Un procedimiento mecánico simple de crear deficiencia de células madre limbares en ratón

Resumen

El siguiente artículo proporciona una técnica sencilla, reproducible para crear efectivamente un modelo sostenible de ratón de la insuficiencia límbica (SIL). Este modelo animal es útil para probar y comparar la eficacia de los tratamientos para las enfermedades de las células madre del limbo.

Resumen

insuficiencia límbica (SIL) es un estado de mal funcionamiento o pérdida de las células madre epiteliales del limbo, después de lo cual el epitelio corneal se reemplaza con la conjuntiva. Los pacientes que sufren de defectos corneales recurrentes, dolor, inflamación y pérdida de la visión.

Anteriormente, se ha descrito un modelo murino de SIL y se comparó con otros dos modelos. El objetivo era producir un modelo de ratón consistente de SIL que tanto imita el fenotipo en los seres humanos y dura el tiempo suficiente para que sea posible estudiar la fisiopatología de la enfermedad y evaluar nuevos tratamientos. Aquí, la técnica se describe en más detalle.

Una herramienta motorizada con una fresa rotativa ha sido diseñado para eliminar los anillos de óxido de la superficie de la córnea o para alisar la cama pterigión en los pacientes. Es un dispositivo adecuado para crear el modelo SIL deseado. Se trata de una herramienta de fácil de usar fácilmente disponible con una punta fina que la hace apropiada para trabajar en pequeños ojos, comoen ratones. Su aplicación evita trauma innecesario a la vista y que no da lugar a lesiones no deseados, como a menudo es el caso de modelos de lesión química. A diferencia de un raspador romo, que elimina el epitelio con la membrana basal. En este protocolo, la zona del limbo fue pulida dos veces, y luego todo el epitelio corneal se afeitó de limbo a limbo. Para evitar lesiones estroma, se tuvo cuidado de no rozar la superficie de la córnea una vez que el epitelio ya se había eliminado.

Introducción

Se requiere que el epitelio de la córnea para mantener la claridad y la integridad de la córnea. Se renueva constantemente durante toda la vida de las células madre epiteliales que residen en el limbo-una zona estrecha en la unión de la córnea y la conjuntiva. Estas células madre limbares auto-renovación juegan un papel crucial en la regeneración del epitelio corneal, tanto normalmente y después de la lesión. agotamiento parcial o completa de estas células madre dará lugar a erosiones corneales recurrentes, dolor, cicatrización de la córnea y la neovascularización, la apariencia de las células caliciformes, y si se deja sin tratar la ceguera, la córnea. Esta condición se conoce como insuficiencia límbica (SIL) y puede ser idiopática; hereditario; o adquirida debido a las lesiones químicas o térmicas, lentes de contacto a largo plazo desgaste, y la inflamación crónica ^1-6.

La investigación sobre SIL requiere un modelo animal adecuado que no sólo imita la enfermedad en los seres humanos, pero es reproducible y sostenible, con el mínimo de unamonte de lesiones en otras estructuras de la córnea y oculares. Este modelo es necesaria para evaluar los tratamientos y para aclarar los mecanismos de la enfermedad a nivel molecular y celular. Como se ha descrito antes de ^1, con el uso de una fresa giratoria, se puede desarrollar fácilmente un modelo de ratón de LSCD que cuenta con las ventajas antes mencionadas y persiste durante al menos tres meses. El objetivo de este estudio es presentar un modelo simple, reproducible y sostenible del ratón de SIL.

La fresa de rotación es una práctica herramienta que elimina de manera uniforme el epitelio sin dañar el estroma subyacente ^1. Se ha utilizado para inducir la erosión corneal central ^{7, 8} en los estudios de cicatrización de heridas. La técnica de la presente-presentado para crear LSCD en un ratón no se ha informado antes. Anteriormente introducido métodos de raspar el epitelio con un resultado espátula roma en una lesión menos uniforme, particularmente en el limbo y un fenotipo más variable ^{1, 9,} con más o restauraciónf epitelio corneal normal de ^1. A diferencia del raspador romo, la rebaba giratorio elimina la membrana basal epitelial, así ^{7, 8, 10.} Otros métodos reportados por separar las células madre implican el uso de productos químicos, tales como hidróxido de sodio, n-heptanol, y cloruro de benzalconio, que no sólo puede inducir lesión no deseado a las estructuras del ojo subyacentes, sino que también puede conducir a la inflamación significativa y posterior opacificación corneal o epitelial metaplasia escamosa ^11-15. La rebaba de rotación no está asociado con estas complicaciones graves. La extirpación quirúrgica del epitelio limbal, solo o con el uso de productos químicos ^{10, 11, 16,} es más difícil de realizar y no es la mejor opción en los animales con ojos pequeños y una epitelio limbar delgada (como ratones). Además, sorprendentemente, limbectomy todavía puede dejar un poco del epitelio limbal detrás ^10.

La técnica descrita a continuación resultará en LSCD con una neovascularizaciónd conjuntivalización que imita la presentación del SIL completa en los pacientes y tiene una duración de al menos tres meses ^1. Es adecuado para aquellos que tienen como objetivo estudiar la fisiopatología SIL o la cicatrización de heridas, la inmunología, y los tratamientos potenciales en ratones. Posiblemente, con algunas modificaciones, este procedimiento puede llevarse a cabo en ratas o conejos ^10. Como la rebaba giratorio elimina eficazmente el epitelio, que se puede utilizar en cualquier investigación perteneciente a la abrasión corneal epitelial / herida y en cualquier tratamiento relacionado o estudios de biología molecular.

Protocolo

Todos los procedimientos realizados en animales cumplen con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología declaraciones para el uso de animales en la investigación de la visión. Se utilizaron cuatro a catorce 6J de seis meses de edad, macho / hembra C57BL / tipo salvaje: diez ratones para el modelo de lesión y cuatro como animales de control (córneas no heridos).

1. Preparación de los animales

1. Anestesiar un ratón con una inyección intraperitoneal de una 100 mg / kg de ketamina y 5 mg mezcla de xilazina / kg. Después de la anestesia ha hecho efecto, pellizcar el dedo para confirmar la profundidad de la anestesia; el animal no debe reaccionar.
2. Inspeccionar el ojo bajo una lámpara de hendidura antes de realizar los experimentos para comprobar la ausencia de cualquier lesión en la córnea anterior.
3. Inculcar una gota de clorhidrato de tetracaína 1% sobre el ojo. Después de 60 - 90 segundos, probar el reflejo corneal para confirmar la ausencia de sensación. Proparacaína clorhidrato de 0,5% se puede usar en su lugar.
4. Cuando la pérdida de sensación corneal escierto, coloque suavemente una gota de 5% de povidona-yodo en el ojo y en el cabello alrededor del ojo. Limpie la gota después de 1 min o difundirlo en el pelo alrededor de los ojos para evitar que el pelo interfiera con la punta de la herramienta.

2. Dispositivo de abrasión del epitelio corneal

1. Use guantes quirúrgicos y una bata. Preparar las herramientas necesarias: una fresa rotativa estéril y un par de pinzas estériles. Para un mejor control, utilizar pinzas dobladas. Coloque las herramientas en una hoja estéril durante el procedimiento.
2. Usando las pinzas dobladas, estabilizar el ojo por el acaparamiento de las tapas desde el lado nasal y proptosing suavemente el ojo. Evitar el uso de demasiada presión.
3. Bajo un microscopio quirúrgico, afeitarse 360 ​​° alrededor de la zona del limbo dos veces utilizando la fresa rotativa estéril. Ir alrededor del limbo con una velocidad de 5-6 seg por ronda.
   NOTA: La rebaba tiene una velocidad fija. Sin embargo, para que gire a la velocidad establecida, la "tuerca del extremo" debe estar completamente apretado.
4. Retire todo el epitelio de la córnea de limbo a limbo con la rebaba rotatoria. Para obtener mejores resultados, mueva la herramienta en forma circular y mantenga un tanto paralela a la superficie de la córnea para trabajar con la parte lateral de la punta. Tenga cuidado de no dañar el estroma por no vuelve a cepillar las áreas donde el epitelio ya ha sido retirado. No aplicar ninguna presión en el ojo. Limpiar la punta del pincel según sea necesario.
5. Inculcar una gota de solución salina tamponada con fosfato estéril sobre la córnea y limpie las hojas epiteliales independiente con un tejido suave de limpieza.
6. Afeitarse el epitelio restante, en su caso.
7. Prestar atención a la cola del ratón durante la cirugía.
   NOTA: Si se produce cualquier movimiento, la profundidad de la anestesia se ha desvanecido y se requiere aún más la inyección. Un tercio a dos tercios del volumen inyectado primario debe ser suficiente. No exceder la dosis al animal con la medicación anestésica.
8. Esterilizar todas las herramientas antes de utilizarlas en otro ojo.

3. Confirmar la eliminación completa epitelial

1. Aplicar una gota de 1 mg / ml de fluoresceína de sodio en la córnea. Limpiar la córnea después de 30 segundos y examinarla bajo el microscopio con un filtro azul de cobalto para verificar la eliminación completa del epitelio.
   NOTA: Las áreas de la córnea con defectos epiteliales se visualizan en verde.

4. Después de la operación de atención

1. El sacrificio del animal en una manta de calefacción y guardarlo en un lugar seguro (por ejemplo, en su jaula), mientras que bajo la recuperación. No mantenga un animal inconsciente en compañía de los conscientes.
2. Aplicar 1% pomada oftálmica de eritromicina. Esto también evitará que la sequedad del ojo. Continuar la aplicación del antibiótico diaria durante una semana.
3. Inyectar 0,1 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea después del procedimiento y de nuevo después de 12 hr. Continuar la inyección dos veces al día durante dos días.
4. Observe que el animal de 30 - 45 minutos, hasta que la recuperación completa de la anestesia.
   NOTA: Leve movimiento de los músculos respiratorios en la superficie ventral indica el bienestar de los animales, mientras que bajo la recuperación.

Resultados

Dentro de un mes después de realizar esta técnica, el 100% de las corneas desarrolló neovascularización superficial (Figura 1A. Las fotografías fueron tomadas con una cámara conectada a una lámpara de hendidura bajo un campo brillante y cobalto filtro azul). En 18/20 (90%) de los ojos, la neovascularización implicada toda la superficie corneal (Figura 1A). En 2/20 (10%), se observó neovascularización en tres de los cuatro cuadrantes de la córnea, pero aú...

Discusión

En este artículo se describe una técnica reproducible y relativamente sencillo para crear un modelo de ratón de LSCD. Hay varios aspectos importantes de este modelo que vale la pena destacar. En primer lugar, a diferencia de los modelos que utilizan productos químicos ^{11, 12,} la lesión implica principalmente el epitelio de la superficie (y la membrana basal), con un daño mínimo al estroma corneal subyacente o a otras estructuras intraoculares. Por lo tanto, no hay más que la inflamación y la cicatrización lim...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fresa giratoria: Removedor de anillos de óxido AlgerBrush II	Rumex International Co, Clearwater, FL	16-141 Fresa de	0,5 mm. También disponible en otras compañías.
Microscopio quirúrgico	Wild Heerbrugg, Suiza	Wild M691
Cámara digital	Nikon, Tailandia
Lámpara de hendidura Nikon FS-2	Nikon, Japón
Anticuerpo policlonal anti-CK12	Santa Cruz Blotechnology, CA,SC-17101		1:100
Anticuerpo monoclonal anti-CK8	TROMA-I-s, Iowa City, IA	AB_531826	Concentración 1:50