Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

उपचार के लिए रक्त रेटिना बैरियर से ब्रीच और संभावित दवाओं का मूल्यांकन के लिए एक तीव्र रेटिना मॉडल

Published: September 13, 2016 doi: 10.3791/54619
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rowan University, 2Department of Cell Biology, Rowan University School of Osteopathic Medicine

Summary

एक कम लागत, करने के लिए उपयोग में आसान और शक्तिशाली प्रणाली संभावित उपचार है कि रक्त रेटिना बाधा उल्लंघन हिस्टामिन से प्रेरित उन्नति कर सकता है मूल्यांकन करने के लिए स्थापित किया गया है। रक्त वाहिका रिसाव, मुलर सेल सक्रियण और neuronal प्रक्रियाओं की निरंतरता नुकसान प्रतिक्रिया और एक संभावित दवा, lipoxin ए 4 के साथ अपने उत्क्रमण का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है।

Introduction

सबूत के एक बढ़ती शरीर में रक्त रेटिना बाधा (BRB) 1-5 और रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) ​​6.7 करने के लिए समानता के अस्तित्व का समर्थन करता है। बीबीबी की समझौता कसकर ऐसे प्रलाप के रूप में 10 कारणतः या अल्जाइमर रोग (ई) के रूप में पुरानी neurodegenerative रोगों के लिए एक नैदानिक ​​मार्कर के रूप में जोड़ा गया है 8,9 और गंभीर स्थिति। इन विकृतियों और संभावित दवा लक्ष्यों के लिए खोजों में यंत्रवत अंतर्दृष्टि आम तौर पर मस्तिष्क की सीमित पहुंच और नेटवर्क जटिलता के द्वारा बाधा उत्पन्न कर रहे हैं। ऐसे में vivo इमेजिंग 11, मस्तिष्क organotypic संस्कृति 12, प्राथमिक सेल संस्कृतियों 13,14 और सह-संस्कृति प्रणालियों 15 के रूप में विकल्प उत्पन्न किया गया है। हालांकि, इन मॉडलों में से सबसे कोशिकाओं की पहचान के लिए विशेष उपकरणों, लंबी अवधि के प्रयोगात्मक या एकाधिक मार्कर की आवश्यकता होती है। BBB और BRB के बीच कार्यात्मक और संरचनात्मक समानता के साथ ही वि के बीच एक संबंधदो के sfunctions 16-19 तर्क दिया गया है। इसके अलावा, आसानी से उपयोग, अच्छी तरह से परिभाषित प्रकार की कोशिकाओं और एक बहुस्तरीय संरचना मस्तिष्क के लिए एक खिड़की के रूप में अच्छी तरह से विशेषता रेटिना की अनुमति दी है। BBB और BRB के संरचनात्मक और कार्यात्मक पहचान विस्तार से तुलना करने के लिए रहते हैं। हालांकि, रेटिना विकृतियों, विशेष रूप से BRB उल्लंघन भी कसकर विभिन्न रोगों की प्रगति, मधुमेह 18-19 और ई 21,22 सहित के साथ संबद्ध किया गया है। इस प्रकार, यह एक BRB शिथिलता प्रणाली न केवल तंत्र चित्रित करने के लिए, लेकिन यह भी संभावित दवाओं स्क्रीन करने के लिए स्थापित करने के लिए ब्याज की है। इस रिपोर्ट में, एक प्रोटोकॉल को सक्षम करने BRB एक सरल तीव्र रेटिना संस्कृति का उपयोग कर रोग विकसित और प्रस्तुत किया है।

वृद्धि की बीबीबी पारगम्यता और ई-जैसे रोग परिवर्तन एक मस्तिष्क organotypic संस्कृति हिस्टामिन, एक समर्थक भड़काऊ मध्यस्थ 12 के साथ incubated में स्थापित किया गया है। इसलिए, प्रस्तुत प्रणाली में, हिस्टामिन Appl थापूर्व vivo रेटिना संस्कृति को आइईडी BRB रोग को उत्पन्न करने के लिए। ऐसे मस मस्कुलस और बोस वृषभ के रूप में कई प्रजातियों से Retinas, परीक्षण किया गया है। अपने वाणिज्यिक उपलब्धता और मानव ऊतकों को समानता के कारण, ताजा स्वाइन आंखों डेटा यहां बताया प्रदान करने के लिए उपयोग किया गया। हिस्टामिन और / या अन्य दवाओं के साथ incubating के बाद, रेटिना ऐसे इम्यूनोग्लोबिन जी (आईजीजी), रक्त के प्रमुख घटकों में से एक के रूप में कई प्रोटीन 12, के लिए immunostaining द्वारा मूल्यांकन के लिए प्रोसेस किया गया; glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP), glial सक्रियण के लिए एक अच्छी तरह से जाना जाता मार्कर; और microtubule जुड़े प्रोटीन 2 (MAP2), एक न्यूरॉन विशिष्ट cytoskeletal प्रोटीन microtubule विधानसभा के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, रेटिना के स्तरित संरचना इस तरह उनकी चौड़ाई और निरंतरता में परिवर्तन के रूप में मुलर और गैंगलियन कोशिकाओं, की प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। इस प्रकार कई अतिरिक्त मापदंडों के परिणामों का आकलन करने के लिए उपलब्ध हैंएक प्रारंभिक चरण में है और साथ ही संभावित उपचार के उलट प्रभाव का मूल्यांकन करने के BRB उल्लंघन।

रक्त वाहिकाओं के रिसाव (BVS), glial कोशिकाओं की सक्रियता और neuronal कोशिकाओं की क्षति-प्रतिक्रिया: इस प्रोटोकॉल में, जांच की दवाओं के संभावित प्रभाव उलट तीन दृष्टिकोण से मूल्यांकन कर रहे हैं। कई मात्रा का ठहराव तरीकों का उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, अभिव्यक्ति के स्तर immunostaining, एक प्रक्रिया है और एक वृद्धि फिल्टर द्वारा दिखाया neuronal प्रक्रियाओं की निरंतरता की चौड़ाई माप की तीव्रता से दिखाया गया है। बेहतर तरीका वर्णन करने के लिए और मदद करने के लिए परिणामों की व्याख्या, lipoxin ए 4 (LXA4), endogenously भड़काऊ चोट के जवाब और endothelial रोग 23 attenuating में संश्लेषित एक यौगिक, प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए चुना गया है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी प्रोटोकॉल संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति जहां लागू की नीतियों के अनुपालन में किया गया।

1. तैयारी

  1. 75% के साथ स्थिरीकरण मीडिया तैयार Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM), 25% हैंक्स 'संतुलित नमक समाधान (HBSS)। -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक अच्छी तरह मिक्स, विभाज्य और दुकान।
  2. फॉस्फेट खारा बफर (पीबीएस) तैयार करें और autoclaving द्वारा बाँझ। कमरे के तापमान पर समाधान स्टोर। प्रयोग (अच्छी तरह से प्रति 5 एमएल) से पहले 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पीबीएस गर्म।
  3. 10%, 20% और पीबीएस में 30% sucrose तैयार करें। व्यक्तिगत रूप से नसबंदी के लिए अलग से 0.22 माइक्रोन फिल्टर भर में सभी समाधान फ़िल्टर। 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान बचाओ।
  4. 90 मिमी की एकाग्रता के लिए पीबीएस में हिस्टामिन शेयर समाधान तैयार है। 0.22 सुक्ष्ममापी फ़िल्टर पर छान कर समाधान जीवाणुरहित। अशेष और -80 डिग्री सेल्सियस पर समाधान बचाने के लिए। कई फ्रीज और पिघलना चक्र से बचें।
  5. प्रयोग से पहले पीबीएस में ताजा 4% paraformaldehyde (पीएफए) बनाओ। यह बर्फ पर रखें।
    सावधानी: एक धूआं हुड में पीएफए ​​रखें और उचित सुरक्षा उपकरण पहनने।
  6. स्थिरीकरण मध्यम (रेटिना के अनुसार 20 एमएल) पिघलना। 100 यू / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें। मध्यम (रेटिना के अनुसार 15 एमएल) 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्रयोग से पहले की गर्म हिस्सा है। बर्फ पर मध्यम के बाकी छोड़ दें।
  7. HBSS (रेटिना प्रति 10 मिलीलीटर) बर्फ पर रखें।

2. रेटिना Organotypic संस्कृति

  1. एक टिशू कल्चर हुड के लिए नमूने स्थानांतरण। लेंस के आसपास काटने से eyecup खोलें। एक ब्रश का प्रयोग, धीरे रेटिना पर खींच के बिना शीशे हास्य हटा दें। धीरे ऑप्टिक डिस्क का पर्दाफाश करने के लिए एक ब्रश के साथ कटौती बढ़त से रेटिना अलग। गंभीर एक रेजर के साथ ऑप्टिक तंत्रिका और रेटिना जारी।
  2. एक पेट्री डिश में रेटिना स्थानांतरण और ध्यान से रेटिना एक बार कुल्ला ठंड HBSS का उपयोग कर। HBSS में नमूना मैं पर रखेंसीई। के रूप में 2.1 चरण है और इस कदम को दोहरा द्वारा की जरूरत के रूप में कई रेटिना काटना।
  3. संतुलित रूप से एक रेजर के साथ आधे में रेटिना कट। धीरे अच्छी तरह से प्रति स्थिरीकरण मीडिया के 3 मिलीलीटर के साथ 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए नमूने हस्तांतरण। वातावरण युक्त 5% सीओ 2 के साथ एक मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए संतुलन की अनुमति दें।
  4. 2.3 कदम पर ऊष्मायन के दौरान निम्नलिखित अभिकर्मकों तैयार: गर्म माध्यम में वांछित एकाग्रता (450 माइक्रोन) के लिए हिस्टामिन शेयर समाधान पतला। 250 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए माध्यम में LXA4 (आर्गन के तहत संग्रहीत) भंग।
    नोट: जब LXA4 के प्रभाव को मापने के लिए एक एकल रेटिना से एक आधा, अकेले हिस्टामिन के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि अन्य आधा LXA4 साथ हिस्टामिन के लिए प्रयोग किया जाता है।
  5. स्थिरीकरण मध्यम ध्यान Aspirate और प्रत्येक अच्छी तरह से अच्छी तरह से (प्रति 3 एमएल) के लिए तैयार माध्यम जोड़ें। वातावरण युक्त 5% सीओ 2 के साथ एक मशीन में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं।
  6. कुल्लागर्म, बाँझ पीबीएस में एक बार नमूने हैं।

3. Immunostaining के लिए नमूने तैयार

  1. प्लेटों से महाप्राण पीबीएस। 4% पीएफए ​​(प्रति अच्छी तरह से 3 मिलीग्राम) जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  2. जल्दी पीएफए ​​aspirate। नमूने एक बार पीबीएस का उपयोग कुल्ला। 10% sucrose के लिए नमूने (अच्छी तरह से प्रति 5 एमएल) स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 से 4 घंटा के लिए सेते हैं।
  3. एक 30% सुक्रोज (अच्छी तरह से प्रति 5 एमएल) के लिए नमूने स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं। 20% sucrose के दो भागों के साथ वाणिज्यिक ठंड माध्यम से एक हिस्सा मिक्स काम कर ठंड मध्यम बनाने के लिए। यह 4 डिग्री सेल्सियस रात भर या उससे अधिक समय पर छोड़ दो हवा के बुलबुले गायब हो जाते हैं जब तक।
  4. काम कर ठंड मध्यम करने के लिए नमूने स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए संतुलन अनुमति देते हैं। आयतों में प्रत्येक रेटिना (लगभग 3 मिमी 5 मिमी) के द्वारा ट्रिम।
  5. ध्यान से काम कर ठंड मीडिया एक बेलनाकार कंटेनर (लगभग 1 सेमी त्रिज्या एक्स 2 सेमी ऊंचाई) देव में निहित में नमूने का स्थानांतरणएल्यूमीनियम पन्नी से ised। सुनिश्चित करें कि रेटिना स्लाइस खड़ी कर रहे हैं और उन्हें तरल नाइट्रोजन में फ्रीज (सेक्शनिंग पर रेटिना के एक पार अनुभाग प्रदान करने के लिए उन्मुख)। -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक पर ब्लॉक बचाओ।
  6. धारा 14 माइक्रोन मोटी स्लाइस में एक cryostat पर प्रत्येक ब्लॉक और गिलास स्लाइड पर वर्गों माउंट। -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक स्लाइड्स स्टोर।

4. Immunostaining

  1. 5% सूक्रोज फॉस्फेट बफर (एसपीबी, पीबीएस में 5% सूक्रोज, 7.4 पीएच) एक बार के साथ वर्गों को धो लें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए (10% सामान्य बकरी सीरम और 0.5% ट्राइटन X-100 के साथ 5% एसपीबी) अवरुद्ध बफर में वर्गों incubating द्वारा गैर विशिष्ट बंधन साइटों को ब्लॉक।
  2. 1 घंटे के लिए: (बफर अवरुद्ध में 500 GFAP या MAP2, 1 पर पतला) उचित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ (स्लाइड पर) वर्गों सेते हैं। समाधान Aspirate। 5% एसपीबी में तीन बार धोएं। अंतर्जात आईजीजी धुंधला के लिए, इस कदम को छोड़।
  3. इसी secon के साथ वर्गों सेते1 घंटे के लिए: Dary एंटीबॉडी (अवरुद्ध बफर में 800 Cyanine3 / FITC संयुग्मित गधा विरोधी माउस / विरोधी खरगोश आईजीजी, पर 1 पतला)।
  4. अच्छी तरह से 5% एसपीबी तीन बार के साथ वर्गों को धो लें। उन्हें बढ़ते मध्यम DAPI युक्त और coverslips के साथ कवर करने में बढ़ते द्वारा माइक्रोस्कोपी के लिए नमूने तैयार करें।
  5. ऐसी लेजर तीव्रता, लाभ मूल्य के रूप में समान मापदंडों के तहत एक 20x लेंस के माध्यम से एक लेजर confocal खुर्दबीन, छवियों पर कब्जा का प्रयोग, समय ध्यान केन्द्रित करना, समूहों में आदि। नीले चैनल के लिए / उत्तेजना उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य सेट 561/785 एनएम के रूप में (Cyanine3 पता लगाने के लिए), 408/447 एनएम के रूप में (DAPI पता लगाने के लिए) लाल चैनल के लिए और ग्रीन चैनल के लिए (FITC पता लगाने के लिए) 488/525 एनएम के रूप में ।

5. छवि विश्लेषण

  1. निम्नलिखित मानदंडों को 12 के अनुसार टपका हुआ रक्त वाहिकाओं का प्रतिशत यों: गिनती में खंड के विमान के भीतर endothelial सेल नाभिक के साथ ही रक्त वाहिकाओं को शामिल करें; एक रक्त वाहिका टपकाया पर विचार करता है, तो यह पता चलता एजीपोत के आसपास के immunostaining की radient।
  2. अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करने के लिए, हित के क्षेत्रों का चयन करें और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग मतलब ग्रे मूल्य को मापने।
  3. प्रक्रिया की चौड़ाई को मापने के लिए, अनुभाग जहां प्रक्रियाओं (बाहरी परमाणु परत, onl, उदाहरण के लिए) अलग कर रहे हैं के एक क्षेत्र चुनें। फिर एक ऑप्टिकल क्षेत्र जहां ऐसी प्रक्रियाओं दिखाई और लगातार कर रहे हैं चुनें। सूक्ष्म सेटिंग के अनुसार पैमाने पर पट्टी सेट प्रक्रिया भर में एक रेखा खींचना और माप प्रदर्शन करते हैं।
  4. प्रक्रिया की निरंतरता का विश्लेषण करने के लिए, ब्याज की चुनिंदा क्षेत्रों, फिल्टर जो अपने पड़ोस के विचरण के साथ प्रत्येक पिक्सेल की जगह से छवि में किनारों को बढ़ाता विचरण बुलाया लागू होते हैं, स्वचालित रूप से, इसके विपरीत और चमक को समायोजित लाइनों गिनती और गिनती को सामान्य क्षेत्र।
  5. एक दो पूंछ छात्र के टी -Test का उपयोग कर सांख्यिकीय महत्व की गणना। *, पी <0.05; **, पी <0.01; ***, पी <0.001। पीबहुत मतलब के रूप में परिणाम ± SEM के।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हम एक कम लागत, समय-कुशल और आसान करने के लिए उपयोग संभावित उपचार है कि BRB उल्लंघन हिस्टामिन से प्रेरित खिलाफ की रक्षा कर सकता है मूल्यांकन करने के लिए प्रणाली प्रस्तुत करते हैं। आईजीजी नियंत्रण रेटिना (चित्रा 1 ए) में वाहिकाओं के भीतर विवश है, लेकिन हिस्टामिन जोखिम (चित्रा 1 बी) पर रक्त वाहिकाओं, पुष्टि है कि मॉडल को सफलतापूर्वक स्थापित किया है से बाहर लीक।

LXA4 प्रस्तुत प्रणाली में BRB उल्लंघन के खिलाफ दवाओं के लिए स्क्रीनिंग प्रदर्शित करने के लिए चुना गया था। BRB शिथिलता LXA4 (चित्रा -1) है, जो अपने आप में कोई महत्वपूर्ण प्रभाव (चित्रा 1 सी) है के साथ उपचार पर तनु है। उत्क्रमण लीक रक्त वाहिकाओं के एक प्रतिशत के रूप में quantitated जाता है और परिणाम महत्वपूर्ण (चित्रा 1E) है। दो अन्य रेटिना सेल प्रकार, मुलर glial कोशिकाओं (चित्रा 2) और नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं ( (चित्रा 2 ई) GFAP धुंधला (चित्रा 2, एडी) के माध्यम से दिखाया की चौड़ाई में कमी पराजयों लेकिन नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (चित्रा 3 जी) में वृक्ष के समान प्रक्रियाओं की निरंतरता पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव है, के द्वारा दिखाया MAP2 धुंधला (चित्रा 3, एई)। यह भी कहा गया है कि या तो प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन का पता चला है।

आकृति 1
चित्रा 1:। रक्त रेटिना बैरियर Histamine जोखिम पर समझौता और LXA4 उपचार द्वारा बचाया जाता है आईजीजी immunostaining (लाल) रेटिना जो इलाज किया गया था (ए) से प्रस्तुत किया है, क्षति प्रेरित हिस्टामिन केवल (बी) के साथ, सी ही LXA4 के साथ इलाज ( ), या दोनों histam से अवगत करायाine और LXA4 (डी)। नियंत्रण (ए) और LXA4 इलाज (सी) के समूहों में, आईजीजी रक्त वाहिकाओं (BVS) हिस्टामिन समूह (बी) में रहते हुए, आईजीजी BVs जहां यह बिंदीदार हलकों ने संकेत दिया रिसाव बादलों रूपों से बाहर का पता चला है के भीतर ही सीमित है। LXA4 के आगे अलावा पोत रोग (डी) को बचाता है। स्केल बार, 20 माइक्रोन। (ई) का परीक्षण समूहों में टपकाया BVs के मात्रात्मक माप। सांख्यिकीय महत्व एक दो पूंछ छात्र के टी -Test से निर्धारित होता है। *, पी <0.05; **, पी <0.01; ***, पी <0.001। मतलब ± SEM (एन = 18) ग्राफ में साजिश रची है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: रोंग> मुलर सेल प्रक्रियाओं Histamine से समझौता किया और LXA4 उपचार। GFAP के लिए Immunostaining से बचाया हैं रेटिना जो इलाज किया गया था (ए) से प्रस्तुत किया है, क्षति प्रेरित दोनों हिस्टामाइन को हिस्टामिन केवल (बी) LXA4 केवल (सी) के साथ इलाज के साथ या उजागर और LXA4 (डी)। सकारात्मक धुंधला रेटिना के पार और BVs आसपास मुलर कोशिकाओं की प्रक्रिया में प्राप्त की है। स्केल बार, 20 माइक्रोन। (ई) सभी समूहों से मुलर सेल प्रक्रियाओं की चौड़ाई प्रस्तुत कर रहे हैं। करीब 30 अलग-अलग प्रक्रियाओं समूह प्रति मापा गया। सांख्यिकीय महत्व एक दो पूंछ छात्र के टी -Test से निर्धारित होता है। *, पी <0.05; **, पी <0.01; ***, पी <0.001। मतलब ± SEM (एन = 30) ग्राफ में साजिश रची है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

टी "के लिए: रखने together.within-पेज =" 1 "> चित्र तीन
चित्रा 3: नाड़ीग्रन्थि सेल प्रक्रियाओं की निरंतरता LXA4 से प्रभावित नहीं है। (ए) के खिलाफ MAP2 Immunostaining रेटिना जो इलाज (ए) था से प्रस्तुत किया है, क्षति प्रेरित हिस्टामिन केवल (बी) LXA4 केवल (सी) के साथ इलाज के साथ या दोनों हिस्टामिन और LXA4 (डी) से अवगत कराया। सकारात्मक धुंधला प्रक्रियाओं और नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की कोशिका निकायों में प्राप्त की है। MAP2 धुंधला (ई) एक साथ अपनी इसी फिल्टर बढ़ाया छवि (एफ) के साथ की एक नमूना छवि प्रस्तुत किया है। निरंतर प्रक्रियाओं तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं। स्केल बार, 20 माइक्रोन। (G) सभी समूहों से निरंतर, MAP2 पॉजिटिव नाड़ीग्रन्थि सेल प्रक्रियाओं का घनत्व प्रस्तुत कर रहे हैं। सांख्यिकीय महत्व एक दो पूंछ छात्र के टी -Test से निर्धारित होता है। *, पी <0।05; **, पी <0.01; ***, पी <0.001। मतलब ± SEM (एन = 18) ग्राफ में साजिश रची है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies  11965-092
HBSS Life Technologies  14170-112
Sucrose J.T.Baker 4072-05
Histamine  Sigma H7125-1G
Penicillin-Streptomycin  Invitrogen
PFA Electron Microscopy Sciences 15710
Freezing Media  Triangle Biomedical Sciences TFM-5
Normal Goat Serum  Rockland D104-00-0050
Triton X-100 Sigma T8787
GFAP Antibody Millipore AB5804
MAP2 Antibody EMD Millipore MAB3418
FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-095-152
Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 715-165-150
mounting medium containing DAPI Vector Laboratories, Inc. H-1200
Laser Confocal Microscope Nikon Eclipse Ti microscope
ImageJ National Institutes of Health 1.45s

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3 (2011).
  2. Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
  3. Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
  4. Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).
  5. Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
  6. Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782 (2013).
  7. Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
  8. Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
  9. Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
  10. Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10 (2015).
  11. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
  12. Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148 (2015).
  13. Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188 (2014).
  14. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33 (2013).
  15. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  16. Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
  17. Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
  18. Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
  19. Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202 (2011).
  20. Kolb, H. How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
  21. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
  22. Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055 (2010).
  23. Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
  24. Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
  25. Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).

Tags

चिकित्सा अंक 115 रक्त रेटिना बाधा रेटिना संवहनी रोग हिस्टामिन lipoxin ए 4 मुलर सेल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं
उपचार के लिए रक्त रेटिना बैरियर से ब्रीच और संभावित दवाओं का मूल्यांकन के लिए एक तीव्र रेटिना मॉडल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, H., Rodriguez, A. R., Spur, B.… More

Wu, H., Rodriguez, A. R., Spur, B. W., Venkataraman, V. An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment. J. Vis. Exp. (115), e54619, doi:10.3791/54619 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter