Summary
Il seguente articolo fornisce un facile, tecnica riproducibile per creare efficacemente un modello sostenibile del mouse di carenza di cellule staminali limbari (LSCD). Questo modello animale è utile in fase di test e confrontando l'efficacia dei trattamenti per le malattie di cellule staminali del limbus.
Abstract
carenza di cellule staminali limbari (LSCD) è uno stato di malfunzionamento o la perdita delle cellule staminali epiteliali limbari, dopo di che l'epitelio corneale viene sostituito con congiuntiva. I pazienti che soffrono di difetti ricorrenti corneali, dolore, infiammazione, e la perdita della vista.
In precedenza, un modello murino di LSCD stato descritto e confrontato con altri due modelli. L'obiettivo era quello di produrre un modello di topo consistente di LSCD che entrambi imita il fenotipo negli esseri umani e dura abbastanza a lungo da permettere di studiare la fisiopatologia della malattia e per valutare nuovi trattamenti. Qui, la tecnica è descritta in dettaglio.
Uno strumento motorizzato con una fresa rotante è stato progettato per rimuovere gli anelli di ruggine dalla superficie corneale o per lisciare il letto pterigio nei pazienti. Si tratta di un dispositivo atto a creare il modello LSCD desiderato. È facilmente disponibile, facile da usare con una punta fine che lo rende adatto per la lavorazione di piccoli occhi, comenei topi. La sua applicazione evita inutili traumi all'occhio e non comporti lesioni indesiderati, come spesso accade con i modelli danno chimico. Al contrario di un raschietto smussato, rimuove l'epitelio con la membrana basale. In questo protocollo, la zona limbare è stata abrasa due volte, e quindi l'intero epitelio corneale è stato rasato dal limbus al limbus. Per evitare lesioni stroma, si è avuto cura di non spazzolare la superficie della cornea una volta che l'epitelio è già stato rimosso.
Introduction
L'epitelio corneale è necessaria per mantenere la chiarezza e l'integrità della cornea. Si rinnova continuamente per tutta la vita dalle cellule staminali epiteliali che risiedono nel-un limbo zona ristretta a livello della giunzione della cornea e della congiuntiva. Queste cellule staminali del limbus auto-rinnovamento svolgono un ruolo cruciale nella rigenerazione dell'epitelio corneale, sia normalmente e dopo l'infortunio. esaurimento parziale o completa di queste cellule staminali si tradurrà in erosioni corneali ricorrenti, dolore, cicatrici corneali e la neovascolarizzazione, comparsa di cellule calice, e se non trattata, la cecità corneale. Questa condizione è nota come la carenza di cellule staminali limbari (LSCD) e può essere idiopatica; ereditaria; o acquisita a causa di infortuni chimici o termici, lenti a contatto a lungo termine indossare, e infiammazione cronica 1-6.
La ricerca sulle LSCD richiede un modello animale adatto che non solo imita la malattia negli esseri umani, ma è riproducibile e sostenibile, con il minimo di unmonte di lesioni ad altre strutture corneali e oculari. Questo modello è necessario valutare i trattamenti e per chiarire i meccanismi della malattia a livello molecolare e cellulare. Come descritto in precedenza 1, con l'uso di una fresa rotante, si può facilmente sviluppare un modello murino di LSCD che offre i vantaggi suddetti e persiste per almeno tre mesi. L'obiettivo di questo studio è quello di presentare un modello semplice, riproducibile e sostenibile del mouse di LSCD.
La bava di rotazione è un pratico strumento che rimuove in modo uniforme l'epitelio senza ferire lo stroma sottostante 1. È stato usato per indurre erosione corneale centrale 7, 8 in studi guarigione di ferite. La tecnica presente-presentato per creare LSCD in un topo non è stato riportato in precedenza. Precedentemente introdotto metodi di raschiare l'epitelio con un risultato spatola smussato in meno uniforme infortuni particolarmente al limbus e un fenotipo più variabile 1, 9, con più o ristorazionef normale epitelio corneale 1. Diversamente il raschietto smussato, la fresa rotante rimuove la membrana basale dell'epitelio e 7, 8, 10. Altri metodi riportati di sever cellule staminali comportano l'uso di sostanze chimiche, quali idrossido di sodio, n-eptanolo, e cloruro di benzalconio, che non solo può indurre lesioni indesiderato strutture oculari sottostanti, ma può anche portare a infiammazione significativa e successiva opacizzazione corneale o epiteliali metaplasia squamosa 11-15. La bava di rotazione non è associata a queste gravi complicazioni. Rimuovere chirurgicamente l'epitelio limbare, da solo o con l'uso di prodotti chimici 10, 11, 16, è più difficile da eseguire e non è l'opzione migliore in animali con occhi piccoli e un sottile epiteli limbare (come topi). Inoltre, a sorpresa, limbectomy può ancora lasciare un po 'dell'epitelio limbare dietro 10.
La tecnica di seguito descritta comporta LSCD con neovascolarizzazione und conjunctivalization che imita la presentazione di completa LSCD in pazienti e dura per almeno tre mesi 1. E 'adatto per coloro che mirano a studiare LSCD o ferite fisiopatologia guarigione, immunologia, e potenziali trattamenti nei topi. Possibilmente, con alcune modifiche, questa procedura può essere eseguita in ratti o conigli 10. Come la fresa rotante rimuove efficacemente l'epitelio, può essere utilizzato in ogni ricerca di pertinenza corneale epiteliale all'abrasione / ferimento e in qualsiasi trattamento correlata o studi di biologia molecolare.
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Protocol
Tutte le procedure eseguite su animali siano conformi con l'Associazione per la Ricerca in Oftalmologia dichiarazioni di visione e per l'uso di animali nella ricerca visione. Quattordici quattro a sei mesi di età 6J maschio / femmina C57BL / selvatici tipo sono stati utilizzati: dieci topi per il modello infortunio e quattro come animali di controllo (cornee illesi).
1. Preparazione degli animali
- Anestetizzare un mouse con un'iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg di ketamina e xilazina miscela 5 mg / kg. Dopo l'anestesia ha avuto effetto, pizzicare la punta di confermare la profondità dell'anestesia; l'animale non dovrebbe reagire.
- Controllare l'occhio sotto una lampada a fessura prima di condurre gli esperimenti per verificare l'assenza di qualsiasi lesione corneale precedente.
- Instillare una goccia di 1% tetracaina cloridrato sull'occhio. Dopo 60-90 secondi, testare il riflesso corneale per confermare l'assenza di sensazione. Proparacaina cloridrato 0,5% può essere usato al posto.
- Quando la perdita di sensibilità corneale ècerto, inserire delicatamente un calo del 5% iodopovidone sull'occhio e sui capelli intorno all'occhio. Pulire la caduta dopo 1 min o diffonderlo sui capelli intorno all'occhio per evitare che i capelli di interferire con la punta dello strumento.
2. abrasione l'epitelio corneale
- Indossare guanti chirurgici e un abito. Preparare gli strumenti necessari: una fresa rotante sterile e un paio di pinzette sterili. Per un migliore controllo, utilizzare una pinzetta piegate. Posizionare gli strumenti su un foglio sterile durante la procedura.
- Utilizzando le pinzette piegate, stabilizzare l'occhio afferrando i coperchi dal lato nasale e proptosing delicatamente l'occhio. Evitare l'uso di troppa pressione.
- Sotto un microscopio operatorio, la barba di 360 ° intorno alla zona limbare due volte utilizzando la fresa rotante sterile. Andare in giro per il limbo, con una velocità di 5 - 6 secondi per ogni turno.
NOTA: La fresa ha una velocità fissa. Tuttavia, per farlo ruotare alla velocità stabilita, il "dado estremità" deve essere completamente serrato. - Rimuovere l'intero epitelio corneale dal limbus al limbo con la bava rotante. Per ottenere risultati migliori, spostare l'utensile in modo circolare e tenerlo po parallelo alla superficie corneale per lavorare con il lato laterale della sua punta. Fare attenzione a non danneggiare lo stroma, non ri-spazzolare le aree in cui è già stato rimosso l'epitelio. Non applicare alcuna pressione sugli occhi. Pulire la punta del pennello, come richiesto.
- Instillare una goccia di sterile PBS sulla cornea e rimuovere eventuali fogli epiteliali indipendente con un panno di pulizia morbido.
- Radere l'epitelio rimanente, se presente.
- Prestare attenzione alla coda di topo durante l'intervento chirurgico.
NOTA: se si verifica un movimento, la profondità dell'anestesia è sbiadito ed è necessaria un'ulteriore iniezione. Un terzo a due terzi del volume iniettato primario dovrebbe essere sufficiente. Non overdose l'animale con il farmaco anestetico. - Sterilizzare tutti gli strumenti prima di utilizzarli su un altro occhio.
3. Conferma completa rimozione epiteliale
- Applicare una goccia di 1 mg / ml di sodio fluoresceina sulla cornea. Pulire la cornea dopo 30 sec ed esaminare sotto un microscopio con un filtro blu cobalto, per verificare la completa rimozione dell'epitelio.
NOTA: le zone corneali con difetti epiteliali sono visualizzati in verde.
4. Post-operazione di cura
- Mettere l'animale su una coperta di riscaldamento e di conservarlo in un luogo sicuro (ad esempio, nella sua gabbia), mentre sotto di recupero. Non tenere un animale privo di sensi in compagnia di quelli coscienti.
- Applicare 1% eritromicina pomata oftalmica. Questo sarà anche prevenire la secchezza oculare. Continuare l'applicazione del quotidiano antibiotico per una settimana.
- Iniettare 0,1 mg / kg per via sottocutanea buprenorfina dopo la procedura e dopo 12 ore. Continuare l'iniezione due volte al giorno per due giorni.
- Osservare l'animale per 30 - 45 minuti, fino al recupero completo dall'anestesia.
NOTA: Il movimento lieve dei muscoli respiratori sulla superficie ventrale indica benessere degli animali, mentre sotto di recupero.
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Representative Results
Nel giro di un mese dopo l'esecuzione di questa tecnica, il 100% delle cornee sviluppato neovascolarizzazione superficiale (Figura 1A. Le foto sono state scattate con una macchina fotografica collegata ad una lampada a fessura sotto un campo chiaro e blu cobalto filtro). In 18/20 (90%) degli occhi, neovascolarizzazione coinvolto l'intera superficie della cornea (Figura 1A). In 2/20 (10%), neovascolarizzazione è stata osservata in tre dei quattro quadranti corneali, ma ancora raggiunto il centro della cornea.
Per convalidare lo sviluppo di LSCD, tutto il monte immunocolorazione è stata effettuata 1. Questa fase non è una parte del protocollo e può essere modificato a seconda degli obiettivi e interessi. Tre varianti sono stati considerati come indicatori di LSCD: assenza di citocheratina (CK) 12, un filamento intermedio specifico normali cellule epiteliali corneali 17, 18; aspetto di CK8, un semplice marcatore epiteli
Normale, cornee illesi espresso CK12-un marker specifico di mature cellule epiteliali corneali 17, 18 -throughout la superficie corneale, ma privi di CK8 o calice cellule (MUC5AC) da parte della cornea di tutto campioni di montaggio (Figura 1B) . In confronto ad occhi normali, espressione CK12 è quasi assente in injur y cornee modello, mentre mostrano in modo significativo colorazione positiva per CK8 e calice cellule (Figura 1B). Queste osservazioni indicano lo sviluppo di LSCD.
Se siete interessati a quantificare i risultati di immunoistochimica, Usa immagine-J per quantificare separatamente 20 densità immunoistochimica sulle immagini originali, inalterati prese dal microscopio sotto le stesse impostazioni. In breve, selezionare la parte della cornea dell'intero campione monte, misurare la densità integrata e un'area per quella regione, e calcolare la densità corretta per lo sfondo 20. Il rapporto di CK12 a densità CK8 stati precedentemente presentato su un numero maggiore di campioni 1. Il rapporto ridotto rispetto ai controlli (cornee normali) e la comparsa di cellule caliciformi sulla superficie corneale dimostrano lo sviluppo di LSCD.
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Figura 1: Fenotipo corneale dopo la creazione LSCD nei topi. L'esame con lampada a fessura mostra che tutte le cornee di sviluppare un certo grado di neovascolarizzazione di un mese (A, Barra di scala: 0.5 mm). Una cornea normale esprime CK12 tutta la cornea, ma è priva di qualsiasi CK8 o cellule caliciformi (MUC5AC). CK12 è assente nel modello LSCD, mentre CK8 e calice cellule appaiono sulla cornea (B, Barra di scala: 200 micron). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo articolo descrive una tecnica riproducibile e relativamente semplice per creare un modello murino di LSCD. Ci sono diversi aspetti importanti di questo modello, che sono degni di nota. Innanzitutto, a differenza modelli che utilizzano sostanze chimiche 11, 12, la lesione coinvolge principalmente l'epitelio superficiale (e membrana basale), con il minimo danno al stroma corneale sottostante o ad altre strutture intraoculari. Quindi, vi è solo l'infiammazione limitata e cicatrici, entrambi i quali possono complicare la procedura e rendere più difficile valutare l'esito di eventuali interventi volti a le cellule staminali del limbus. Uno studio recente interessante da Li et al. 10, che confronta l'utilizzo della fresa rotante con diverse combinazioni di trattamenti chirurgici e chimiche, anche trovato la fresa per essere più sicuri e più efficaci nella creazione LSCD nei conigli. In secondo luogo, il modello sembra essere stabile per almeno fino a tre mesi 1. La creazione di questo modello prevede l'uso dila fresa rotante, uno strumento che è familiare a clinici che lavorano con la cornea, nonché a coloro che fanno studi topo ferimento. Il suo vantaggio rispetto all'utilizzo di una spatola smussato è che la lesione è più uniforme e riproducibile 1.
Per distruggere meglio le cellule staminali del limbus, la zona limbare è stato trattato due volte. Sulla base di esperienza di lavoro su occhi del mouse, il trattamento di più di due turni spesso abrades vasi sanguigni del limbus e provoca sanguinamento. Nel caso la tecnica è utilizzata in altri animali, questo passo può essere modificato a seconda dello spessore corneale epiteliale. In questo studio, un utensile motorizzato con una punta bava 0,5 mm è stato utilizzato; punte bava in altre forme e dimensioni sono disponibili e possono essere utilizzati al posto, a seconda delle specifiche della cornea e delle dimensioni degli occhi. Li et al. 10 ha riferito la bava da 2,5 mm per essere adatto per rimuovere costantemente corneale di coniglio e epiteli limbare.
Per ottenere l'ottimalerisultato, epiteli limbari corneali e sono state rasate in modo circolare ed è stato usato il lato laterale della bava. Per evitare che il pelo di interferire con la punta dell'utensile, la caduta di povidone-iodio è stato diffuso sui capelli intorno all'occhio, invece di essere cancellati. Lo strumento non deve essere utilizzato in modo statico in un punto, in quanto ciò potrebbe causare perforazione. Trattare il limbus a un ritmo molto lento può provocare sanguinamento; una velocità di quasi 6 secondi per ogni turno è adatto per un occhio topo C57BL / 6J. E 'fondamentale per evitare una nuova spazzolare lo stroma nuda, in modo da indurre più infiammazione e stroma opacizzazione. La pressione non deve essere applicata all'occhio mentre abrasione dell'epitelio. Dopo la procedura, la cornea era macchiato con fluoresceina per assicurarsi di rimozione epiteliale completa. E 'importante per prevenire la secchezza oculare durante il recupero degli animali. Le limitazioni sono che questa tecnica non può rimuovere il 100% delle cellule staminali. E 'anche un po' operatore-dipendente e richiede pratica per dare corisultati nsistent.
Quando si studia il fenotipo epiteliale corneale, tutto il monte colorazione è il modo migliore per valutare l'esito di questo modello. Questo è perché permette l'intera dell'epitelio corneale da valutare contemporaneamente, mentre le sezioni trasversali sarebbe solo dare informazioni su ogni sezione particolare.
Questa tecnica controllabile può indurre LSCD nei topi, e probabilmente in altri animali. Esso fornisce un modello adeguato di LSCD per studiare nuovi trattamenti e scoprire più ampi aspetti della fisiopatologia della malattia. Con alcune modifiche, può essere utile nello studio della cornea guarigione delle ferite, l'angiogenesi, e linfoangiogenesi pure.
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Acknowledgments
Gli autori ringraziano Ruth Zelkha, MS, per la sua generosa assistenza nella diagnostica per immagini. Questa ricerca è stata sostenuta dal programma clinico Scientist Development Award K12EY021475 a me, concedere R01 EY024349-01A1 a ARD, nucleo concessione EY01792 dal National Eye Institute, NIH, e una sovvenzione illimitata di ricerca per la prevenzione cecità. ARD è il destinatario di un Development Award carriera da Research per prevenire la cecità.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover | Rumex International Co, Clearwater, FL | 16-141 | 0.5 mm burr. Also available from other companies. |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M691 | |
| Digital camera | Nikon, Thailand | ||
| Nikon FS-2 slit lamp | Nikon, Japan | ||
| Polyclonal anti-CK12 antibody | Santa Cruz Blotechnology, CA, | SC-17101 | 1:100 concentration |
| Monoclonal anti-CK8 antibody | TROMA-I-s, Iowa City, IA | AB_531826 | 1:50 concentration |
References
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