Método para a identificação de molécula pequena inibidores da interacção proteína-proteína entre HCN1 e TRIP8b

Ye Han; Kyle A. Lyman; Matt Clutter; Gary E. Schiltz; Quratul-Ain Ismail; Xiangying Cheng; Chi-Hao Luan; Dane M. Chetkovich

doi:10.3791/54540

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Artigo de método

Método para a identificação de molécula pequena inibidores da interacção proteína-proteína entre HCN1 e TRIP8b

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DOI:

10.3791/54540

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11 de novembro de 2016

Ye Han^*¹ , Kyle A. Lyman^*¹ , Matt Clutter² , Gary E. Schiltz³ , Quratul-Ain Ismail¹ , Xiangying Cheng¹ , Chi-Hao Luan⁴ , Dane M. Chetkovich¹^,⁵

¹Davee Department of Neurology and Clinical Neurosciences, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, ²Center for Molecular Innovation and Drug Discovery, Northwestern University, ³Department of Pharmacology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, ⁴High Throughput Analysis Laboratory, Department of Molecular Biosciences, Northwestern University, ⁵Department of Physiology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A interacção entre os canais HCN e a sua sub-unidade auxiliar tem sido identificada como um alvo terapêutico em Perturbação Depressiva Major. Aqui, um método baseado em polarização de fluorescência para identificar pequenas moléculas inibidoras desta interacção proteína-proteína, é apresentada.

Resumo

canais fechado nucleótidos cíclicos activada por hiperpolarização (HCN) são expressas ubiquamente em todo o cérebro, onde funcionam para regular a excitabilidade de neurónios. A distribuição sub-celular de estes canais em neurónios piramidais CA1 do hipocampo de área é regulada por tetratricopeptide proteína contendo repetição Rab8b interagindo (TRIP8b), uma sub-unidade auxiliar. nocaute genética de HCN formador de poros, subunidades ou TRIP8b, ambas conduzem a um aumento no comportamento do tipo antidepressivo, sugerindo que a limitação da função dos canais HCN pode ser útil como um tratamento para o transtorno depressivo maior (MDD). Apesar do interesse terapêutico significativo, os canais HCN também são expressos no coração, onde regulam ritmicidade. Para contornar problemas fora do alvo associados com bloqueio dos canais HCN cardíacos, nosso laboratório propôs recentemente visando a interação proteína-proteína entre HCN e TRIP8b, a fim de interromper especificamente função do canal HCN no cérebro.TRIP8b se liga a HCN poros formando subunidades em dois sítios de interação distintas, embora aqui o foco é sobre a interação entre o tetratricopeptide repeat (TPR) domínios de TRIP8b e a cauda do terminal C do HCN1. Neste protocolo, uma descrição expandida de um método para purificar TRIP8b e a execução de uma tela de alto rendimento para identificar inibidores de pequenas moléculas da interacção entre o HCN e TRIP8b, é descrito. O método de rastreio de elevado rendimento utiliza uma polarização de fluorescência (FP) à base de ensaio para monitorar a ligação de um fragmento grande TRIP8b para um onze marcado com fluoróforo amino ácido péptido correspondente à cauda do terminal HCN1 C. Este método permite que compostos "hit" a ser identificado com base na alteração na polarização de luz emitida. Os ensaios de validação são então realizadas para garantir que 'hit' compostos não são artificial.

Introdução

Canais fechado nucleótidos cíclicos activada por hiperpolarização (HCN) são expressos no coração e no sistema nervoso central, onde eles desempenham um papel importante na regulação da excitabilidade da membrana ^1. Canais HCN têm sido implicados na patogênese de Transtorno Depressivo Maior (MDD) ^2, o que levou vários grupos a propor que a limitação HCN função de canal farmacologicamente pode ser eficaz como um novo tratamento para MDD ^3. No entanto, visando directamente os canais HCN não é viável devido ao seu papel importante no potencial de ação cardíaco ^4. A ivabradina, a única FDA aprovou antagonista do canal de HCN, é ....