Summary
Der folgende Artikel stellt eine einfache und reproduzierbare Technik effektiv zu einer nachhaltigen Mausmodell der Limbusstammzellinsuffizienzen (LSCD) erstellen. Dieses Tiermodell ist nützlich bei der Prüfung und die Wirksamkeit von Behandlungen für Limbus-Stammzellen Krankheiten verglichen.
Abstract
Limbusstammzellinsuffizienzen (LSCD) ist ein Zustand der Fehlfunktion oder den Verlust von Limbus-epithelialen Stammzellen, wonach das Hornhautepithel mit Bindehaut ersetzt wird. Die Patienten leiden unter wiederkehrenden Hornhautdefekte, Schmerzen, Entzündung und Verlust des Sehvermögens.
Zuvor wurde ein Mausmodell der LSCD beschrieben und im Vergleich zu zwei anderen Modellen. Das Ziel war, ein einheitliches Mausmodell der LSCD zu erzeugen, die beide ahmt den Phänotyp beim Menschen und lange genug dauert es möglich zu machen, um die Krankheit Pathophysiologie zu studieren und zu neuen Therapien zu bewerten. Hier wird die Technik näher beschrieben.
Ein motorisiertes Werkzeug mit einem rotierenden Grat wurde entwickelt, um die Rostringe von der Hornhautoberfläche zu entfernen oder das Pterygium Bett bei Patienten zu glätten. Es ist eine geeignete Vorrichtung die gewünschte LSCD Modell zu erstellen. Es ist ein leicht verfügbar, einfach zu bedienendes Werkzeug mit einer feinen Spitze, die es angemessen für die Arbeit an kleinen Augen macht, wiein Mäusen. Seine Anwendung verhindert eine unnötige Gefahr für das Auge und es zu unerwünschten Verletzungen führt nicht, wie es oft der Fall bei Modellen chemischen Verletzungen. Wie zu einem stumpfen Schaber gegenüber, entfernt sie das Epithel mit der Basalmembran. In diesem Protokoll wurde die Limbus-Bereich zweimal abgerieben, und dann das Ganze wurde Hornhautepithel von Limbus zu Limbus rasiert. Um Stroma Verletzungen zu vermeiden, wurde darauf geachtet, nicht die Hornhautoberfläche zu bürsten einmal wurde das Epithel bereits entfernt.
Introduction
Das Hornhautepithel erforderlich, um die Klarheit und die Integrität der Hornhaut aufrechtzuerhalten. Es wird ständig während des gesamten Lebens durch die epithelialen Stammzellen in Limbus-einer schmalen Zone an der Verbindungsstelle der Hornhaut und der Bindehaut Wohnsitz erneuert. Diese sich selbst erneuernden Limbusstammzellen spielen eine entscheidende Rolle in der Hornhautepithel regenerierend, beide normal und nach der Verletzung. Eine teilweise oder vollständige Verarmung dieser Stammzellen wird bei rezidivierenden Hornhauterosionen, Schmerzen, Hornhautnarben und Neovaskularisation, Aussehen von Becherzellen zur Folge haben, und wenn sie nicht behandelt, Hornhautblindheit links. Dieser Zustand wird als Limbusstammzellinsuffizienzen (LSCD) bekannt und können idiopathische sein; erblich; oder durch chemische oder thermische Verletzungen erworben, langfristige Tragen von Kontaktlinsen, und eine chronische Entzündung 1-6.
Forschung auf LSCD erfordert ein geeignetes Tiermodell, das nicht nur imitiert die Krankheit beim Menschen, sondern ist reproduzierbar und nachhaltig ist, mit dem mindestens eineBerg Verletzungen anderer Hornhaut- und Augenstrukturen. Dieses Modell ist notwendige Behandlungen zu beurteilen und die Krankheitsmechanismen auf molekularer und zellulärer Ebene zu klären. Wie zuvor 1 beschrieben, mit der Verwendung einer rotierenden Fräse, kann man leicht ein Mausmodell der LSCD entwickeln, die die oben genannten Vorteile und bleibt für mindestens drei Monaten aufweist. Das Ziel dieser Studie ist es, eine einfache, reproduzierbare und nachhaltige Mausmodell der LSCD zu präsentieren.
Der sich drehende Grat ist ein handliches Werkzeug , das gleichmäßig das Epithel entfernt , ohne die zugrunde liegende 1 Stroma zu verletzen. Es wurde 7, 8 in Wundheilungsstudien zu induzieren zentralen Hornhauterosion eingesetzt. Die hiermit präsentierte Technik LSCD in einer Maus zu schaffen, hat nicht vor berichtet. Zuvor Verfahren eingeführt in einer weniger einheitlichen das Epithel mit einem stumpfen Spatel Ergebnis Abschaben verletzungs insbesondere am Limbus-und eine variable Phänotyp 1, 9, mit Wiederherstellung of normalen Hornhautepithel 1. Im Gegensatz zu dem stumpfen Schaber, entfernt der Rotationsbohrer des epithelialen Basalmembran sowie 7, 8, 10. Andere berichteten Verfahren Stammzellen abzutrennen, umfassen die Verwendung von Chemikalien, wie Natriumhydroxid, n-Heptanol, und Benzalkoniumchlorid, die nicht nur unerwünschte Schädigung zugrunde liegenden Augenstrukturen induzieren kann, sondern auch zu erheblichen Entzündung und nachfolgende kornealen opacification führen kann oder epithelialen Plattenepithelmetaplasie 15.11. Der rotierende Grat ist nicht mit dieser schweren Komplikationen verbunden. Chirurgisch den Limbus Epithel entfernt, 10 allein oder mit der Verwendung von Chemikalien, 11, 16, ist schwieriger zu führen und ist nicht die beste Option bei Tieren mit kleinen Augen und einem dünnen Limbus Epithelien (wie Mäuse). Darüber hinaus kann überraschenderweise limbectomy noch etwas von dem Limbus Epithel hinter 10 verlassen.
Die unten beschriebene Technik wird in LSCD mit Neovaskularisierung eine Folged conjunctivalization, die die Darstellung der kompletten LSCD bei Patienten und dauert mindestens drei Monate 1 nachahmt. Es ist geeignet für diejenigen, die darauf abzielen LSCD oder Wundheilung Pathophysiologie, Immunologie und mögliche Behandlungen bei Mäusen zu untersuchen. Gegebenenfalls mit einigen Modifikationen kann dieses Verfahren bei Ratten oder Kaninchen 10 durchgeführt werden. Da der Rotationsbohrer effizient das Epithel entfernt, kann es im Zusammenhang mit Hornhautepithels Abrasion / Verwundung und in jeder Behandlung benötigt oder Molekularbiologie Studien in jeder Forschung genutzt werden.
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Protocol
Alle Verfahren an Tieren durchgeführt, mit der Association for Research in Vision and Ophthalmology Aussagen für Tierversuche in der Vision Forschung entsprechen. Vierzehn vier- bis sechs Monate alten männlichen / weiblichen C57BL / 6J-Wildtyp-Mäusen wurden verwendet: zehn Mäuse für die Schadensmodell und vier als Kontrolltiere (unwounded Cornea).
1. Vorbereitung der Tiere
- Anästhesieren eine Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 100 mg / kg Ketamin und 5 mg / kg Xylazin-Mischung. Nach der Anästhesie wirksam geworden ist, eine Prise der Spitze der Narkose Tiefe zu bestätigen; sollte das Tier nicht reagieren.
- Untersuchen Sie das Auge unter einer Spaltlampe vor der Durchführung der Experimente das Fehlen einer früheren Verletzung der Hornhaut zu überprüfen.
- Flößen Sie einen Tropfen von 1% Tetracainhydrochlorid auf das Auge. Nach 60 bis 90 Sekunden, testen Sie die Kornealreflex das Fehlen der Empfindung zu bestätigen. Proparacain-Hydrochlorid 0,5% können stattdessen verwendet werden.
- Wenn der Verlust der Hornhautgefühl istsicher, sanft einen Rückgang von 5% PVP-Jod auf das Auge platzieren und auf das Haar um das Auge. Wischen Sie den Abfall nach 1 min aus oder verteilen es auf dem Haar um die Augen, das Haar zu verhindern, mit der Werkzeugspitze stören.
2. Abschleifen der Hornhautepithel
- Tragen OP-Handschuhe und ein Kleid. Bereiten Sie die erforderlichen Werkzeuge: ein steriles Rotationsbohrer und ein Paar sterile Pinzette. Für eine bessere Kontrolle, verwenden gebogen Pinzette. Legen Sie die Werkzeuge auf einem sterilen Blatt während des Verfahrens.
- Unter Verwendung der gebogenen Pinzette, stabilisieren das Auge durch den Deckel von der Nasenseite greifen und das Auge sanft proptosing. Vermeiden Sie zu viel Druck.
- Unter einem Operationsmikroskop, rasieren 360 ° um den Limbus-Bereich zweimal die sterile Rotationsbohrer verwenden. Gehen Sie rund um den Limbus mit einer Geschwindigkeit von 5 - 6 Sekunden pro Runde.
HINWEIS: Der Grat einer festen Geschwindigkeit hat. Doch für sie sollte verschärft werden vollständig bei der etablierten Geschwindigkeit, die "End-Mutter" zu drehen. - Entfernen Sie das gesamte Hornhautepithel von Limbus mit dem rotierenden Grat zu Limbus. Für bessere Ergebnisse, wobei das Werkzeug in einer kreisförmigen Art und Weise bewegen und halten es etwas parallel zur Hornhautoberfläche mit der lateralen Seite seiner Spitze zu arbeiten. Achten Sie darauf, nicht das Stroma zu verletzen, indem nicht wieder Bürsten der Bereiche, in denen das Epithel bereits entfernt wurde. Wenden Sie keinen Druck auf das Auge. Reinigen Sie die Pinselspitze nach Bedarf.
- Flößen Sie einen Tropfen steriler phosphatgepufferter Salzlösung auf der Hornhaut und wischen Sie alle freistehende Epithellagen mit einem weichen Reinigungstuch.
- Rasur die verbleibende Epithel, sofern vorhanden.
- Achten Sie auf die Maus Schwanz während der Operation.
HINWEIS: Wenn eine Bewegung stattfindet, hat die Narkose Tiefe verblasst und weitere Injektion erforderlich ist. Ein Drittel bis zwei Drittel des primären injizierte Volumen sollte ausreichen. Überdosierung Sie nicht das Tier mit dem Betäubungsmittel Medikamente. - Sterilisieren Sie alle Werkzeuge, bevor sie auf einem anderen Auge mit.
3. Bestätigen Sie die komplette Epithelial Removal
- Einen Tropfen von 1 mg / ml Fluorescein-Natrium auf die Hornhaut. Reinigen Sie die Hornhaut nach 30 Sekunden und untersuchen sie unter einem Mikroskop mit einem Blaufilter die vollständige Entfernung des Epithels zu überprüfen.
HINWEIS: Die Hornhautbereiche mit Epithelfehler sind grün dargestellt.
4. Post-Betrieb Pflege
- Legen Sie das Tier auf einer Heizdecke und halten Sie sie an einem sicheren Ort (zB in seinem Käfig) , während unter Rückgewinnung. Nicht eine unbewusste Tier in der Gesellschaft von bewußten halten.
- Bewerben 1% Erythromycin Augensalbe. Dies wird auch Augentrockenheit verhindern. Weiterhin die Anwendung des Antibiotikums täglich für eine Woche.
- Injizieren von 0,1 mg / kg subkutan Buprenorphin nach dem Eingriff und wieder nach 12 Stunden. Weiterhin die Injektion zweimal pro Tag für zwei Tage.
- Beobachten Sie das Tier für 30 - 45 min, bis zur vollständigen Erholung von der Anästhesie.
HINWEIS: Leichte Bewegung der Atemmuskulatur auf der ventralen Oberfläche zeigt Tier Wellness, während sie unter Genesung.
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Representative Results
Innerhalb eines Monats nach dieser Technik durchgeführt wird , 100% der Cornea entwickelt oberflächlichen Neovaskularisation (Abbildung 1A. Fotos mit einer Kamera zu einer Spaltlampe unter einem hellen Bereich und Blaufilter verbunden genommen wurden). In 18/20 (90%) der Augen, beteiligt Neovaskularisierung die ganze Hornhautoberfläche (1A). In 2/20 (10%), Neovaskularisation wurde in drei von vier Quadranten kornealen beobachtet, aber es erreicht noch die Hornhautmitte.
Zur Validierung wurde die Entwicklung von LSCD, ganze Berg Immunofärbung 1 durchgeführt. Dieser Schritt ist nicht Teil des Protokolls und kann in Abhängigkeit von Zielen und Interessen verändert werden. Drei Varianten wurden als Indikatoren für LSCD berücksichtigt: Abwesenheit von Zytokeratin (CK) 12, ein Zwischen Filaments spezifisch normalen cornealen epithelialen Zellen 17, 18; Aussehen von CK8, eine einfache Epithelien Marker
Normal, unverletzt Cornea express CK12-ein spezifischer Marker von reifen Hornhautepithelzellen 17, 18 -throughout der Hornhautoberfläche, aber sie frei von jeglicher CK8 sind oder Becherzellen (MUC5AC) auf der Hornhaut Teil der ganze Berg Proben (Abbildung 1B) . Im Vergleich zu normalen Augen ist CK12 Ausdruck fast abwesend auf injur y Modell Cornea, während sie zeigen deutlich positive Färbung für CK8 und Becherzellen (Abbildung 1B). Diese Beobachtungen zeigen die Entwicklung von LSCD.
Bei Interesse an der Immunfärbung Ergebnisse zu quantifizieren, die von Image-J separat zu quantifizieren 20 immunostaining Dichten auf den ursprünglichen, unveränderten Bilder durch das Mikroskop unter den gleichen Einstellungen gemacht. Kurz gesagt, wählen die Hornhaut Teil der whole mount Probe, für diese Region die integrierte Dichte und Flächen messen und 20 , um die korrigierte Dichte für den Hintergrund zu berechnen. Das Verhältnis von CK12 zu CK8 Dichten wurden zuvor 1 auf einer größeren Anzahl von Proben dargestellt. Das reduzierte Verhältnis im Vergleich zu den Kontrollen (normale Cornea) und das Auftreten von Becherzellen auf der Hornhautoberfläche zeigen die Entwicklung von LSCD.
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Abbildung 1: Corneal Phänotyps Nach LSCD bei Mäusen Erstellen. Spaltlampenuntersuchung zeigt , dass alle Hornhäute von einem Monat (A, Maßstabsbalken: 0,5 mm) ein gewisses Maß an Neovaskularisation entwickeln. Eine normale Hornhaut drückt CK12 auf der ganzen Hornhaut ist aber jeder CK8 oder Becherzellen (MUC5AC) frei. CK12 ist abwesend im LSCD Modell, während CK8 und Becherzellen auf der Hornhaut (B, Maßstabsbalken: 200 & mgr; m) erscheinen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieser Artikel beschreibt eine reproduzierbare und relativ einfache Technik, ein Mausmodell von LSCD zu erstellen. Es gibt mehrere wichtige Aspekte dieses Modells, die erwähnenswert sind. Erstens, anders als Modelle , die 11 Chemikalien, 12, beinhaltet die Schädigung in erster Linie das Oberflächenepithel (und Basalmembran) mit minimaler Beschädigung des darunterliegenden Hornhautstroma oder anderen intraokularen Strukturen. Somit gibt es nur begrenzte Entzündung und Vernarbung, von denen beide das Verfahren zu komplizieren und machen es schwieriger, die Ergebnisse der von Interventionen an den Limbus-Stammzellen gerichtet zu beurteilen. Eine interessante Studie von Li et al. 10, die die Verwendung der Rotationsbohrer mit verschiedenen Kombinationen von chirurgischen und chemischen Behandlungen vergleicht, fand auch den Grat sicherer und wirksamer zu sein bei der Schaffung LSCD in Kaninchen. Zweitens scheint das Modell für mindestens bis zu drei Monaten 1 stabil. dieses Modell Erstellen beinhaltet die Verwendung vondie rotierende Fräse, ein Instrument, das an Kliniker, die mit der Hornhaut arbeiten, sowie für diejenigen, die tun Maus Verwundung Studien vertraut ist. Der Vorteil gegenüber einem stumpfen Spachtel ist , dass die Verletzung gleichmäßiger und reproduzierbarer 1 ist.
Zum besseren Verständnis der Limbus-Stammzellen zu zerstören, wurde der Limbus-Bereich zweimal behandelt. Basierend auf der Erfahrung der Arbeit an Maus Augen, die Behandlung von mehr als zwei Runden abschleift oft Limbus Blutgefäße und Blutungen verursacht. Falls der Technik in anderen Tieren verwendet wird, kann dieser Schritt auf der cornealen epithelialen Dicke modifiziert werden, abhängig. In dieser Studie wurde ein motorisiertes Werkzeug mit einem 0,5-mm Grates Spitze wurde verwendet; Grat Spitzen in anderen Formen und Größen sind ebenfalls erhältlich und können stattdessen verwendet werden, abhängig von der Hornhaut Spezifikationen und auf Augengröße. Li et al. 10 berichtete über die 2,5-mm - Fräse geeignet sein konsequent Kaninchenhornhaut und Limbus Epithelien zu entfernen.
So erhalten Sie die optimaleErgebnis, Limbus und Cornea-Epithel wurden in einer kreisförmigen Art und Weise und der lateralen Seite des Grates verwendet wurde rasiert. Um die Tierhaare stören mit der Werkzeugspitze zu verhindern, die PVP-Jod Tropfen wurde auf dem Haar verteilt um das Auge herum, anstatt dass sie abgewischt. Das Werkzeug sollte nicht statisch an einem Ort betrieben werden, da diese Perforation verursachen kann. Die Behandlung der Limbus in einem sehr langsamen Tempo zu Blutungen führen kann; eine Geschwindigkeit von fast 6 Sekunden pro Runde ist für eine C57BL / 6J Maus Auge geeignet. Es ist wichtig, Wieder Bürsten der nackten Stroma zu vermeiden, da dies mehr Entzündung und Stroma opacification induzieren. Druck sollte nicht auf das Auge aufgebracht werden, während das Epithel Abschleifen. Nach dem Eingriff wurde die Hornhaut mit Fluorescein-Farbstoff gefärbt kompletter epithelialen Entfernung, um sicherzustellen. Es ist wichtig, Augentrockenheit bei Tier Erholung zu verhindern. Einschränkungen sind, daß diese Technik nicht zu 100% der Stammzellen zu entfernen. Es ist auch etwas betreiberabhängig und erfordert Praxis Co zu gebennsistent Ergebnisse.
Wenn die Hornhautepithels Phänotyp des Studiums, ganze Berg Färbung ist der beste Weg, das Ergebnis dieses Modells zu beurteilen. Dies ist, weil es die ganze Hornhautepithel ermöglicht sofort ausgewertet werden, während Querschnitte nur Informationen zu den einzelnen bestimmten Abschnitt geben würde.
Diese kontrollierbare Technik kann LSCD in Mäusen induzieren, und wahrscheinlich auch bei anderen Tieren als auch. Es stellt ein geeignetes Modell von LSCD neuartige Behandlungen zu studieren und zu weiteren Aspekten der Krankheit Pathophysiologie entdecken. Mit einigen Änderungen kann es auch bei der Untersuchung der Hornhaut Wundheilung, Angiogenese und Lymphangiogenese nützlich sein.
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Acknowledgments
Die Autoren danken Ruth Zelkha, MS, für ihre großzügige Unterstützung bei der Bildgebung. Diese Arbeit wurde von Clinical Scientist Development Program Preis K12EY021475 zu ME unterstützt wurde, gewähren R01 EY024349-01A1 auf ARD, Kern Zuschuss EY01792 vom National Eye Institute, NIH, und eine uneingeschränkte Gewährung von Forschungs Erblindung zu verhindern. ARD ist der Empfänger eines Career Development Award von Forschung zur Verhütung Blindheit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover | Rumex International Co, Clearwater, FL | 16-141 | 0.5 mm burr. Also available from other companies. |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M691 | |
| Digital camera | Nikon, Thailand | ||
| Nikon FS-2 slit lamp | Nikon, Japan | ||
| Polyclonal anti-CK12 antibody | Santa Cruz Blotechnology, CA, | SC-17101 | 1:100 concentration |
| Monoclonal anti-CK8 antibody | TROMA-I-s, Iowa City, IA | AB_531826 | 1:50 concentration |
References
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