Summary

Patch-clamp gravação de células Starburst Amácrinas em um monte de Luxo Preparação de Deafferentated mouse Retina

Published: October 13, 2016
doi:

Summary

Este protocolo demonstra como executar de células inteiras de gravação patch-clamp em neurônios da retina a partir de uma preparação flat-mount.

Abstract

A retina dos mamíferos é um tecido em camadas compostas de vários tipos neuronais. Para entender como os sinais visuais são processados ​​dentro de sua rede sináptica intrincado, registros eletrofisiológicos são frequentemente usados ​​para estudar as conexões entre os neurônios individuais. Nós otimizamos uma preparação plana de montagem para a gravação de patch-clamp de neurônios geneticamente marcados em ambos GCL (camada de células ganglionares) e INL (camada nuclear interna) de retinas de ratos. Gravação de neurônios do INL em planos montagens é favorecido sobre fatias porque as conexões verticais e laterais são preservados na configuração anterior, permitindo que os circuitos da retina com grandes componentes laterais a ser estudado. Temos utilizado este procedimento para comparar as respostas dos neurônios-espelho-partnered em retinas tais como as células amácrinas starburst colinérgicos (ZEC).

Introduction

As an easily accessible part of the central nervous system, the retina has for decades been a useful model in neuroscience studies. Genetic marking of neurons has allowed detailed characterization of synaptic connections in the retina. With many methodologies available to examine function and morphology of retinal neurons, the patch clamp recording technique has been instrumental in our current understanding of vertically transmitted signals in the retina. These signals are originated from photon absorption in photoreceptors and sent to brain visual centers through spiking of retinal ganglion cells (RGCs). Despite a large body of knowledge accumulated thus far, neural diversity in vascularized mammalian retina remains unsolved and obstructs the full appreciation of retinal circuits that subserve normal vision. This is in part because most recordings were performed on retinal slices to trade lateral circuit integrity for access to more proximal retinal neurons1-3. To gain a comprehensive picture on how retina computes visual signals, it is thus desirable to record neurons in flat-mounts wherein lateral connections, large and small, may be better preserved.

When synaptic transmission from photoreceptors to bipolar cells is interrupted due to a defective metabotropic glutamate receptor 6 (mGluR6) signaling pathway in depolarizing bipolar cells4-6 or simply as the result of photoreceptor loss in degenerated retinas7-10, many RGCs exhibit oscillatory activities. These oscillations originate from multiple sources, however the one involving gap junction coupling between AII amacrine cells (AII-ACs) and depolarizing cone bipolar cells (DCBCs) has received the most attention and hence is best understood1,7,11. We have found another source, which persists under pharmacological blockade of the aforementioned AII-AC/DCBC network and drives oscillation of OFF-type SACs in RhoΔCTA and Nob mice with deafferentated retinas7,8,12. Here we detail our protocol of preparing retinal flat-mounts for INL neuron recording. This approach uses commercial mouse lines (Jax stock no. 006410 and 007905) to mark cholinergic retinal neurons by fluorescent protein (tdTomato) expression that is identifiable under a fluorescent microscope equipped with contrast enhancing optics. Some experimental results acquired through this approach have been previously reported4,5,7,13.

Protocol

A aprovação ética – procedimentos que envolvem indivíduos animais foram conduzidos de acordo com as regras e regulamentos dos Institutos Nacionais de diretrizes de saúde para animais de pesquisa, conforme aprovado pelo Institutional Animal Care e usar comitê de Baylor College of Medicine. 1. externa e Soluções Internas Usar a solução de Ringer de mamífero durante a dissecção retina e como a solução externa na gravação eletrofisiológico subsequente. Preparar a solução de Ringer de mamífero a partir de solução-mãe 10x (sem cálcio) no dia da gravação, e adicionar CaCl2 gota a gota, após 15 minutos de carbogenation (95% O 2 e 5% CO 2). A solução final 1x contém (em mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO3, 0,8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2, 1 MgSO4 e 10 de D-glucose. Use duas soluções internas para caracterizar oscilações SAC. Testea utilidade das soluções preparadas em de célula inteira gravações patch clamp prolongados em RGCs rato adulto e armazenar os lotes verificados em alíquotas de 500 uL a -20 ° C até à sua utilização. Para a gravação de membrana oscilação potencial, usar uma solução interna à base de potássio que contém (em mM): 125 de K-gluconato, 8 de NaCl, 4 de ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES e 0,2% biocitina (w / v). Ajustar o pH para 7,3 com KOH. Para gravação excitatórios e correntes pós-sinápticos de inibição, usar uma solução interna à base de césio que contém (em mM): 100 Cs-metanossulfonato, 8 de NaCl, 4 de ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES e 0,2% biocitina ( w / v). Ajustar o pH para 7,3 com CsOH. 2. Preparação para o Dia da Gravação Para preparar uma membrana de nitrocelulose com buracos abertos, perfurar manualmente a membrana com um perfurador personalizado feito de uma agulha de seringa embotada 16 G e achatar a membrana entre duas placas de vidro limpo. Para uma whole-montar retina, faça um furo central de 0,2 mm de diâmetro e cercá-lo por 4 furos maiores que são 1-1,2 mm de diâmetro. Para fazer um filamento aterro personalizado para carregar solução interna para eletrodos, derreta uma ponta de pipeta 10 ul no meio e gentilmente alongar a parte derretida até que esfria e endurece. Imediatamente antes da utilização, usar uma lâmina de barbear para cortar limpo do filamento até que é ligeiramente mais longo do que as pipetas de patch. Puxe pipetas de patch em um extrator programável de tubo de vidro de borosilicato com um filamento interno. Fabricar as micropipetas no dia da experiência e usá-los imediatamente. NOTA: Para ZEC gravação, usamos a seguinte configuração extrator: calor: 484; puxe: 0; velocidade: 25; tempo de atraso: 1; pressão: 400 e um valor de rampa de 462. O OD e ID dos tubos de borosilicato são de 1,65 mm e 1,0 mm, respectivamente. Resistência das pipetas é 10-14 mohms. Uma hora antes da colheita de tecidos, descongelar um tubo de solução interna por shaking-lo em um vórtice de> 30 min. 3. Retina Dissection Anestesiar o animal por 4% de isoflurano em oxigênio até que o animal perde a capacidade de resposta a uma pitada dedo do pé. Sacrificar o animal por deslocamento cervical. Corte ambos os globos oculares fora os nervos ópticos a 1-2 mm de distância das cabeças do nervo óptico com íris retas-apontou tesoura. Rolar os olhos em uma toalha de papel limpa para remover sangue e, em seguida, mergulhe-os em solução de Ringer de mamífero carbogenated. Faça um furo no limbo com uma agulha G 23 e bissetriz os globos oculares cortando ao longo do limbo com micro-tesoura. Retirar a córnea ea lente usando uma pinça fina. Para retinal todo-mount, descascar delicadamente a retina inteira fora do epitélio pigmentado com uma pinça fina e fazer cortes quatro 1,5-2 mm ortogonais a partir da borda em direção à cabeça do nervo óptico. Mergulhe uma membrana de nitrocelulose soco no prato e gentilmente arraste a retina sobre ele como lado GCL-se. Coloque a cabeça do nervo óptico no orifício central na preparação de uma retina de toda a montagem. Transferir a membrana com a retina no outro prato limpo. Gentilmente achatar a retina com um pincel fino para olhar como uma cruz de Malta e colocar todas as quatro bordas ao longo dos buracos. Se uma fracção da retina é para ser examinado de cada vez, cortar cada ocular preparado a partir do Passo 3.3 em 3-4 pedaços com uma lâmina de barbear com o epitélio pigmentado permanece ligado. Proteger as peças não utilizadas de luz na solução externa carbogenated e usá-los dentro de 12 horas. Seque a membrana de nitrocelulose com um pedaço de papel de filtro seco e remover a membrana limitadora interna e vítreo com uma pinça e um pincel. Certifique-se de que todas as bordas da retina são totalmente ligado à membrana antes de transferir a montagem para a câmara de gravação com uma lamela de vidro selado na parte inferior. Fixe a membrana com graxa de vácuo para a lamínula e rehydratE é a retina com a solução externa. Seja não tomar cuidado para prender as bolhas de ar debaixo da montagem. Definir a câmara para o palco de um microscópio vertical. Perfundir a câmara com (34-35 ° C) solução externa carbogenated quente, a uma taxa de ~ 3 mL por min. Examinar a retina sob uma lente objetiva de 10x em primeiro lugar e, em seguida, usar uma lente de 60x de imersão em água para ver neurônios GCL e INL sob contraste de interferência diferencial (DIC) e / ou de epifluorescência. Para visualizar ZEC-expressando tdTomato, utilizar uma fonte de luz LED branco em combinação com um filtro de excitação de 554 nm e um filtro de emissão de 581 nm. 4. Whole-cell patch de gravação braçadeira de Flat-mount Retina Filtrar a solução através de um filtro interno da seringa no filamento aterro costume. Insira o filamento em uma micropipeta acabada de tirar e dispensar a solução interna perto da ponta até que a solução cobre o fio do eletrodo de prata para>5 mm. Fixar a micropipeta para um suporte de eléctrodo com uma vara de aspiração, através da qual a pressão no interior do eléctrodo pode ser ajustada, empurrando ou puxando o êmbolo de uma seringa de plástico de 10 ml ligado de tubo. Encontre a pipeta no âmbito do objectivo e trazê-lo para baixo para ~ 100 mm acima da retina. Sob o modo atual seguidor (I = 0), use DC offset para zero o sinal de tensão DC em pé. Meça a resistência da pipeta sob a pinça de corrente de modo (I Grampo) através da injeção de amplitude fixa correntes onda quadrada através da pipeta enquanto ele está no banho e neutralizar a diferença girando o botão rAcesse. Use a leitura na maçaneta rAcesse para calcular a resistência da pipeta pela lei de Ohm. levar lentamente o eletrodo para ~ 10 mm acima da retina. Aplicar a pressão positiva para o eléctrodo. Assista a mudança reflexão perto da ponta da pipeta quando se aproxima da retina. Rapidamente, mas com cuidado forçar a pipeta no GCL e reduzir o pressu positivare imediatamente. Mover a pipeta para um neurônio rotulados. Evite entrar em contato com outros neurónios, vasos sanguíneos e endfeet de células Muller. Aplique uma pressão mais positiva se for necessário para evitar o entupimento do eletrodo. Posicione a ponta da pipeta perto da linha média de um neurônio rotulados até uma covinha é visível. Solte a pressão positiva e permitir que a membrana plasmática para saltar de volta para a ponta da pipeta. Aplicar 20 a 120 pA correntes negativos para a pipeta para ajudar a formação de um selo giga-ohm. Aplicar uma sucção suave, se necessário, para puxar a membrana plasmática para a pipeta. Esperar 5 minutos após a formação de selo para romper a membrana celular. Isso permite que a solução interna derramado foi afastada pelo superfusão. Ruptura da membrana por uma sucção suave. Após a ruptura da membrana e ao mesmo tempo no modo de pinça de corrente, ligue o equilíbrio ponte e ajustá-lo usando o botão rAcesse. NOTA: Por uma pequena célula como o SAC, só é necessário ligeiro ajuste, se houver. Alterntivamente, ficha excitatórios e inibitórios correntes pós-sinápticos no modo braçadeira de tensão (V Grampo) por segurando o celular no potencial de reversão de cloreto de (cerca de -75 mV) e glutamato (em torno de 0 mV), respectivamente. Verifique e ajuste a posição da pipeta se necessário para acomodar retina ocasional e / ou deriva micromanipulador. Para registar o potencial de membrana ou alteração da corrente antes, durante e após o tratamento farmacológico, preparam sinápticas bloqueadores (por exemplo, CNQX, AP5, picrotoxina, tubocurarina, etc.) e moduladores do canal (por exemplo, flupirtina, dopamina, ácido meclofenâmico, etc.) em fresco o dia do experimento de stocks congelados. Diluir as drogas com solução carbogenated de Ringer. Aplicá-las de uma forma de lote por meio de perfusão. Após a gravação, remover suavemente a pipeta da soma. Transferir a montagem da câmara para um prato limpo. Desligar e voltar a ligar a retina para outra membrana de nitrocelulose achatados sem hol perfuradoES para assegurar o nivelamento da retina durante a fixação. Fixar a retina por imersão em 4% de paraformaldeído durante 30 min à TA. Remova a retina a partir da membrana de nitrocelulose e lave-o extensivamente com 1x PBS. Revelam a morfologia das células gravadas por O / N coloração com estreptavidina conjugado com corante diluídos em 1x PBS com 0,4% de Triton X-100 a 4 ° C 14. Monte a retina em meio Antifade e observar células gravado utilizando um microscópio de varredura confocal. NOTA: os procedimentos de paraformaldeído, que é volátil e tóxico, deve ser realizado em um projeto de câmara de segurança.

Representative Results

Registos representativos de dentro e fora do tipo SACs de uma retina deafferentated rato são mostrados na Figura 1. As células colinérgicas em ambos GCL e INL podem ser identificados de forma confiável por tdTomato fluorescência e direcionados para de células inteiras de gravação patch-clamp sob DIC (Figura 1A) para revelar oscilação de seus potenciais de membrana (top traços) e as correntes sinápticas que dirigi-lo (traços inferiores, <stro…

Discussion

Muitos laboratórios têm gravado a partir de neurônios GCL na preparação 15-18 plana de montagem, mas os nossos procedimentos de permitir a gravação de neurônios do INL. Vimos por este meio enfatizar várias etapas que são críticas para as gravações de rotina bem sucedidas.

A frescura e achatamento da retina são importantes para penetrar com uma pipeta de gravação. A este respeito, a ligação firme da retina para a membrana de nitrocelulose perfurado é primordial e…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Joung Jang and Xin Guan for technical assistance. We thank Dr. Rory McQuiston of Virginia Commonwealth University for setting up our first patch clamp rig and advices on experimental procedures. We thank Dr. Samuel Wu for suggestions on voltage clamp recording. The work is supported by NIH grants EY013811, EY022228 and a vision core grant EY002520. C-KC is the Alice R. McPherson Retina Research Foundation Endowed Chair at the Baylor College of Medicine.

Materials

Fixed-stage fluorescent microscope with DIC Olympus BX51-WI
Micromanipulators Sutter MP-225
Patch clamp amplifier A-M System AM2400
AD converter National Instrument NI-USB-6221
Heater controller Warner Instrument TC-324B
Inline heater Warner Instrument SC-20
Peristaltic pump Rainin Dynamax
pipette puller Sutter Instrument P-1000
Glass tube with filament King Precision Glass Customized
Stimulator A.M.P.I. Master-8
Biocytin Sigma B4261
NaCl Sigma S6191
KCl Sigma P5405
NaHCO3 Fisher BP328-1
Na2HPO4 Sigma S0876
NaH2PO4 Sigma S5011
CaCl2 Sigma C5670
MgSO4 Sigma M1880
D-glucose Sigma G6152
K-gluconate Sigma G4500
ATP-Mg Sigma A9187
Li-GTP Sigma G5884
EGTA Sigma E0396
HEPES Sigma H4034
KOH Sigma P5958
Cs-methanesulfonate Sigma C1426
CsOH Sigma 232041
Syringer filter Nalgene 171
1 ml syring Rainin 17013002
10 ul pipette tip Genesee Scientific 24-130RL
Streptavidin-488 ThermoFisher S-11223
10X PBS Lonza 17-517Q

Referências

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Citar este artigo
Tu, H., Hsu, C., Chen, Y., Chen, C. Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina. J. Vis. Exp. (116), e54608, doi:10.3791/54608 (2016).

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