PippenPrepSage SciencePIP0001
2100 Bioanalyzer AgilentG2938B
Ensaio de DNA de alta sensibilidadeAgilent5067-4626
Biblioteca de sequenciamento Kit de quantificação qPCRIlluminaSY-930-1010
ProFlex TermocicladorApplied Biosystems4484073
QuantStudio 12k FlexApplied Biosystems4471134
EpMotion RobotEppendorf9600001115070
Tubos de centrífuga ultra-clarosBeckman Coulter344059
Brometo de PotássioFisher ChemicalsP205-500
Tubo cônico de 15 mLThermo Scientific339650
Filtros microcentrífugos 0.45 µ mMillipore
0.22 µ mMilliporeUFC30GV00
miRNAEasy Kits de isolamento de RNA totalQiagen217004
Kit colormétrico de colesterol totalCliniqa (Raichem)R80035
Filtro de centrifugação de corte de 10.000 m.w.AmiconUFC801024adquirido através
de tubos de tira de PCRMillipore AxygenPCR-0208-Ccomprado através de Fisher
kit de microRNA RTLife Technologies4366597Para 1000 reações
PCR master mixLife Technologies4440041garrafa de 50 mL
Pierce BCA kitThermo Scientific23225
Clean and Concentrator KitZymoD4014
Tubo de diáliseSpectrum Labs132118adquirido através da Fisher
bcl2fastq2Illuminan/aSoftware
Cutadapthttps://github.com/marcelm/cutadaptn/aSoftware
NGSPERLgithub.com/shengqh/ngsperln/aSoftware
CQSToolsgithub.com/shengqh/CQS.Toolsn/aSoftware
Bowtie 1.1.2 http://bowtie-bio.sourceforge.netn/aSoftware
GeneSpringGX13.1.1Agilentn/aSoftware
Rotor de Ultracentrífuga Filtros microcentrífugos UFC30HV00

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
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