Artigo de método

A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon

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DOI:

10.3791/54598

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28 de fevereiro de 2017

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1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

Neste artigo

Resumo

Neste estudo, geramos células-tronco pluripotentes induzidas a partir de células de líquido amniótico de camundongo, usando um sistema de transposon baseado em não vírus.

Resumo

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) são geradas a partir de células somáticas de camundongos e humanos por expressão forçada de fatores de transcrição definidos usando diferentes métodos. Aqui, produzimos células iPS a partir de células de líquido amniótico de camundongo, usando um sistema de transposon baseado em não vírus. Todas as linhagens celulares iPS obtidas exibiram características de células pluripotentes, incluindo a capacidade de se diferenciar em direção a derivados de todas as três camadas germinativas in vitro e in vivo. Essa estratégia abre a possibilidade de usar células de fetos doentes para desenvolver novas terapias para defeitos congênitos.

Introdução

Diagnóstico pré-natal é uma importante ferramenta clínica para avaliar doenças genéticas (ou seja, aberrações cromossômicas, doenças monogenéticos ou poligenéticos / multifactorial) e malformações congênitas (hérnia diafragmática congênita ou seja, lesões pulmonares císticas, onfalocele, gastrosquise). As células do líquido amniótico (AF) são simples de se obter a partir de procedimentos de rotina programadas durante o segundo trimestre de gravidez (ou seja, a amniocentese e amnioreduction) ou cesarianas 1, 2. A disponibilidade de células pré-natais de FA a partir de pacientes ou de neonatais proporciona a possibilidade de utilizar esta fonte para a medicina regenerativa, e vários investigadores investigaram a possibilidade de tratar diferentes doenças ou danos de tecidos utilizando uma população de células estaminais isolado a partir de AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. A possibilidade de obter facilmente células AF de pacientes doentes, em uma janela de tempo em que a doença é muitas vezes parado, abre o caminho para a idéia de usar esta fonte de células para fins de reprogramação. Na verdade,-tronco pluripotentes induzidas (iPS células) derivadas de células AF poderia ser diferenciadas em células de interesse para testes in vitro de droga ou de abordagens de engenharia de tecidos, a fim de preparar uma terapia adequada e específica no paciente antes do parto. Muitos estudos já demonstraram a capacidade das células AF de ser reprogramado e diferenciadas em uma ampla gama de tipos de células 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

Desde a descoberta por Takahashi e Yamanaka 28 de células somáticas reprogramadas através da expressão forçada de quatro fatores de transcrição (Oct4, Sox2, cMyc e KLF4), os progressos têm sido feitos no campo da reprogramação. Considerando os diferentes métodos, pode-se distinguir entre as abordagens virais e não virais. A primeira espera que o uso de vectores virais (retrovírus e lentivírus), que têm alta eficiência, mas geralmente incompleta silenciamento do transgene retroviral, tanto com a consequência de uma linha de células parcialmente reprogramados e o risco deinserção mutagênese 29, 30, 31. O método não-viral utiliza diferentes estratégias: isto é, plasmídeos, vectores, ARNm, proteína, transposões. A derivação de células iPS livres de sequências transgênicas visa contornar os efeitos potencialmente prejudiciais de expressão do transgene gotejante e mutagénese de inserção. Entre todos os mencionados estratégias não-virais acima, a piggyBac (PB) sistema de transposão / transposase requer apenas as repetições terminais invertidas flanqueiam um transgene e a expressão transiente da enzima transposase para catalisar a inserção ou excisão eventos 32. A vantagem na utilização de transposões sobre outros métodos para a geração de células IPS é a possibilidade de obtenção de células iPS livre do vector com uma abordagem de vector não virai, que mostra a mesma eficiência de vectores retrovirais. Isto é possível por excisão-traço inferior da codificação de transposão integrada para a reprogramming factores na sequência de uma nova expressão transitória da transposase nas células iPS 33. Dado que o OP é eficaz em diferentes tipos de células 34, 35, 36, 37, é mais adequado para uma abordagem clínica no que diz respeito aos vectores virais, e permite a produção de células iPS livre de xeno contrariamente aos protocolos de produção virais correntes que usam xenobióticos condições, este sistema é usado para obter as células iPS a partir AF murino.

Aqui propomos um protocolo detalhado seguintes trabalhos já publicados para mostrar a produção de clones iPS pluripotentes a partir de células AF rato (células iPS-AF) 38.

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Protocolo

Todos os procedimentos estavam de acordo com a lei italiana. amostras murino AF foram colhidas a partir de ratos grávidas em 13,5 dias post coitum (DPC) de camundongos C57BL / 6-Tg camundongos (UBC-GFP) 30Scha / J chamada GFP.

Produção 1. Transposon

NOTA: Os vectores de expressão transposões foram gerados utilizando procedimentos de clonagem padrão. O DNA de plasmídeo para a transfecção de células de rato AF foi preparado utilizando-se kits comerciais.

  1. Misturar 10 ng de ADN de plasmídeo com 50 uL de bactérias DH5a num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar o tubo de microcentrifugadora em gelo durante 20 min.
  2. O choque térmico a 42 ° C durante 40 seg.
  3. Coloque tubo de microcentrifugadora em gelo durante 2 min.
  4. Adicionar 250 ul de caldo pré-aquecido (37 ° C) caldo lisogenia (LB). Agitar (300 rpm) a 37 ° C durante 30 min.
  5. Espalhe 30 ul de cada transformação em placas LB com 0,1 mg / ml de ampicilina. Permitir que as placas para secar e incubar invertida a 37 ° C OVernight.
  6. No dia seguinte, na parte da tarde, escolher 3 colónias, usando estéreis 200 dicas ul, de cada transformação e transferir para 0,1 mg / ml de LB amp.
  7. Agitar bactérias (300 rpm) durante a noite a 37 ° C.
  8. Para a purificação do plasmídeo usar kits comerciais. plasmídeos de Stock a -20 ° C.

2. embrionárias de camundongos Fibroblastos (MEF) Cultura

  1. Revestimento das placas de 6 poços com 0,1% de gelatina
    1. revestir placas sob o capô adição de 1 ml de solução estéril de gelatina a 0,1% a cada um dos seis poços. Deixe a gelatina polimerizar na incubadora (37 ° C) durante 1 h.
    2. Descartar o excesso, e secar as placas durante 1 hr.
    3. Use parafilme para vedar e armazenar as placas à temperatura ambiente.
  2. Inactivação de MEF com mitomicina C
    1. Descongelar um frasco de 4 x 10 6 células MEF usando um banho de 37 ° C.
    2. Semente MEF na capa em uma placa de Petri (150 mm) com meio MEF.
    3. Cultivar as células a 37 ° C e 5% de CO 2.
    4. (CUIDADO) Adicionar mitomicina C (5 mg / mL) quando as células estão confluentes.
    5. Colocar as células em uma incubadora (37 ° C e 5% de CO 2) durante 3 h.
    6. Remova o meio de células com mitomicina C. Lavar três vezes com solução salina de tampão fosfato 1x (PBS).
    7. Adicionar 2 ml de tripsina as células e colocar em comerciais a 37 ° C incubadora durante 5 min. Depois, adicione 18 ml de meio de bloqueio para parar a reacção de tripsina.
    8. Contar as células utilizando uma câmara de Burker de acordo com o protocolo do fabricante.
    9. células centrifugar a 145 xg por 5 min. Descartar o sobrenadante.
    10. Semente 60.000 células / cm 2 de MEF inactivado em placas revestidas com gelatina a 0,1%.
    11. Cultivar as células durante 24 h a 37 ° C e CO2 a 5%, antes da semeadura AF e / ou células IPS-AF.

3. Rato AF isolamento de células

  1. Configurar acasalamentos cronometrados e verificar plu vaginalgs após 24 h de co-habitação.
  2. Observe até 13,5 dpc e sacrificar barragem grávida por deslocamento cervical.
  3. Limpar a parede abdominal do animal, por meio de 70% de etanol.
  4. Com uma tesoura, realizar uma laparotomia mediana incisão do comprimento da parede abdominal para ter acesso para a cavidade abdominal.
  5. Expor o útero usando uma pinça. Remover o útero com uma tesoura e transferir para um prato de 100 milímetros de Petri estéril cheio com PBS 1x colocadas em gelo.
  6. Use uma lupa para recolher o AF em aumento de 10x.
  7. Segure o útero com uma pinça e retire a parede uterina com uma tesoura. Tenha cuidado para evitar qualquer dano às membranas fetais e consequente fuga de líquido amniótico.
  8. Recolha fetos em uma placa de Petri 100 milímetros preenchido com estéril 1x PBS e colocar no gelo.
  9. Segure a placenta de um feto com uma pinça fina ponto e lugar em um 100 milímetros placa de Petri limpa.
  10. Retire o saco vitelino usando uma pinça de ponta fina.
  11. Interromper o âmnio usando uma pinça de ponta fina e recolher 30 ul de AF para cada feto usando uma seringa de insulina em um 15 ml frasco cónico.
  12. Após a recolha de AF, lavar cada feto com PBS estéril 1x suplementado com 1% de soro fetal de bovino (FBS) e recolher nas tubo de 15 ml contendo o AF.
  13. Centrifugar AF a 145 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante sob o capô e semear as células AF peletizadas.

Cultura de Células 4. Rato AF

  1. Semeadura de células de camundongo AF
    1. Um dia antes da semeadura, preparar uma solução a 0,1% placa de 6 poços revestidos com gelatina com MEF tratado com mitomicina C.
    2. Após a coleta AF, semear as células obtidas a partir de uma amniocentese (cerca de 1 x 10 7 células obtidas a partir de 6 fetos) sobre o MEF mitoticamente inactivados utilizando meio de cultura AF.
    3. Cultivar as células a 37 ° C e 5% de CO 2, mudando o meio todos os outros dias.
    4. Após 7 dias de cultura, transcélulas fect AF seguintes o procedimento descrito abaixo.

5. A transfecção, geração de células iPS-AF e Cultura

NOTA: As células de ratinho AF foram transfectadas com o plasmídeo transposão PB-tetO2-IRES-OKMS, em conjunto com um plasmídeo de expressão de transposase (mPBase) e com o transactivador de tetraciclina reversa plasmídeo transposão (PB-CAG-rtTA). Todos os plasmídeos foram fornecidas pelo professor Andras Nagy 33.

  1. Misturar 1 ug de PB-tetO2-IRES-OKMS com 0,5 ug de mPBase e 0,5 ^ g de OP-CAG-rtTA (ADN total: 2? G) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  2. Dilui-se o ADN a 100 uL de meio isento de soro (Dulbecco Modified Eagle Médium - DMEM).
  3. Adiciona-se 8 mL de reagente de transfecção (por exemplo, FuGENE) (na proporção de ADN de plasmídeo: O agente de transfecção de 2 ug (ADN) para o agente de transfecção de 8 uL) contendo o ADN em 1,5 mL tubo de microcentrífuga.
  4. Incubar mistura reagente / transfecção de DNA durante 15 minutos à temperatura ambiente.
  5. Adicionar gota a gota 100 uL da mistura de reagentes de transfecção / ADN por poço para uma placa de 6 poços com células AF rato e distribuir por uma agitação suave, com um volume final de 2 mL / poço. Deixe por 24 h.
  6. No dia seguinte, induzirem a expressão de factores do Yamanaka (Oct4, KLF4, cMyc, Sox2), alimentando as células com meio fresco IPS-AF suplementado com 1,5 ug / ml de doxiciclina (2 mL de meio para cada poço).
  7. Alimentar as células a cada dia, sem passagem, por meio fresco contendo DOX (manter as células em meios suplementados com doxiciclina até que ponto 5.13).
  8. Observar células no prazo de 24 h para a expressão mCherry e diariamente para a formação de colónias (colônias aparecem normalmente entre 20 e 30 dias após a transfecção).
  9. Um dia antes da colheita de colónia, preparar uma placa de cultura de tecidos de 96 poços com MEF tratado com mitomicina C.
  10. Escolha colónias individuais em 50 ul de volume de Utilizanga 200 uL pipeta, e transferi-los sequencialmente para uma placa de 96 poços, em poços individuais.
  11. No dia seguinte, dissociar cada colónia em células isoladas através da adição de 50 ul de tripsina comercial e incubar durante 5 min a 37 ° C.
  12. Pipeta cima e para baixo para desagregar a colônia.
  13. Transferir 50 uL da tripsina contendo a colónia dissociada em um novo bem com MEF inactivada numa gelatina 0,1% revestidos de 96 poços da placa cheia com 100 uL de meio de IPS-AF fresco suplementado com doxiciclina.
  14. Quando as células atingem 60-70% de confluência, divididas em um poço de uma placa de 24 poços.
  15. Quando as células atingem 60-70% de confluência, divididas 1: 2 a dois poços, uma com a doxiciclina e o outro sem doxiciclina, para verificar se colónias aparecem também na condição sem doxiciclina.
  16. Continuar a manter clones iPS-AF, doxiciclina independente, em MEF inativada no meio iPS-AF.
  17. Células a 37 ° C e 5% de CO 2, CH cultivaranging média diária.

6. Coloração de Fosfatase Alcalina

  1. Realização da coloração da fosfatase alcalina seguindo o protocolo do fabricante, sempre que haja o aparecimento de células IPS-AF independentes doxiciclina.

7. imunofluorescência

  1. Sempre que haja o aparecimento de doxiciclina células independentes IPS-AF, sementes 150.000 células / cm2 em um poço de uma placa de 24 poços com MEF inactivado, e crescer as células durante 48 h a 37 ° C e 5% de CO 2.
  2. (CUIDADO) Fixar as células por adição de 300 ul por poço de 4% de paraformaldeído (PFA) durante 15 min à temperatura ambiente.
  3. Adicionar 300 uL de 0,1% de NP-40 para permeabilizar as células.
  4. Lavar as células com 300 uL de 0,1% de PBS-Tween 20.
  5. Adicionar 300 ul de tampão de bloqueio (soro de cavalo a 10% em 1x PBS) durante 1 h à temperatura ambiente.
  6. Utilize os seguintes anticorpos primários: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), KLF4 (1:80), NANOG (1:100) e SSEA1 (1:80). Diluir SSEA1 com 1% de albumina de soro bovino (BSA), soro de cabra normal a 10%, 0,3 M de glicina em 0,1% PBS-Tween-20. Dilui-se todos os outros anticorpos com soro de cavalo a 10% em PBS 1x.
  7. Incubar anticorpos durante a noite a 4 ° C.
  8. Lavar com 300 ul de 0,1% de PBS-Tween-20.
  9. Use os anticorpos secundários diluídos em soro de cavalo a 10% em PBS 1x: cabra Alexa594-conjugado anti-IgG de ratinho (1: 200), IgG de galinha anti-cabra Alexa594-conjugado (1: 200), Alexa594-conjugado de galinha anti-IgG de coelho (1: 200), Alexa568 de cabra conjugado com anti-rato de IgM (1: 200). Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente.
  10. Enxágüe com 1x PBS.
  11. núcleos mancha com solução de Hoechst (1: 10.000) em 1x PBS.

8. In Vitro Cell Differentiation

  1. Para formar pendurados gota corpos embrióides (EBS), cultivar gotas individuais (2.000 células / 20 ul) sobre a tampa da placa de Petri, utilizando o meio de diferenciação.
  2. Incubar os pratos a 37 ° Ce 5% de CO 2 durante 4 dias.
  3. Transferir EBs em 100 mm pratos de grau bacteriana na cultura em suspensão durante 3 dias em meio de diferenciação.
  4. EBs prato em 24 poços, placas revestidas com matriz de membrana basal (diluído 1:10 em DMEM) durante mais 14 dias.
  5. Para as análises de imunofluorescência, usam anticorpos primários: T (1: 100), αfp (1: 200) e Tubb3 (1: 500) 37.

9. Formação In Vivo teratoma

  1. Injectar 100 ul de 1x PBS contendo 1 x 10 6 células IPS-AF no músculo do membro posterior de RAG2 - / - yc - / - ratos.
  2. Sacrificar os ratos por deslocamento cervical 6 semanas após a injeção de células.
  3. Retirar as massas tumorais, que se distinguem pelo seu tamanho, a partir do membro posterior de ratinhos para as análises seguintes.
  4. Cortar 7-10 uM secções transversais de espessura de tumor isopentano-congelado utilizando um criostato.
  5. Para Hematoxilina umd Eosina (HE) Stain:
    1. Mancha com HE para avaliar a composição do tecido do tumor, seguindo o protocolo do fabricante.
  6. Para Stain imunoperoxidase:
    1. Fix secções teratoma com PFA a 4% durante 15 min à temperatura ambiente.
    2. Permeabilizar com 0,1% de Triton X-100.
  7. Incubar com os anticorpos seguintes: Tubb3 (1: 100), αfp (01:50) e αSMA (1: 100) diluída em BSA a 1% em PBS 1x. Incubar durante 1 hora a 37 ° C (para Tubb3) ou durante a noite a 4 ° C (para os outros anticorpos).
  8. peroxidase de bloco utilizando metanol a 100% durante 20 min.
  9. Incubar durante 45 min a 37 ° C com anticorpo secundário conjugado com HRP (1: 150) anti-rato.
  10. Enxágüe com 1x PBS.
  11. Incubar com peroxidase de substrato (HRP) (Ver Materiais Tabela) durante 5 min.
  12. Lavar com água da torneira durante 5 min.
  13. Mancha com Hematoxilina QS para 9 seg.
  14. Lavar com água da torneira.

10. A extracção de ARN a partir de células

  1. Usar um kit de extração de RNA comerciais de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante.

11. A extracção de ARN a partir de teratoma

  1. Homogeneizar o teratoma usando um pilão e nitrogênio argamassa e líquidos para evitar o descongelamento da amostra.
  2. Pesar 25 mg de tecido.
  3. Adicionar 1 ml de reagente comercial para extração de RNA e 200 mL de clorofórmio.
  4. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
  5. Centrifuga-se a 13000 xg e 4 ° C durante 15 min.
  6. Transferir o sobrenadante clarificado para um tubo novo.
  7. Para purificar o ARN utilizar um kit de extração de RNA comerciais de acordo com o protocolo do fabricante.

12. Transcrição Reversa-polimerase Análise Chain Reaction

  1. Sintetizar a primeira cadeia de ADNc utilizando uma transcriptase reversa para a transcrição inversa (RT) -polimerase reacção em cadeia (PCR) e o oligo acor (dT)Ding com o protocolo do fabricante, para se obter 50 ng / uL de ADNc. Dilui-se com ADNc de água isenta de RNase na concentração de 10 ng / mL.
  2. Realizar RT-PCR utilizando a polimerase de ADN de acordo com o protocolo do fabricante, utilizando 1 ng / uL de ADNc.

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Resultados

Para avaliar a capacidade de reprogramação, as células do rato AF foram coletados de fetos de ratos GFP. As células foram transfectadas com o plasmídeo circular transposão PB-tetO2-IRES-OKMS, que expressa os factores Yamanaka (Oct4, Sox2, cMyc e KLF4) ligadas à proteína fluorescente mCherry de uma forma indutível doxiciclina, tetraciclina e transactivador reverso (PB- CAG-rtTA) os plasmídeos juntamente com o plasmídeo de expressão de transposase (mPBase). Células de ratinho transfectadas...

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Discussão

O método escolhido para se obter a indução de pluripotência é relevante para segurança clínica célula no que diz respeito ao transplante a longo prazo. Hoje em dia, existem vários métodos adequados para a reprogramação. Entre os métodos de não-integrativos, a viral (SeV) Sendai vector é um vírus de ARN que pode produzir grandes quantidades de proteína, sem integração no núcleo das células infectadas e 40 podia ser uma estratégia para a obtenção de células iPS. vectores SeV poderia ser um candidat...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Bolsa da Fundação CARIPARO número 13/04 e pela Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Concessão número 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin e Michela Pozzobon são financiadas pela Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin é financiada pela Bolsa da Fundação CARIPARO número 13/04. Paolo De Coppi é financiado pela Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas de Petri de grau bacteriano de 100 mm BD Falcon351029Para diferenciação in vitro
2-mercaptoetanol SigmaM6250Para AF de camundongo, células iPS-AF e meio de diferenciação
Alexa568-conjugado cabra anti-mouse IgM Thermo Fisher ScientificA21043Anticorpo secundário (imunofluorescência)
Alexa594-conjugado com frango anti-cabra IgG Thermo Fisher ScientificA21468Anticorpo secundário (imunofluorescência)
Alexa594-conjugado frango anti-coelho IgG Thermo Fisher ScientificA21442Anticorpo secundário (imunofluorescência)
Alexa594-conjugado com cabra anti-camundongo IgG Thermo Fisher ScientificA11005Anticorpo secundário (imunofluorescência)
Kit de fosfatase alcalina Sigma85L1Fosfatase Alcalina Coloração
AmpicilinaSigmaA0166Para seleção bacteriana
Soro Bovino Albumina SigmaA7906BSA, para solução de bloqueio. Diluído em PBS 1x
ClorofórmioSigmaC2432Para extração de RNA
DH5α célulasThermo Fisher Scientific18265-017Bactérias para procedimento
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher Scientific41965039Para MEF, AF de camundongo, células iPS-AF e meio
de diferenciaçãoDoxiciclina SigmaD9891Para expressão de fatores exógenos
Tubos de microcentrífuga (1,5 ml) Sarstedt 72.706Para produção de PB
ES FBS Thermo Fisher Scientific10439024Para AF de camundongo, células iPS-AF e meio de diferenciação
FBS Thermo Fisher Scientific10270106Para MEF médio
Ponta fina fórcepsF.S.TDumont #5 Isolamento AF
GelatinaJ.T.Baker131Usado 0,1%, diluído em PBS 1x
GlycineBio-Rad161-0718Para solução de bloqueio. Diluído em PBS 1x
Hematoxilina QSVector LaboratoriesH3404Detecção de núcleos
HE Bio-Optica04-061010Análise histológica do teratoma
Hoechst Thermo Fisher ScientificH3570Soro de Detecção
de Núcleos para Cavalos Thermo Fisher Scientific16050-122Para solução de bloqueio
HRP-conjugado cabra anti-camundongo IgGSantaCruzsc2005Anticorpo secundário (imunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED Vector LaboratoriesSK4805Substrato de peroxidase
Seringa de insulina com agulha (25 G)TerumoSS+01H25161Procedimento de amniocentese
Klf4 SantaCruzsc-20691Coelho policlonal IgG
L-glutamina Thermo Fisher Scientific25030Para AF de camundongo, células iPS-AF e meio de diferenciação
LB caldo (Lennox)SigmaL3022Para crescimento bacteriano
LIF SigmaL5158Para células AF de camundongo e iPS-AF médio
Matrigel BD354234Para diferenciação in vitro. Diluído 1:10 em
DMEM MetanolSigma32213Bloqueio de peroxidase
MULTIWELL Placa de 24 poçosBD Falcon353047Para diferenciação in vitro Placa
de 6 poços MULTIWELLBD Falcon353046Para MEF, AF de camundongo e cultura de células iPS-AF
Nanog ReproCELLRCAB0002P-FCoelho policlonal IgG
Aminoácidos não essenciais SigmaM7145para o AF do rato, as pilhas do iPS-AF e os
S2000vetordo soro da cabra doda diferenciação para a solução de obstrução. Diluído em PBS 1x
NP-40Sigma12087-87-0Para permeabilização celular. Diluído em PBS 1x
Oct4SantaCruzsc-5279Camundongo monoclonal IgG2b
Oligo (dT) Thermo Fisher Scientific18418012Para RT-PCR
Paraformaldeído (solução)Sigma441244PFA, fixador, diluído em PBS
PBS 10xThermo Fisher Scientific14200-067D-PBS, livre de Ca2+/Mg2+. Diluído em água estéril para obter PBS 1x
Penicilina - Estreptomicina Thermo Fisher Scientific15070063Para MEF, AF de camundongo, células iPS-AF e meio de diferenciação
Placa de Petri (150 mm)BD Falcon353025Para cultura de MEF, cultura de tecidos
PiggyBac plasmídeo de expressão de transposase Fornecido pelo professor Andras Nagylaboratório-mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS plasmídeo transposonFornecido pelo professor Andras Nagylaboratório-PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep KitQiagen12663Para purificação de plasmídeos
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106Para purificação de plasmídeos
Transativador de tetraciclina reversa plasmídeo transposon Fornecido pelo professor Andras Nagylaboratory-rtTA
RNeasy Mini Kit Qiagen74134Para extração de RNA
Sox2 SantaCruzsc-17320IgG policlonal de cabra
SSEA1 Abcamab16285Camundongo monoclonal IgM
SuperScript II Transcriptase reversa Thermo Fisher Scientific18064-014Para RT-PCR
T Abcamab20680Polimerase de DNA Taq IgG policlonal para coelhos
Thermo Fisher Scientific10342020PCR
Tripsina Thermo Fisher Scientific25300-054Passagem de cultura celular
Triton X-100Bio-Rad161-047Para permeabilização celular, diluído em PBS 1x
Reagente TRIzolThermo Fisher Scientific15596-026Para extração
Tubb3   Promega G712ASigma P1379 monoclonal de camundongo IgG1
TWEEN-20Para permeabilização celular, diluído em PBS 1x
e alfa; fp     R& D SystemsMAB1368
&alfa;SMA Abcamab7817Reagente de Transfecção Monoclonal de IgG2a
(FuGENE HD)Promega E2311Para transfecção de células AF
EstereomicroscópioNikonSM2645Para realizar amniocentese 
200 μ l dicasSarstedt 70.760012Para colher colônias de bactérias
TesouraF.S.T14094-11 inoxidável 25UPara realizar amniocentese 
EtanolSigma2860Para limpar a parede abdominal da mãe grávida
Placa de Petri para cultura de tecidos (150 mm) Falcão BD353025para expansão MEF
Mitomicina CSigmaM4287-2MGPara inativação MEF
Placa de 96 poços BDFalcon 353071para cultura iPS-AF
de clonagem laboratórios normais do meio de RNA IgG1 monoclonal de camundongo de Camundongo

Referências

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