Este protocolo demonstra como executar de células inteiras de gravação patch-clamp em neurônios da retina a partir de uma preparação flat-mount.
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Artigo de método
Patch-clamp gravação de células Starburst Amácrinas em um monte de Luxo Preparação de Deafferentated mouse Retina
Neste artigo
Resumo
Resumo
A retina dos mamíferos é um tecido em camadas compostas de vários tipos neuronais. Para entender como os sinais visuais são processados dentro de sua rede sináptica intrincado, registros eletrofisiológicos são frequentemente usados para estudar as conexões entre os neurônios individuais. Nós otimizamos uma preparação plana de montagem para a gravação de patch-clamp de neurônios geneticamente marcados em ambos GCL (camada de células ganglionares) e INL (camada nuclear interna) de retinas de ratos. Gravação de neurônios do INL em planos montagens é favorecido sobre fatias porque as conexões verticais e laterais são preservados na configuração anterior, permitindo que os circuitos da retina com grandes componentes laterais a ser estudado. Temos utilizado este procedimento para comparar as respostas dos neurônios-espelho-partnered em retinas tais como as células amácrinas starburst colinérgicos (ZEC).
Introdução
Como uma parte facilmente acessível do sistema nervoso central, a retina tem sido por décadas um modelo útil em estudos de neurociência. A marcação genética de neurônios permitiu a caracterização detalhada das conexões sinápticas na retina. Com muitas metodologias disponíveis para examinar a função e a morfologia dos neurônios da retina, a técnica de registro de patch clamp tem sido fundamental em nossa compreensão atual dos sinais transmitidos verticalmente na retina. Esses sinais são originados da absorção de fótons em fotorreceptores e enviados aos centros visuais cerebrais por meio do pico de células ganglionares da retina (RGCs). Apesar de um grande corpo de conh....
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Protocolo
A aprovação ética - procedimentos que envolvem indivíduos animais foram conduzidos de acordo com as regras e regulamentos dos Institutos Nacionais de diretrizes de saúde para animais de pesquisa, conforme aprovado pelo Institutional Animal Care e usar comitê de Baylor College of Medicine.
1. externa e Soluções Internas
- Usar a solução de Ringer de mamífero durante a dissecção retina e como a solução externa na gravação eletrofisiológico subsequente. Preparar a solução de Ringer de mamífero a partir de solução-mãe 10x (sem cálcio) no dia da gravação, e adicionar CaCl2 gota a gota, após 15 minutos de carbogenation (95% O 2 e 5% C....
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Resultados
Registos representativos de dentro e fora do tipo SACs de uma retina deafferentated rato são mostrados na Figura 1. As células colinérgicas em ambos GCL e INL podem ser identificados de forma confiável por tdTomato fluorescência e direcionados para de células inteiras de gravação patch-clamp sob DIC (Figura 1A) para revelar oscilação de seus potenciais de membrana (top traços) e as correntes sinápticas que dirigi-lo (traços inferiores, Figura 1B).......
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Discussão
Muitos laboratórios têm gravado a partir de neurônios GCL na preparação 15-18 plana de montagem, mas os nossos procedimentos de permitir a gravação de neurônios do INL. Vimos por este meio enfatizar várias etapas que são críticas para as gravações de rotina bem sucedidas.
A frescura e achatamento da retina são importantes para penetrar com uma pipeta de gravação. A este respeito, a ligação firme da retina para a membrana de nitrocelulose perfurado é primordial e é conseguida pela .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a Joung Jang e Xin Guan pela assistência técnica. Agradecemos ao Dr. Rory McQuiston, da Virginia Commonwealth University, por montar nosso primeiro patch clamp rig e conselhos sobre procedimentos experimentais. Agradecemos ao Dr. Samuel Wu pelas sugestões sobre o registro de grampo de tensão. O trabalho é apoiado por EY013811 de subsídios do NIH, EY022228 e um EY002520 de subsídios do núcleo de visão. C-KC é a cadeira dotada da Alice R. McPherson Retina Research Foundation no Baylor College of Medicine.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microscópio fluorescente de estágio fixo com DIC | Olympus | BX51-WI | |
| Micromanipuladores | Sutter | MP-225 | |
| Patch clamp amplificador | A-M System | AM2400 | |
| AD conversor | National Instrument | NI-USB-6221 | |
| Controlador de aquecedor | Warner Instrument | TC-324B | |
| Inline aquecedor | Warner Instrument | SC-20 | |
| Bomba peristáltica | Rainin | Dynamax | |
| extrator de pipetas | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Tubo de vidro com filamento | King Precision Glass | Estimulador personalizado | |
| A.M.P.I. | Master-8 | ||
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| NaCl | Sigma S6191 | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-1 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S0876 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| MgSO4 | Sigma | M1880 | |
| D-glicose | Sigma | G6152 | |
| K-gluconato | Sigma | G4500 | |
| ATP-Mg | Sigma | A9187 | |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Cs-metanossulfonato | Sigma | C1426 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Seringa filtro | Nalgene | 171 | |
| 1 ml seringa | Rainin | ||
| 10 μ ponta de pipeta l | Genesee Scientific | 24-130RL | |
| Streptavidin-488 | ThermoFisher | S-11223 | |
| 10x PBS | Lonza | 17-517Q |
Referências
- Choi, H., et al. Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina. J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).
- Gregg, R. G., et al.
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Reimpressões e permissões
