Простой механический Процедура создания лимбальных Дефицит стволовых клеток у мышей
Summary
В следующей статье дается легко воспроизводимый метод для эффективного создания устойчивой модели мыши дефицита лимбальных стволовых клеток (LSCD). Эта модель животных полезна при тестировании и сравнения эффективности лечения заболеваний лимбальных стволовых клеток.
Abstract
Дефицит лимбальных стволовых клеток (LSCD) представляет собой состояние неисправности или потере лимбальных эпителиальных стволовых клеток, после чего эпителий роговицы заменяется конъюнктивы. Пациенты страдают от повторяющихся дефектов роговицы, боль, воспаление и потеря зрения.
Ранее мышиной модели LSCD была описана и по сравнению с двумя другими моделями. Цель состояла в том, чтобы произвести последовательную модель мыши LSCD, что оба имитирует фенотип у человека и длится достаточно долго, чтобы сделать возможным изучение патофизиологии болезни и оценить новые методы лечения. Здесь, метод описан более подробно.
Моторизованные инструмент с вращающимся заусенцев предназначен для удаления ржавчины кольца с роговичной поверхности или сгладить крыловидной кровать у пациентов. Это подходящее устройство для создания желаемой модели LSCD. Это легко доступный, простой в использовании инструмент с тонким наконечником, что делает его подходящим для работы на маленьких глаз, посколькуу мышей. Его применение предотвращает ненужную травмы глаз, и это не приводит к нежелательным травмам, как это часто бывает с моделями химического повреждения. В отличие от тупого скребка, он удаляет эпителий с базальной мембраной. В этом протоколе, лимбальных район был истирается два раза, а затем весь эпителий роговицы была выбрита от лимба до лимба. Во избежание травм стромы, были приняты меры, чтобы не чистить поверхность роговицы после того, как эпителий уже была удалена.
Introduction
Эпителий роговицы требуется для поддержания ясности и целостности роговицы. Он постоянно обновляется на протяжении всей жизни эпителиальными стволовыми клетками, проживающих в лимба-узкой зоне на стыке роговицы и конъюнктивы. Эти самообновляющихся лимбал стволовые клетки играют важную роль в регенерации эпителия роговицы, как правило, и после травмы. Частичное или полное истощение этих стволовых клеток будет приводить к рецидивирующих эрозий роговицы, боль, рубцевания роговицы и неоваскуляризации, появление бокаловидных клеток, и если его не лечить, роговице слепоте. Это состояние известно как дефицит лимбальных стволовых клеток (LSCD) и может быть идиопатической; наследственным; или приобретенные в результате химических или термических повреждений, долгосрочные ношения контактных линз, и хронического воспаления 1-6.
Исследование LSCD требует подходящей животной модели, которая не только подражает болезнь у людей, но является воспроизводимым и устойчивым, с меньшей мере,монтирование вреда другим роговицы и глазного структур. Эта модель необходима для оценки лечения и уточнения механизмов болезни на молекулярном и клеточном уровнях. Как было описано до 1, с использованием вращающегося заусенцев, можно легко разработать модель мыши LSCD , который показывает вышеупомянутые преимущества и сохраняется в течение не менее трех месяцев. Целью данного исследования является представить простой, воспроизводимой и устойчивой модели на мышах LSCD.
Вращающийся заусенцев представляет собой удобный инструмент , который равномерно удаляет эпителий , не повредив основную строму 1. Он был использован для индукции центрального участка роговицы эрозии 7, 8 в заживлении ран исследований. Методика настоящим представил создать LSCD в мыши не сообщалось ранее. Ранее введены методы соскоба эпителия с тупым результате шпателем в менее равномерном травмы, особенно у лимба-и более переменной фенотипу 1, 9, с большим восстановление Oе нормальный эпителий роговицы 1. В отличие от тупого скребка, вращающаяся заусенцев удаляет эпителиальный базальную мембрану а также 7, 8, 10. Другие сообщения методы разрывать стволовых клеток включают в себя использование химических веществ, таких как гидроксид натрия, н-гептанол, и хлорид бензалкония, который не только может вызвать нежелательное повреждение к нижележащим структур глаза, но и может привести к значительным воспалением и последующим роговичного помутнения или эпителиальной плоскоклеточной метаплазии 11-15. Вращающийся заусенцев не связано с этими серьезными осложнениями. Хирургически удаления лимбальную эпителий, в одиночку или с использованием химических веществ 10, 11, 16, является более трудным для выполнения и не самый лучший вариант у животных с маленькими глазами и тонким лимбальных эпителии (например , мышей). Кроме того, как ни удивительно, limbectomy все еще может оставить некоторые лимбальных эпителия позади 10.
Описанные ниже методика приводит к LSCD с неоваскуляризации А.Н.d conjunctivalization, имитирующее представление полного LSCD у больных и длится в течение по крайней мере трех месяцев 1. Она подходит для тех, кто стремится изучить LSCD или заживлении ран патофизиологии, иммунологии и потенциальных методов лечения у мышей. Возможно, с некоторыми изменениями, эта процедура может быть выполнена у крыс и кроликов 10. По мере того как вращающаяся заусенцев эффективно удаляет эпителий, оно может быть использовано в любых исследований, относящихся к роговичного эпителиального истиранию / ранении и в любых связанных с лечения или исследований по молекулярной биологии.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной статье описывается воспроизводимой и относительно простой метод, чтобы создать модель мыши LSCD. Есть несколько важных аспектов этой модели, которые стоит отметить. Во- первых, в отличие от моделей , которые используют химические вещества , 11, 12, травма в первую очередь вклю?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Рут Zelkha, MS, за ее щедрую помощь в визуализации. Это исследование было поддержано Программа развития клинический научный сотрудник премии K12EY021475 М.Е., грант R01 EY024349-01A1 на ARD, основной грант EY01792 из Национального института глаза, NIH, и неограниченный грант от исследований, чтобы предотвратить слепоту. ARD является получателем премии в области развития карьеры от исследований по профилактике слепоты.
Materials
| Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover | Rumex International Co, Clearwater, FL | 16-141 | 0.5 mm burr. Also available from other companies. |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M691 | |
| Digital camera | Nikon, Thailand | ||
| Nikon FS-2 slit lamp | Nikon, Japan | ||
| Polyclonal anti-CK12 antibody | Santa Cruz Blotechnology, CA, | SC-17101 | 1:100 concentration |
| Monoclonal anti-CK8 antibody | TROMA-I-s, Iowa City, IA | AB_531826 | 1:50 concentration |
Referências
- Afsharkhamseh, N., et al. Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice. Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).
- Dorà, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence. Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).
- Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. The culture and transplantation of human limbal stem cells. J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation. Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).
- He, H., Yiu, S. C. Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies. Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).
- Amirjamshidi, H., et al. Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency. Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).
- Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).
- Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).
- Ma, Y., et al. Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).
- Bu, P., et al. Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury. Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).
- Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns. J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).
- Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
- Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).
- Liu, C. Y., et al. Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development. Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).
- Nakatsu, M. N., González, S., Mei, H., Deng, S. X. Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency. Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).
- McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).
