Artigo de método

Rápida aquisição de imagens 3D usando de alta resolução episc Microscopia

DOI:

10.3791/54625

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21 de novembro de 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, The Second Affiliated Hospital & Yuying Children's Hospital, Wenzhou Medical University, 2Departments of Urology, Boston Children's Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Descrevemos um protocolo detalhado usando microscopia episcópica de alta resolução para adquirir imagens tridimensionais (3D) de embriões de camundongos. Este protocolo aprimorado utiliza um método de preparação de tecido modificado para aumentar a penetração do corante fluorescente, permitindo assim a análise morfométrica de espécimes pequenos e grandes.

Resumo

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A tecnologia microscópica episcópica de alta resolução (HREM) permite a aquisição rápida de dados morfométricos volumétricos e tridimensionais (3D) digitais de alta resolução. Aqui, descrevemos o protocolo detalhado para obter imagens de todo o embrião de camundongo. O protocolo consiste em quatro seções principais: preparação da amostra, incorporação, aquisição de imagens e, finalmente, visualização 3D. A tecnologia exige que as amostras sejam coradas com um corante fluorescente, o que pode ser problemático para amostras grandes ou densas. Para superar essa limitação, melhoramos o protocolo existente para aumentar a penetração do corante no tecido, pré-tratando a amostra com uma solução contendo uréia e dodecil sulfato de sódio. O protocolo usa apenas equipamentos e reagentes de laboratório de rotina para facilitar a adaptação em ambientes laboratoriais padrão. Mostramos que as imagens 3D de alta resolução resultantes recapitulam fielmente as características morfológicas detalhadas dos órgãos internos de embriões de camundongos, permitindo assim análises morfométricas. Juntos, apresentamos um protocolo detalhado e aprimorado usando equipamentos de laboratório padrão para adquirir imagens 3D de alta resolução de espécimes de pequeno e grande porte.

Introdução

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O advento das tecnologias de imagem 3D abriu a possibilidade de análise sistêmica de características morfológicas detalhadas durante o desenvolvimento fetal. Uma variedade de modalidades de imagem 3D está agora disponível, incluindo imagem por ressonância magnética micromagnética (micro-MRI), microtomografia computadorizada, ultrassom de alta frequência, tomografia de coerência óptica, tomografia de projeto óptico e microscopia episcópica1-4. Cada modalidade tem suas próprias características únicas em resolução, contraste, velocidade, custo, capacidade e disponibilidade no útero.

A captura de imagem de fluorescência episcópica (EFIC) e a microscopia episcópica de alta resolução (HREM) são métodos de imagem de microscopia episcópica4. Aqui, imagens seriais de alta resolução são capturadas continuamente da face do bloco em vez de seções de tecido. As imagens resultantes refletem fielmente características morfológicas detalhadas com mínima ou nenhuma distorção tecidual. Os dados volumétricos adquiridos são prontamente convertidos em imagens 3D de alta resolução adequadas para análise morfométrica precisa. Devido ao custo relativamente baixo e à alta resolução, HREM e EPIC tornaram-se as alternativas superiores para avaliação sistêmica de modelos de camundongos de defeitos congênitos humanos2,4-8.

Ambos os métodos EFIC e HREM exigem que as amostras sejam incorporadas no meio adequado. O EFIC detecta a autofluorescência emitida pelo tecido incorporado. Por causa disso, é limitado a espécimes que emitem altos níveis de autofluorescência, mas não aqueles com autofluorescência relativamente fraca, como embriões em estágio inicial9. Para superar a dependência da autofluorescência, as amostras são coradas com um corante fluorescente, como a eosina, para imagens HREM. As escolhas de corantes e métodos de coloração também tornam o HREM mais compatível para detectar sinais moleculares no contexto da arquitetura e morfologia do tecido4,10.

Neste artigo, apresentamos um protocolo HREM aprimorado adequado para avaliação de corpo inteiro de embriões de camundongos em estágio avançado. Para facilitar a coloração, incluímos uma etapa de pré-tratamento para aumentar a penetração do tecido, permitindo assim a imagem HREM de embriões de camundongos mais velhos.

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Protocolo

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Todas as utilizações de animais são aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal do Hospital Infantil de Boston.

Preparação 1. Amostra

  1. acasalamento cronometrada
    1. Coloque um C57BL6 tipo selvagem macho e uma fêmea juntos na mesma gaiola.
    2. Verifique para a formação de um tampão genital cedo na manhã seguinte. A ficha de acasalamento (aka, vaginal ou a ficha cópula) é uma deposição gelatinosa endurecido que bloqueia a vagina.
    3. Defina a data plugue como embrionária dia 0,5 (e0.5).
  2. O isolamento de embriões de ratinho
    1. Eutanásia fêmeas grávidas por asfixia com CO2.
    2. Coloque ratos supina sobre uma almofada absorvente e spray região abdominal com etanol 70%.
    3. Levante a pele e fazer uma incisão 5 milímetros inicial na região abdominal caudal usando uma tesoura cirúrgica. Cortar e remover a pele abdominal para expor totalmente os órgãos internos
    4. Corte perto vagina para remover todo o útero.
    5. Cortar entre locais de implantação ao longo do corno uterino. Cada segmento ou concepto deve ter apenas um embrião dentro.
    6. Manter os segmentos uterinas em 1x fosfato gelada solução salina tamponada (PBS).
  3. dissecção embrião
    1. Coloque cada concepto em um prato separado com PBS gelado sob um estereoscópio.
    2. Remover os tecidos uterinos, placenta e, em seguida, membranas fetais utilizando sequencialmente fórceps de dissecação finas.
    3. Transferir o embrião dissecados para um tubo de 50 ml com 1 x PBS gelado utilizando uma pipeta de transferência grande. Evitar a captação de embriões diretamente com uma pinça para minimizar os danos do tecido.
  4. Fixação
    1. Fixar os embriões dissecados em solução de formalina tamponada neutra a 10% a 4 ° C durante mais de 24 horas, com pelo menos 10 volumes de amostra de fixador.
  5. Pré-tratamento
    1. Preparar a solução de Compensação: 4M de ureia, 10% glicerol, 4% de dodecilsulfato de sódio (SDS) em água duplamente destilada.
    2. Substitua o fixador com a Solução de Compensação.
    3. Rodar suavemente a amostra num agitador à temperatura ambiente durante 1 - 2 semanas. Trocar a solução de compensação uma vez que no segundo e no terceiro dia. O espécime lentamente torna-se clara e translúcida.
    4. Substitua a solução de Compensação com formalina a 10% e deixar em uma cadeira de balanço para 2 dias.
  6. Desidratação
    1. Lavam-se as amostras pré-tratadas com 1x PBS 3 vezes durante 5 minutos cada.
    2. Desidratar as amostras em uma série de etanol ascendente à temperatura ambiente em uma cadeira de balanço suave. Para os embriões E15.5, usar uma série ascendente de etanol incluindo 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% e 100% de etanol, 2 horas cada passo. Para os embriões mais velhos, o tempo de incubação deve ser aumentada.
  7. coloração
    1. Prepare Coloração Solução: adicione 0.1375 gramas de Eosina Y Disodium Sal e 0,0275 gramas de hemi laranja de acridina (cloreto de zinco) sal a 50 ml de etanol a 100%. Agita-se durante 2 h. Filtrar com papel de filtro. Armazenar à temperatura ambiente e evitar a luz, cobrindo com papel alumínio.
    2. Transferência da amostra para a solução de coloração, durante 1 h.
    3. Substitua com solução de coloração fresca e durante a noite mancha.
  8. Infiltração
    1. Prepare Infiltração Solução: combinar 100 ml de solução A de JB-4 kit de incorporação, 1,25 g de Catalisador C, 0,275 g de sal dissódico Eosina Y e 0,055 g de hemi laranja de acridina (cloreto de zinco) sal. Mexa para misturar (200 rpm) em um balde de gelo, durante 2 horas, e em seguida, filtrar com papel de filtro.
    2. Guardar a solução A infiltração a 4 ° C e evitar a luz através da cobertura com uma folha de alumínio.
    3. Transferir os embriões à infiltração de solução: Solução de coloração (1: 1), e incuba-se durante pelo menos 3 horas num agitador rotativo a 4 ° C.
    4. Transferir os embriões à infiltração solução e incubar durante 3 hR num agitador numa sala fria.
    5. Substitua Infiltração Solution uma vez por dia, e deixar em uma sala fria em uma cadeira de balanço suave por mais três dias.

2. Embedding

  1. Mantenha Solução B e infiltração Solution no gelo.
  2. Faça Embedding Solution (01:25 de Solução B e infiltração Solution) imediatamente antes da incorporação.
  3. Orientar a amostra em um molde de incorporação, em seguida, despeje Solution Embedding frio no molde incorporando delicadamente. Re-orientar com um pino, se necessário.
  4. Use um pino para examinar se a solução Embedding é solidificado. Empurrar para fora o bloco da amostra, e prepará-la, se necessário.
  5. Reorientar o bloco da amostra usando o molde separado para obter uma orientação cruzada.
  6. Coloque um suporte de bloco em cima do molde de incorporação. Derramar delicadamente Embedding Solução para dentro do molde até que o molde e o suporte do bloco estão submersos por Incorporação Solution.
  7. Mantenha a amostra em um recipiente secundário e deixá-loem gelo durante 3-4 horas numa hotte.
  8. Armazenar as amostras solidificadas numa 4 ° C.
  9. Descascar o molde de incorporação. Coloque o bloco sob o microscópio estereoscópico com iluminação oblíqua para inspecionar posição da amostra no bloco. Na face do bloco, linhas de grade marca ao redor do espécime.
  10. Apare o bloco para remover montante acesso de material de incorporação utilizando as linhas de grade marcado como referências.

3. Aquisição de Imagem

  1. Prender o bloco de amostra para o micrótomo e obter uma superfície de corte fresco. Definir espessura de corte (por exemplo, e9.5-10.5, 1,5 uM; e11.5-12.5, 2,0 uM; e13.5-15.5, 2,5 uM; E16.5-idosas, 3? M). Mantenha o espécime / bloco na posição inicial de micrótomo.
  2. Montar o microscópio estéreo zoom horizontal voltada para a superfície do bloco de amostra.
  3. Ligue o computador e microscópio, e iniciar o software de aquisição de imagem.
  4. Visualizar e focar as óticas para o bloco-faceno modo "live view" do software de imagem.
  5. Alinhar microscópio e micrótomo, se necessário, para que o bloco de face é no centro do visor.
  6. Ajuste o zoom de modo que todo o bloco-face está dentro do visor.
  7. Escolha filtro verde proteína fluorescente (GFP) (excitação 470 ± 20 nm, dicróica 495 nm, emissão de 525 ± 25 nm) e reorientar, se necessário.
  8. Medir e definir o tempo de exposição manualmente (por exemplo, 80-400 mini-sec).
  9. Adquirir imagens do bloco-face depois de cada corte fresco e guardar as imagens automaticamente, se possível.
  10. Grave parâmetros importantes, incluindo resolução, espessura de corte e zoom.
  11. Depois de terminar o espécime inteiro, exportação e converter todos os arquivos de imagem para o formato JPEG, se necessário.
  12. Inverter todas as imagens originais usando um software de processamento de imagens e ajustar o brilho eo contraste.
  13. Salve todas as imagens processadas em uma pasta separada.

4. 3DVisualização

  1. Carregar todos os as imagens transformadas para um software de visualização 3D, seguindo as instruções.
  2. Resolução de entrada e espessura de corte para converter todas as imagens para dados volumétricos (ou seja, o tamanho voxel) e salve o arquivo 3D.
  3. Alinhar todas as imagens utilizando o modo automático. Ajustar imagens individuais manualmente, se necessário.
  4. Salve a imagem alinhada com um novo nome de arquivo.
  5. Analisar as características morfométricas da amostra usando o software de visualização 3D.

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Resultados

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Nós relatamos imagens HREM alta qualidade de embriões de rato entre E9.5 e E13.5 8. A qualidade de imagem dos embriões final faseada, no entanto, é significativamente comprometida devido à penetração nos tecidos limitada do eosina corante fluorescente. Para aumentar a eficiência de coloração, testámos vários métodos de pré-tratamento que são compatíveis com imagens fluorescentes 11. Especificamente, os embriões de camundongos E15.5 foram tratados com Sca / e A2

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Discussão

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Aqui, apresentamos um protocolo modificado utilizando equipamentos de laboratório de rotina para obter imagens HREM de série que são compatíveis para uma rápida visualização 3D e análises morfométricas de estruturas complexas. Porque as imagens de alta resolução são tomadas diretamente da face do bloco, em vez de seções individuais, as características morfológicas finas são preservados e rapidamente reconstruída digitalmente em um programa de visualização 3D.

imagens 3D oferece vantagens sig...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos aos Drs. Yichen Huang, Chunming Guo e Zhenfang Zhou por seu suporte técnico. Esta pesquisa foi financiada pelo NIH / NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) e pela American Heart Association (AHA, 13GRNT16950006, XL).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
RatosThe Jackson LaboratoryC57BL6
Álcool EtílicoPharmco-Aaper111000200200 Provas, Absoluto, ACS/USP/Kosher
Grau FormalinaSigmaHT501128-4L
UreiaSigmaU5128Solução de Limpeza
GlicerolFisher scientificG33-4
Dodecil Sulfato de SódioInvitrogen15525-017Solução de Limpeza
Eosina Y Sal DissódicoFisher scientificBP241925Solução de Infiltração
Acridina Laranja hemi (cloreto de zinco) salSigmaA6014Solução de Infiltração
Papel WhatmanGE3030-153
JB-4 Kit de Incorporação - Solução APolysciences, Inc.0226A-800Solução de Infiltração
JB-4 Kit de Incorporação - Solução BPolysciences, Inc.0226B-30Solução de Incorporação
JB-4  Kit de Incorporação - CatalystPolysciences, Inc.02618-12Solução
de Infiltração de Moldes de IncorporaçãoPolysciences, Inc.23185-116 x 8 mm
Peel-A-Way Moldes de Incorporação AfiadosPolysciences, Inc.18986-122 mm x 22 mm quadrado, truncado para 12 mm x 12 mm
JB-4  Suportes de bloco de plásticoPolysciences, Inc.15899
Tubos de Transferência Graduados DescartáveisVWR414004-014
Prato de PetrlVWR25384-088Pinça de Dissecção de Embriões
Ponta de Inox  Pinça de Tecido Graefe paraDissecção de EmbriõesRS-5015
ROBOZRS-5153Tesoura
de Operação Delicada para Dissecção de Embriões ROBOZRS-6700Dissecção de embriões
14 ml Tubos de fundo redondo de polipropilenoFalcon352059
Tubos cônicos de polipropileno de 50 mlFalcon352098
Balde de geloMagic Touch Iceware International Corp.R19-343
100 ml (3,4 onças) Barcos de pesagem de poliestireno antiestáticoVWR89106-766
330 ml (11,2 oz.) Poliestireno antiestático pesa barcosVWR89106-770
Cloreto de sódioMP Biomedicals102892Solução PBS
Cloreto de potássioSigmaP0662Solução PBS
Fosfato de potássio monobásicoSolução SigmaP5405PBS
Fosfato de sódio dibásico heptahidratadoSigma-AldrichS9390PBS
Câmera digitalHamamatsu PhotonicsC11440-10C
MicrótomoLeicaRM2265
IluminadorCarl ZeissHXP 200C
Microscópio de zoom estéreo de fluorescênciaCarl ZeissAxio Zoom.V16
Microscópio estéreoOlympusSZX16
Fonte de luz de fibra ópticaLeicaKL 1500 LCD
Lâmina de micrótomo descartávelVWR95057-832
Dispensador de borda únicaPersonna62-0330-0000
ZENCarl Zeisspro 2012
PhotoshopAdobeCS6 v13.0
Amira 3D SoftwareVisage Imaging5.4
ComputadorDell T7600, disco rígido SAS de 2 x 900 GB e memória
Agitadores de plataforma oscilanteVWR40000-304
Agitador de placa quente padrãoVWR12365-382
Balança analíticaMettler ToledoAB54-S
ROBOZ Solução DDR3 RDIMM de 64 GB

Referências

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  4. Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
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  14. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).

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