Artigo de método

Patch-clamp gravação de células Starburst Amácrinas em um monte de Luxo Preparação de Deafferentated mouse Retina

DOI:

10.3791/54608

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13 de outubro de 2016

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1Department of Ophthalmology, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo demonstra como executar de células inteiras de gravação patch-clamp em neurônios da retina a partir de uma preparação flat-mount.

Resumo

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A retina dos mamíferos é um tecido em camadas compostas de vários tipos neuronais. Para entender como os sinais visuais são processados ​​dentro de sua rede sináptica intrincado, registros eletrofisiológicos são frequentemente usados ​​para estudar as conexões entre os neurônios individuais. Nós otimizamos uma preparação plana de montagem para a gravação de patch-clamp de neurônios geneticamente marcados em ambos GCL (camada de células ganglionares) e INL (camada nuclear interna) de retinas de ratos. Gravação de neurônios do INL em planos montagens é favorecido sobre fatias porque as conexões verticais e laterais são preservados na configuração anterior, permitindo que os circuitos da retina com grandes componentes laterais a ser estudado. Temos utilizado este procedimento para comparar as respostas dos neurônios-espelho-partnered em retinas tais como as células amácrinas starburst colinérgicos (ZEC).

Introdução

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Como uma parte facilmente acessível do sistema nervoso central, a retina tem sido por décadas um modelo útil em estudos de neurociência. A marcação genética de neurônios permitiu a caracterização detalhada das conexões sinápticas na retina. Com muitas metodologias disponíveis para examinar a função e a morfologia dos neurônios da retina, a técnica de registro de patch clamp tem sido fundamental em nossa compreensão atual dos sinais transmitidos verticalmente na retina. Esses sinais são originados da absorção de fótons em fotorreceptores e enviados aos centros visuais cerebrais por meio do pico de células ganglionares da retina (RGCs). Apesar de um grande corpo de conhecimento acumulado até agora, a diversidade neural na retina vascularizada de mamíferos permanece sem solução e obstrui a apreciação total dos circuitos retinianos que servem à visão normal. Isso ocorre em parte porque a maioria das gravações foi realizada em fatias da retina para trocar a integridade do circuito lateral pelo acesso a neurônios retinianos mais proximais1-3. Para obter uma imagem abrangente de como a retina calcula os sinais visuais, é desejável registrar os neurônios em montagens planas, nas quais as conexões laterais, grandes e pequenas, podem ser melhor preservadas.

Quando a transmissão sináptica de fotorreceptores para células bipolares é interrompida devido a uma via de sinalização defeituosa do receptor metabotrópico de glutamato 6 (mGluR6) em células bipolares despolarizantes4-6 ou simplesmente como resultado da perda de fotorreceptores em retinas degeneradas7-10, muitos RGCs exibem atividades oscilatórias. Essas oscilações se originam de múltiplas fontes, no entanto, aquela que envolve o acoplamento de junções comunicantes entre células amácrinas AII (AII-ACs) e células bipolares de cone despolarizante (DCBCs) tem recebido mais atenção e, portanto, é melhor compreendida1,7,11. Encontramos outra fonte, que persiste sob bloqueio farmacológico da rede AII-AC/DCBC acima mencionada e impulsiona a oscilação de SACs do tipo OFF em camundongos RhoΔCTA e Nob com retinas deaferentadas7,8,12. Aqui, detalhamos nosso protocolo de preparação de montagens planas de retina para gravação de neurônios INL. Essa abordagem usa linhagens comerciais de camundongos (estoque Jax nº 006410 e 007905) para marcar neurônios colinérgicos da retina pela expressão de proteína fluorescente (tdTomato) que é identificável sob um microscópio fluorescente equipado com óptica de aprimoramento de contraste. Alguns resultados experimentais adquiridos por meio dessa abordagem foram relatados anteriormente4,5,7,13.

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Protocolo

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A aprovação ética - procedimentos que envolvem indivíduos animais foram conduzidos de acordo com as regras e regulamentos dos Institutos Nacionais de diretrizes de saúde para animais de pesquisa, conforme aprovado pelo Institutional Animal Care e usar comitê de Baylor College of Medicine.

1. externa e Soluções Internas

  1. Usar a solução de Ringer de mamífero durante a dissecção retina e como a solução externa na gravação eletrofisiológico subsequente. Preparar a solução de Ringer de mamífero a partir de solução-mãe 10x (sem cálcio) no dia da gravação, e adicionar CaCl2 gota a gota, após 15 minutos de carbogenation (95% O 2 e 5% CO 2). A solução final 1x contém (em mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO3, 0,8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2, 1 MgSO4 e 10 de D-glucose.
  2. Use duas soluções internas para caracterizar oscilações SAC. Testea utilidade das soluções preparadas em de célula inteira gravações patch clamp prolongados em RGCs rato adulto e armazenar os lotes verificados em alíquotas de 500 uL a -20 ° C até à sua utilização.
    1. Para a gravação de membrana oscilação potencial, usar uma solução interna à base de potássio que contém (em mM): 125 de K-gluconato, 8 de NaCl, 4 de ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES e 0,2% biocitina (w / v). Ajustar o pH para 7,3 com KOH.
    2. Para gravação excitatórios e correntes pós-sinápticos de inibição, usar uma solução interna à base de césio que contém (em mM): 100 Cs-metanossulfonato, 8 de NaCl, 4 de ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES e 0,2% biocitina ( w / v). Ajustar o pH para 7,3 com CsOH.

2. Preparação para o Dia da Gravação

  1. Para preparar uma membrana de nitrocelulose com buracos abertos, perfurar manualmente a membrana com um perfurador personalizado feito de uma agulha de seringa embotada 16 G e achatar a membrana entre duas placas de vidro limpo. Para uma whole-montar retina, faça um furo central de 0,2 mm de diâmetro e cercá-lo por 4 furos maiores que são 1-1,2 mm de diâmetro.
  2. Para fazer um filamento aterro personalizado para carregar solução interna para eletrodos, derreta uma ponta de pipeta 10 ul no meio e gentilmente alongar a parte derretida até que esfria e endurece. Imediatamente antes da utilização, usar uma lâmina de barbear para cortar limpo do filamento até que é ligeiramente mais longo do que as pipetas de patch.
  3. Puxe pipetas de patch em um extrator programável de tubo de vidro de borosilicato com um filamento interno. Fabricar as micropipetas no dia da experiência e usá-los imediatamente.
    NOTA: Para ZEC gravação, usamos a seguinte configuração extrator: calor: 484; puxe: 0; velocidade: 25; tempo de atraso: 1; pressão: 400 e um valor de rampa de 462. O OD e ID dos tubos de borosilicato são de 1,65 mm e 1,0 mm, respectivamente. Resistência das pipetas é 10-14 mohms.
  4. Uma hora antes da colheita de tecidos, descongelar um tubo de solução interna por shaking-lo em um vórtice de> 30 min.

3. Retina Dissection

  1. Anestesiar o animal por 4% de isoflurano em oxigênio até que o animal perde a capacidade de resposta a uma pitada dedo do pé. Sacrificar o animal por deslocamento cervical.
  2. Corte ambos os globos oculares fora os nervos ópticos a 1-2 mm de distância das cabeças do nervo óptico com íris retas-apontou tesoura.
  3. Rolar os olhos em uma toalha de papel limpa para remover sangue e, em seguida, mergulhe-os em solução de Ringer de mamífero carbogenated. Faça um furo no limbo com uma agulha G 23 e bissetriz os globos oculares cortando ao longo do limbo com micro-tesoura. Retirar a córnea ea lente usando uma pinça fina.
    1. Para retinal todo-mount, descascar delicadamente a retina inteira fora do epitélio pigmentado com uma pinça fina e fazer cortes quatro 1,5-2 mm ortogonais a partir da borda em direção à cabeça do nervo óptico.
  4. Mergulhe uma membrana de nitrocelulose soco no prato e gentilmente arraste a retina sobre ele como lado GCL-se. Coloque a cabeça do nervo óptico no orifício central na preparação de uma retina de toda a montagem. Transferir a membrana com a retina no outro prato limpo. Gentilmente achatar a retina com um pincel fino para olhar como uma cruz de Malta e colocar todas as quatro bordas ao longo dos buracos.
    1. Se uma fracção da retina é para ser examinado de cada vez, cortar cada ocular preparado a partir do Passo 3.3 em 3-4 pedaços com uma lâmina de barbear com o epitélio pigmentado permanece ligado. Proteger as peças não utilizadas de luz na solução externa carbogenated e usá-los dentro de 12 horas.
  5. Seque a membrana de nitrocelulose com um pedaço de papel de filtro seco e remover a membrana limitadora interna e vítreo com uma pinça e um pincel.
  6. Certifique-se de que todas as bordas da retina são totalmente ligado à membrana antes de transferir a montagem para a câmara de gravação com uma lamela de vidro selado na parte inferior. Fixe a membrana com graxa de vácuo para a lamínula e rehydratE é a retina com a solução externa. Seja não tomar cuidado para prender as bolhas de ar debaixo da montagem.
  7. Definir a câmara para o palco de um microscópio vertical. Perfundir a câmara com (34-35 ° C) solução externa carbogenated quente, a uma taxa de ~ 3 mL por min.
  8. Examinar a retina sob uma lente objetiva de 10x em primeiro lugar e, em seguida, usar uma lente de 60x de imersão em água para ver neurônios GCL e INL sob contraste de interferência diferencial (DIC) e / ou de epifluorescência. Para visualizar ZEC-expressando tdTomato, utilizar uma fonte de luz LED branco em combinação com um filtro de excitação de 554 nm e um filtro de emissão de 581 nm.

4. Whole-cell patch de gravação braçadeira de Flat-mount Retina

  1. Filtrar a solução através de um filtro interno da seringa no filamento aterro costume.
  2. Insira o filamento em uma micropipeta acabada de tirar e dispensar a solução interna perto da ponta até que a solução cobre o fio do eletrodo de prata para>5 mm. Fixar a micropipeta para um suporte de eléctrodo com uma vara de aspiração, através da qual a pressão no interior do eléctrodo pode ser ajustada, empurrando ou puxando o êmbolo de uma seringa de plástico de 10 ml ligado de tubo.
  3. Encontre a pipeta no âmbito do objectivo e trazê-lo para baixo para ~ 100 mm acima da retina. Sob o modo atual seguidor (I = 0), use DC offset para zero o sinal de tensão DC em pé. Meça a resistência da pipeta sob a pinça de corrente de modo (I Grampo) através da injeção de amplitude fixa correntes onda quadrada através da pipeta enquanto ele está no banho e neutralizar a diferença girando o botão rAcesse. Use a leitura na maçaneta rAcesse para calcular a resistência da pipeta pela lei de Ohm.
  4. levar lentamente o eletrodo para ~ 10 mm acima da retina. Aplicar a pressão positiva para o eléctrodo. Assista a mudança reflexão perto da ponta da pipeta quando se aproxima da retina. Rapidamente, mas com cuidado forçar a pipeta no GCL e reduzir o pressu positivare imediatamente.
  5. Mover a pipeta para um neurônio rotulados. Evite entrar em contato com outros neurónios, vasos sanguíneos e endfeet de células Muller. Aplique uma pressão mais positiva se for necessário para evitar o entupimento do eletrodo.
  6. Posicione a ponta da pipeta perto da linha média de um neurônio rotulados até uma covinha é visível. Solte a pressão positiva e permitir que a membrana plasmática para saltar de volta para a ponta da pipeta.
  7. Aplicar 20 a 120 pA correntes negativos para a pipeta para ajudar a formação de um selo giga-ohm. Aplicar uma sucção suave, se necessário, para puxar a membrana plasmática para a pipeta. Esperar 5 minutos após a formação de selo para romper a membrana celular. Isso permite que a solução interna derramado foi afastada pelo superfusão. Ruptura da membrana por uma sucção suave.
  8. Após a ruptura da membrana e ao mesmo tempo no modo de pinça de corrente, ligue o equilíbrio ponte e ajustá-lo usando o botão rAcesse.
    NOTA: Por uma pequena célula como o SAC, só é necessário ligeiro ajuste, se houver. Alterntivamente, ficha excitatórios e inibitórios correntes pós-sinápticos no modo braçadeira de tensão (V Grampo) por segurando o celular no potencial de reversão de cloreto de (cerca de -75 mV) e glutamato (em torno de 0 mV), respectivamente. Verifique e ajuste a posição da pipeta se necessário para acomodar retina ocasional e / ou deriva micromanipulador.
  9. Para registar o potencial de membrana ou alteração da corrente antes, durante e após o tratamento farmacológico, preparam sinápticas bloqueadores (por exemplo, CNQX, AP5, picrotoxina, tubocurarina, etc.) e moduladores do canal (por exemplo, flupirtina, dopamina, ácido meclofenâmico, etc.) em fresco o dia do experimento de stocks congelados. Diluir as drogas com solução carbogenated de Ringer. Aplicá-las de uma forma de lote por meio de perfusão.
  10. Após a gravação, remover suavemente a pipeta da soma. Transferir a montagem da câmara para um prato limpo. Desligar e voltar a ligar a retina para outra membrana de nitrocelulose achatados sem hol perfuradoES para assegurar o nivelamento da retina durante a fixação.
  11. Fixar a retina por imersão em 4% de paraformaldeído durante 30 min à TA. Remova a retina a partir da membrana de nitrocelulose e lave-o extensivamente com 1x PBS. Revelam a morfologia das células gravadas por O / N coloração com estreptavidina conjugado com corante diluídos em 1x PBS com 0,4% de Triton X-100 a 4 ° C 14. Monte a retina em meio Antifade e observar células gravado utilizando um microscópio de varredura confocal.
    NOTA: os procedimentos de paraformaldeído, que é volátil e tóxico, deve ser realizado em um projeto de câmara de segurança.

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Resultados

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Registos representativos de dentro e fora do tipo SACs de uma retina deafferentated rato são mostrados na Figura 1. As células colinérgicas em ambos GCL e INL podem ser identificados de forma confiável por tdTomato fluorescência e direcionados para de células inteiras de gravação patch-clamp sob DIC (Figura 1A) para revelar oscilação de seus potenciais de membrana (top traços) e as correntes sinápticas que dirigi-lo (traços inferiores, Figura 1B)...

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Discussão

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Muitos laboratórios têm gravado a partir de neurônios GCL na preparação 15-18 plana de montagem, mas os nossos procedimentos de permitir a gravação de neurônios do INL. Vimos por este meio enfatizar várias etapas que são críticas para as gravações de rotina bem sucedidas.

A frescura e achatamento da retina são importantes para penetrar com uma pipeta de gravação. A este respeito, a ligação firme da retina para a membrana de nitrocelulose perfurado é primordial e é conseguida pela ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos a Joung Jang e Xin Guan pela assistência técnica. Agradecemos ao Dr. Rory McQuiston, da Virginia Commonwealth University, por montar nosso primeiro patch clamp rig e conselhos sobre procedimentos experimentais. Agradecemos ao Dr. Samuel Wu pelas sugestões sobre o registro de grampo de tensão. O trabalho é apoiado por EY013811 de subsídios do NIH, EY022228 e um EY002520 de subsídios do núcleo de visão. C-KC é a cadeira dotada da Alice R. McPherson Retina Research Foundation no Baylor College of Medicine.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microscópio fluorescente de estágio fixo com DICOlympusBX51-WI
MicromanipuladoresSutterMP-225
Patch clamp amplificadorA-M SystemAM2400
AD conversorNational InstrumentNI-USB-6221
Controlador de aquecedorWarner InstrumentTC-324B
Inline aquecedorWarner InstrumentSC-20
Bomba peristálticaRaininDynamax
extrator de pipetasSutter InstrumentP-1000
Tubo de vidro com filamentoKing Precision GlassEstimulador personalizado
A.M.P.I.Master-8
BiocytinSigmaB4261
NaClSigma S6191
KClSigmaP5405
NaHCO3FisherBP328-1
Na2HPO4SigmaS0876
Na2HPO4SigmaS5011
CaCl2SigmaC5670
MgSO4SigmaM1880
D-glicoseSigmaG6152
K-gluconatoSigmaG4500
ATP-MgSigmaA9187
Li-GTPSigmaG5884
EGTASigmaE0396
HEPESSigmaH4034
KOHSigmaP5958
Cs-metanossulfonatoSigmaC1426
CsOHSigma232041
Seringa filtroNalgene171
1 ml seringaRainin
10 μ ponta de pipeta lGenesee Scientific24-130RL
Streptavidin-488ThermoFisherS-11223
10x PBSLonza17-517Q
17013002

Referências

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  1. Choi, H., et al. Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina. J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).
  2. Gregg, R. G., et al. Nyctalopin expression in retinal bipolar cells restores visual function in a mouse model of complete X-linked congenital stationary night blindness. J Neurophysiol. 98 (5), 3023-3033 (2007).
  3. Hellmer, C. B., Ichinose, T. Recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques. J Vis Exp. (96), (2015).
  4. Tu, H. Y., Bang, A., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. Increased dendritic branching in direction selective retinal ganglion cells in nob1 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (13), (2014).
  5. Tu, H. Y., Chen, Y. J., Chiao, C. C., McQuiston, A. R., Chen, C. K. J. Rhythmic membrane potential fluctuations of cholinergic amacrine cells in mice lacking ERG b-waves. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
  6. Demas, J., et al. Failure to maintain eye-specific segregation in nob, a mutant with abnormally patterned retinal activity. Neuron. 50 (2), 247-259 (2006).
  7. Tu, H. Y., Chen, Y. J., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. A Novel Retinal Oscillation Mechanism in an Autosomal Dominant Photoreceptor Degeneration Mouse Model. Front Cell Neurosci. 9, 513(2015).
  8. Borowska, J., Trenholm, S., Awatramani, G. B. An intrinsic neural oscillator in the degenerating mouse retina. J Neurosci. 31 (13), 5000-5012 (2011).
  9. Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Cellular origin of spontaneous ganglion cell spike activity in animal models of retinitis pigmentosa. J Ophthalmol. , (2011).
  10. Stasheff, S. F. Emergence of sustained spontaneous hyperactivity and temporary preservation of OFF responses in ganglion cells of the retinal degeneration (rd1) mouse. J Neurophysiol. 99 (3), 1408-1421 (2008).
  11. Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, 277(2015).
  12. Trenholm, S., et al. Intrinsic oscillatory activity arising within the electrically coupled AII amacrine-ON cone bipolar cell network is driven by voltage-gated Na+ channels. J Physiol. 590 (Pt 10), 2501-2517 (2012).
  13. Chen, C. K. J., et al. Cell-autonomous changes in displaced cholinergic amacrine cells lacking Gbeta5. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
  14. O'Brien, B. J., Isayama, T., Richardson, R., Berson, D. M. Intrinsic physiological properties of cat retinal ganglion cells. J Physiol. 538 (Pt 3), 787-802 (2002).
  15. Lee, S., et al. An Unconventional Glutamatergic Circuit in the Retina Formed by vGluT3 Amacrine Cells. Neuron. 84 (4), 708-715 (2014).
  16. Hoggarth, A., et al. Specific wiring of distinct amacrine cells in the directionally selective retinal circuit permits independent coding of direction and size. Neuron. 86 (1), 276-291 (2015).
  17. Margolis, D. J., Gartland, A. J., Singer, J. H., Detwiler, P. B. Network oscillations drive correlated spiking of ON and OFF ganglion cells in the rd1 mouse model of retinal degeneration. PLoS One. 9 (1), e86253(2014).
  18. Schmidt, T. M., Kofuji, P. An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells. J Vis Exp. (47), (2011).
  19. Ivanova, E., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Increased phosphorylation of Cx36 gap junctions in the AII amacrine cells of RD retina. Front Cell Neurosci. 9, 390(2015).
  20. Enoki, R., Koizumi, A. A method of horizontally sliced preparation of the retina. Methods Mol Biol. 935, 201-205 (2013).
  21. Akrouh, A., Kerschensteiner, D. Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina. J Neurophysiol. 114 (4), 2431-2438 (2015).
  22. Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).

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