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Genetics

Herramientas para estudiar el papel de la proteína HMGB1 arquitectónico en el procesamiento de la hélice causante de distorsión, de ADN específica de sitio enlaces cruzados

Published: November 10, 2016 doi: 10.3791/54678
Automatic Translation
1, 1
1Division of Pharmacology and Toxicology, College of Pharmacy, The University of Texas at Austin

Abstract

cuadro de grupo de alta movilidad 1 proteína (HMGB1) es una proteína de arquitectura no histonas que está implicado en la regulación de muchas funciones importantes en el genoma, tales como la transcripción, la replicación del ADN, y la reparación del ADN. HMGB1 se une al ADN estructuralmente distorsionado con mayor afinidad que a B-DNA canónica. Por ejemplo, se encontró que la HMGB1 se une al ADN enlaces cruzados (ICL), que enlazan covalentemente las dos hebras del ADN, provocar una distorsión de la hélice, y si se deja sin reparar puede causar la muerte celular. Debido a su potencial citotóxico, varios agentes inductores de ICL se utilizan actualmente como agentes quimioterapéuticos en la clínica. Mientras que los agentes formadores de ICL muestran preferencias por determinadas secuencias de bases (por ejemplo, 5'-TA-3 'es el sitio preferido para la reticulación de psoraleno), inducen daños en el ADN en gran medida de forma indiscriminada. Sin embargo, acoplando covalentemente el agente ICL-inducir a un oligonucleótido formador de triplex-(TFO), que se une al ADN en una secuencia específicamanera, el daño del ADN objetivo se puede lograr. Aquí, nosotros usamos una TFO conjugado covalentemente en 'extremo a un 4'-hidroximetil-4,5 '5 el psoraleno trimetilpsoraleno-8, (HMT) para generar una ICL específica de sitio en un plásmido reportero mutación para su uso como una herramienta de para estudiar la modificación de arquitectura, el procesamiento, y la reparación de las lesiones del ADN complejos por HMGB1 en las células humanas. Se describen las técnicas experimentales para preparar ICL dirigidas-TFO en plásmidos informadores, y para interrogar a la asociación de HMGB1 con los dirigidos ICL-TFO en un contexto celular utilizando ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina. Además, se describen ensayos de superenrollamiento del ADN para evaluar la modificación de arquitectura específica del ADN dañado mediante la medición de la cantidad de vueltas superhelical introducidas en el plásmido psoraleno reticulado por HMGB1. Estas técnicas se pueden utilizar para estudiar los papeles de otras proteínas implicadas en el procesamiento y la reparación de ICL dirigidas-TFO u otros daños en el ADN objetivo en cualquier línea celular de interés.

Introduction

Triplex de formación de oligonucleótidos (TFOs) de ADN se unen dúplex de una manera específica de secuencia a través de enlaces Hoogsteen-hidrógeno para formar estructuras de triple helicoidal 1-5. Tecnología Triplex se ha utilizado para interrogar a una variedad de mecanismos biomoleculares, tales como la transcripción, daño en el DNA de reparación, y la orientación de genes (revisado en las referencias 6-8). TFOs se han utilizado ampliamente para inducir daño de sitio específico en plásmidos informadores 9,10. Nuestro laboratorio y otros han utilizado previamente un TFO, GA30, atado a una molécula de psoraleno para inducir reticulaciones entre cadenas de ADN específicas de sitio (ICL) en el gen su p F en el plásmido pSupFG1 5,10-12. ICL son altamente citotóxicos ya que estas lesiones se entrecruzan covalentemente las dos hebras de ADN, y si se deja sin reparar, puede bloquear la transcripción de genes e impedir la maquinaria de replicación del ADN 13,14. Debido a su potencial citotóxico, agentes inductores de ICL-han sido utilizados como fármacos quimioterapéuticos en el tratamientode cáncer y otras enfermedades 15. Sin embargo, el tratamiento y la reparación de ICL en las células humanas no se entiende bien. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos implicados en el procesamiento de ICL en las células humanas puede ayudar a mejorar la eficacia de los regímenes quimioterapéuticos basados ​​en ICL. ICL inducidos por TFO y sus intermedios de reparación tienen el potencial de causar distorsiones estructurales importantes para la hélice de ADN. Estas distorsiones son objetivos probables para las proteínas de arquitectura, que se unen a ADN distorsionada con mayor afinidad que a forma canónica B dúplex de ADN 16-20. Aquí, se estudió la asociación de una proteína de arquitectura muy abundante, HMGB1 con ICL en las células humanas a través de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ensayos en plásmidos de psoraleno-reticulada y se identificaron un papel para la HMGB1 en la modulación de la topología del ADN plasmídico psoraleno reticulado en humanos lisados ​​celulares de cáncer.

HMGB1 es un muy abundantes y de expresión ubicua no suarquitectónico de proteínas tono que se une al ADN dañado y sustratos de ADN, alternativamente, estructurados con mayor afinidad que forma canónica B ADN 17-20. HMGB1 participa en varios procesos metabólicos de ADN, tales como la transcripción, la replicación del ADN, y la reparación del ADN 16,21-23. Hemos demostrado previamente que la HMGB1 se une a ICL dirigidas-TFO in vitro con alta afinidad 20. Además, hemos demostrado que la falta de HMGB1 aumenta el procesamiento mutagénico de ICL dirigidas-TFO y HMGB1 identificado como una reparación por escisión de nucleótidos (NER) co-factor 23,24. Recientemente, hemos encontrado que la HMGB1 se asocia con ICL dirigidas-TFO en las células humanas y su reclutamiento a tales lesiones depende de la proteína NER, XPA 16. Superenrollamiento negativo del ADN se ha demostrado que la promoción de la eliminación eficaz de las lesiones del ADN por NER 25, y hemos encontrado que HMGB1 induce superenrollamiento negativo preferentemente en plas ICL contienen dirigidas-TFOmediados de sustratos (en relación con los plásmidos sustratos no dañado) 16, que proporcionan una mejor comprensión de la función (s) potencial de HMGB1 como un co-factor de NER. El procesamiento de ICL no se entiende completamente en las células humanas; por lo tanto, las técnicas y ensayos desarrollados en base a las herramientas moleculares descritos en este documento podrían conducir a la identificación de nuevas proteínas implicadas en la reparación ICL, que a su vez pueden servir como dianas farmacológicas que pueden ser explotados para mejorar la eficacia de los regímenes de quimioterapia del cáncer.

Aquí, un enfoque eficaz para evaluar la eficacia de la formación dirigida ICL-TFO en el ADN plásmido mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante se ha discutido. Además, el uso de los plásmidos que contienen las ICL dirigidas-TFO, las técnicas para determinar la asociación de HMGB1 con plásmidos dañadas-ICL en un contexto celular utilizando ensayos de chip modificados se han descrito. Además, un método fácil para el estudio de modificaciones topológicas introducidas por THe proteína HMGB1 arquitectónico, específicamente en sustratos plásmido dañados-ICL en lisados ​​de células humanas se ha determinado mediante la realización de ensayos de superenrollamiento a través de electroforesis en gel de agarosa de dos dimensiones. Las técnicas descritas se pueden utilizar para favorecer la comprensión de la implicación de la reparación del ADN y las proteínas de arquitectura en el procesamiento de daño del ADN objetivo en los plásmidos en las células humanas.

Describimos protocolos detallados para la formación de ICL de psoraleno específicas de sitio dirigidas-TFO en el ADN plásmido, y la posterior ChIP plásmido y superenrollamiento ensayos para identificar proteínas que se asocian con las lesiones, y proteínas que alteran la topología del ADN, respectivamente. Estos ensayos pueden ser modificados para llevar a cabo con otros agentes que daña el ADN, TFOs, sustratos de plásmidos, y las líneas de células de mamíferos de interés. De hecho, hemos demostrado que hay al menos un potencial afinidad único y de alta sitio TFO vinculante dentro de cada gen anotado en el genoma humano 26. Cómonunca, para mayor claridad, describimos estas técnicas para el uso de un conjugado TFO-psoraleno específico (pAG30) en un plásmido reportero mutación específica (pSupFG1) en células U2OS humanas como hemos utilizado en Mukherjee y Vasquez, 2016 16.

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Protocol

1. Preparación de ICL dirigidas-TFO en el plásmido Sustratos

  1. Incubar cantidades equimolares de plásmido pSupFG1 10,11 ADN (plásmido ADN 5 mg es un buen punto de partida) con psoraleno conjugado TFO GA30 en 8 l de tampón de unión triplex [glicerol al 50%, Tris 10 mM (pH 7,6), MgCl 10 mM 2] y dH 2 O hasta un volumen final de 40 l en un tubo de color ámbar. Mezcle bien con la pipeta hacia arriba y hacia abajo. Incubar la reacción a 37 ° C baño de agua durante 12 hr.
  2. Calentar la lámpara de rayos UVA para garantizar la máxima potencia de salida. Coloque la reacción triplex en la película de parafina, y colocar la lámina de parafina en el hielo bajo el (365 nm) de la lámpara UVA. Colocar un filtro Mylar entre la lámpara y la reacción.
  3. UVA irradiar para una dosis total de 1,8 J / cm 2. Almacenar las muestras a 4 ° C para su uso posterior.
    Precaución: Use gafas de protección adecuado y ropa con irradiación UVA.
  4. Linealizar 200 ng del plásmido preparado anteriormente con el reenzima restricción Eco R1 en un volumen total de 20 l usando el fabricante suministra 10x tampón. Heat desnaturalizar la enzima durante 20 min a 65 ° C. Girar las muestras durante 10 minutos a 10.000 xg y almacenar a 4 ° C.
  5. Preparar 50x tampón alcalino [NaOH 1,5 M, ácido etilendiaminotetraacético 50 mM (EDTA)]. Añadir 0,5 mg de agarosa a 50 ml de dH2O Hervir para disolver la agarosa y colocarlo en un baño de agua a 50 °.
  6. Después de que la temperatura de la agarosa disuelta se ha reducido a 50 ° C, añadir 1 ml del tampón 50x alcalino, se mezcla y luego verter el gel en la bandeja de gel. Deje que el gel se solidifique a temperatura ambiente antes de su uso.
  7. Añadir 4 l de 0,5 M EDTA a los 20 l de muestra de ADN linealizado y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente.
  8. Añadir tampón de carga de gel alcalino 6x (NaOH 300 mM, EDTA mM 6, 18% (w / v) de alto peso molecular polisacárido, 0,06% verde de bromocresol en dH 2 O) a las muestras y a una escalera de ADN de 1 kb.
    NOTA: Es importante usar un tampón de carga de gel 6x alcalina, por favor véase el debate.
  9. Cargar las muestras en el gel en la cámara frigorífica y correr durante la noche en tampón alcalino 1x (12-16 h) en 3,2 voltios por cm. Una vez que las muestras han entrado en el gel, colocar una placa de vidrio en la parte superior del gel para evitar que se flotante.
  10. Neutralizar las muestras por inmersión del gel en tampón de neutralización [1 M Tris-Cl (pH 7,6), 1,5 M NaCl, acetato de sodio 3 M (pH 5,2)] durante 45 min a temperatura ambiente.
  11. Tinción del gel para el ADN con 4 l de 1% de bromuro de etidio (EtBr) en 50 ml de agua durante 1 hora a temperatura ambiente. Destain con agua durante 15 minutos. Visualizar el ADN mediante el uso de un sistema de imagen.
    Precaución: EtBr es un potente mutágeno y puede ser absorbido por la piel. Evitar el contacto directo con EtBr.

2. Transfección e inmunoprecipitación de los plásmidos que contienen ICL-dirigidos-TFO en las células humanas

  1. Placa de 400.000 células de mamíferos (por ejemplo, U2OS océlulas steosarcoma) por placa de 60 mm en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) sin antibióticos 24 h antes de la transfección. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C con 5% de CO 2.
  2. Antes de la transfección, el medio de crecimiento caliente y solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 ° C en un baño de agua. Calentar el reactivo de transfección a temperatura ambiente.
  3. Incubar 30 l de reactivo de transfección con 500 l de medio de crecimiento 1x (mezcla 1) y 2 g de tubos de fondo redondo-dirigidas TFO ICL que contiene plásmidos en 500 l de 1x medio de crecimiento (mezcla 2) en separadas 14 ml durante 10 minutos a temperatura ambiente.
  4. Añadir la mezcla de 1 a 2 mezclar, mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo. Incubar durante 25-30 minutos a temperatura ambiente.
  5. Lavar las células dos veces con PBS caliente. Añadir la mezcla de transfección de una manera gota a gota distribuir uniformemente a través de la placa de células. Añadir 1 ml de medio de crecimiento a la placa y llevar el volumen final a 2 ml. mezclar nosll. Colocar las placas de cultivo en el incubador a 37ºC con 5% de CO2 durante 4 horas.
  6. Reemplazar los medios de comunicación con los medios 3 ml de crecimiento suplementado con FBS al 10%, y se incuba durante 16 horas más. No utilice antibióticos.
  7. Tratar las células con 80 l de 37% de formaldehído fresca por placa a una concentración final de aproximadamente 1% y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente en ausencia de luz.
    Precaución: El formaldehído es tóxico y debe ser manejado de acuerdo con sus instrucciones de seguridad. La exposición al formaldehído puede causar daño a la piel, los ojos y el tracto respiratorio.
  8. Se detiene la reticulación de formaldehído mediante la adición de 300 l de glicina enfriada (suministrado en kits disponibles en el mercado) por placa y la incubación durante 5 min. Retire el medio y lavar dos veces con PBS enfriado, y luego recoger las células por raspado en 1 ml refrigerado (4 ° C) de PBS en un tubo de microcentrífuga. Mantener las muestras en hielo en todo momento.
  9. Preparar los sedimentos celulares por centrifugación a 4 ° C durante 5 min unat 13.400 xg utilizando una centrífuga de mesa refrigerada. Pipetear a cabo el sobrenadante y coloque el sedimento de células en hielo.
  10. Homogéneamente resuspender el precipitado en 1 ml enfriado (4 ° C) Tampón A (suministrado en kits disponibles en el mercado) y se incuba en hielo durante 10 min. Mezclar ocasionalmente invirtiendo el tubo. Precipitar las células como antes (véase el paso 2.9).
  11. Homogéneamente resuspender el precipitado en 1 ml enfriado (4 ° C) Tampón B (suministrado en kits disponibles en el mercado) y se incuba en hielo durante 10 min con mezcla ocasional por inversión. Precipitar las células por centrifugación como antes (véase el paso 2.9).
  12. Resuspender las células de nuevo en 200 l refrigerados Tampón B. Añadir 2 l de nucleasa microcócica (MNasa) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Mezcla de reacción de vez en cuando con un movimiento rápido del tubo. Detener la reacción MNase colocando el tubo en hielo y añadiendo EDTA 40 mM. Precipitar las células como antes (véase el paso 2.9).
  13. Resuspender las células en 100 l 1x immunopr cromatinatampón de memoria intermedia (ChIP) ecipitation (suministrado en kits disponibles en el mercado) suplementado con cóctel inhibidor de la proteasa.
  14. Colocar las células resuspendidas en un tubo de microcentrífuga de pared delgada. Sonicar las muestras por ellos flotando en el agua baño de ultrasonido durante 20 segundos, seguido de 20 segundos de incubación en hielo. Repita los pasos del tratamiento con ultrasonidos 9 veces para generar ~ 800-1.200 pb fragmentos.
    1. A 20 l de las muestras sonicadas añadir 3 l 5 M NaCl y 1 l de RNasa A. Mezclar bien por agitación e incubar a 37 ° C durante 30 min. Posteriormente, añadir 2 l de proteinasa K y se incuba durante 2 horas a 65 ° C. Purificar las muestras usando un kit de purificación de PCR. Ejecutar las muestras en gel de agarosa al 1% y visualizar con EtBr.
      NOTA: Intensidad máxima del ADN resultante debe estar en o por debajo de 1.000 pb.
  15. En tres tubos separados, añadir 30 l de lisado en un tubo de silicona previamente enfriada y luego añadir 70 l de tampón 1x chip refrigerado con inhibidores de la proteasa añadido. Añadir 1 μg de anti-inmunoglobulina G (IgG), H3 anti-histona (como control positivo), o anticuerpos anti-HMGB1 a los respectivos tubos. Incubar toda la noche en una habitación fría con la rotación continua.
  16. perlas de proteína G Resuspender homogéneamente en la habitación fría. Añadir 4 l de proteína G cuentas por tubo y se incuba durante otra 2-4 hr en la cámara fría con la rotación.
  17. El uso de un bastidor magnético, sedimentar las perlas y eliminar el sobrenadante. Añadir 200 l de tampón 1x ChIP mezclado con cóctel inhibidor de proteasa para el sedimento y se lava durante 5 minutos en la cámara fría con la rotación. Repetir el lavado dos veces.
  18. Realizar un lavado adicional con alto contenido de sal tampón 1x chip (que contenía NaCl 70 mM).
  19. Resuspender los sedimentos con tampón de elución 160 l (suministrado en kits disponibles en el mercado) y se incuba a 37 ° C con rotación durante 30 min.
  20. Sedimentar las perlas y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. Añadir 6 l de NaCl 5 M y 2 l de proteinasa K, y se incuba durante la noche a 65DO.
  21. Se purifica el ADN utilizando un kit de purificación de productos de PCR y se eluye el ADN utilizando 50 l dH 2 O.
  22. Realizar PCR 16 reacciones que usan conjuntos de cebadores para la región (s) de interés, y resolver los productos en un gel de agarosa al 1% teñido con EtBr.

3. Ensayo de superenrollamiento y 2-dimensional en gel de agarosa La electroforesis

  1. Preparar tampón de síntesis de reparación de ADN (45 mM Hepes-KOH, pH 7,8; mM KCl 70; 7,4 mM MgCl 2; TDT 0,9 mM; EDTA 0,4 mM; ATP 2 mM, 20 mM dNTPs, 3,4% de glicerol y 18 mg albúmina de suero bovino) . Almacenar a -80 ° C. Descongelar en hielo y antes de su uso añadir fosfocreatina 40 mM y 2,5 g de creatina fosfoquinasa.
  2. Preparar tampón 10x superenrollamiento [500 mM de Tris (pH 8,0), NaCl 500 mM, 25 mM de MgCl2, EDTA 1 mM], y se almacena a temperatura ambiente.
  3. Linealizar 300 ng de ADN plásmido superenrollado pSupFG1 por completo con 1 l de vaccinia topoisomerasa I (5-15 U / l) con 1 monitortampón de superenrollamiento en una reacción de 10 microlitros. Incubar la mezcla a 37 ° C durante 1 hr.
  4. Descongelar HeLa extracto libre de células 24 en el hielo. Para los plásmidos completamente relajado, añadir 25 l HeLa extracto libre de células y el tampón de la síntesis de reparación del ADN. Mezclar bien. Añadir 1 l adicionales de la vacuna topoisomerasa I a la mezcla, y se incuba durante 1 hora a 37 ° C.
  5. Terminar las reacciones mediante la adición de dodecil sulfato de sodio (SDS) (1% de concentración final) y proteinasa K (0,25 mg / ml de concentración final). Incubar a 65 ° C durante 2 hr.
  6. Reparto de un gel de agarosa al 1% con tampón 1x Tris Borato EDTA (TBE). Añadir colorante de carga de ADN y cargar las reacciones directamente sobre el gel de al menos 4 carriles separados. Ejecutar el gel de 8-10 horas a 2 V / cm en TBE 1x (dimensión 1) a temperatura ambiente para resolver los topoisomers.
    NOTA: Preparar una solución madre 5x TBE en 1 l de dH2O mediante la adición de 54 g de base Tris. 27,5 g de ácido bórico y 20 ml de 0,5 M EDTA (pH 8,0).
  7. Preparar 2 L de 1xTBE con 3 mg / ml de cloroquina-fosfato. Remojar el gel en 200 ml de esta solución durante 20 min. Cubra la bandeja de gel con papel de aluminio.
  8. Para a electroforesis el gel en la segunda dimensión, gire el gel a 90 ° en un sentido horario y ejecutarlo para 4-6 horas a 2 V / cm en la cloroquina que contiene 1x TBE para resolver los supercoils positivos y negativos.
  9. Teñir el gel con bromuro de etidio durante 1 hora en un agitador. Destain el gel con dH 2 O durante 15 min y posteriormente visualizar la distribución térmica de los topoisomers utilizando un generador de imágenes.

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Representative Results

La formación de la ICL dirigida TFO es crítico para los ensayos basados ​​en plásmidos, que se utilizan para interrogar a las funciones de las proteínas de arquitectura en el procesamiento de ICL en células humanas. Electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa es una manera fácil de determinar la eficacia de la formación ICL dirigida TFO. Los plásmidos que albergan ICL dirigidas-TFO migran con una movilidad más lenta a través de la matriz de gel de agarosa (Figura 1A, carril 3) en comparación con los plásmidos de control no reticulado (Figura 1A, carril 2). La cuantificación densitométrica de las bandas en los carriles 2 y 3 (Figura 1A) revela aproximadamente 70% de la población plásmido migra a través del gel con la movilidad más lenta (identificado por una flecha negro), lo que indica la formación de ICL dirigida TFO en esos plásmidos.

Los ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina realizados en extractos de células U2OS humano transfected con cualquiera de los plásmidos de control (P) o plásmidos que contienen ICL dirigidas-TFO (P-ICL) muestran enriquecimiento de HMGB1 en la región P-ICL en comparación con la región de control (P), cuando inmunoprecipitó con un anticuerpo anti-HMGB1 (Figura 2 , panel superior, carriles 2 y 3). Estos resultados indican que los asociados con los HMGB1 ICL en las células humanas. Cuando se agotó HMGB1 de las células mediante el tratamiento siRNA, el enriquecimiento P-ICL-específica fue disminuida (Figura 2, panel superior, carriles 4 y 5), como se esperaba. Cuando las mismas muestras se inmunoprecipitaron utilizando un anticuerpo anti-IgG como control de especificidad de anticuerpos, no se detectó amplificación de PCR, como se esperaba (Figura 2, panel superior, carriles 6-10). Carriles 10-14 (panel superior) en la figura 2 eran muestras de entrada utilizadas para la normalización. El panel superior muestra la amplificación de PCR por los cebadores cerca del sitio de ICL dirigida TFO y el panel inferior muestra la amplificación por PCR cuando cebadores distales a la TFO dirigidaSe han usado ICL sitio.

HMGB1 es una proteína de arquitectura, que se une a DNA distorsionada con mayor afinidad que se une al ADN en buen estado. Los ensayos de superenrollamiento del ADN resuelto a través de electroforesis en gel de agarosa de dos dimensiones demuestran la modificación de arquitectura de los plásmidos que contienen ICL-dirigidos-TFO (P-ICL) en comparación con el control de plásmidos (P) por HMGB1 en extractos de células HeLa (Figura 3). La modificación de arquitectura inducida por HMGB1 preferiblemente en sustratos P-ICL que contienen se detecta como aumento de superenrollamiento negativo. plásmidos superenrollado migran más rápido a través de geles de agarosa en relación con plásmidos relajado o lineal. La distribución de los topoisomers indica más superenrollamiento de los P-ICL en comparación con P en presencia de HMBG1 (Figura 3). ADN superenrollado negativamente ejecuta como zurdo arco en la segunda dimensión, en presencia de cloroquina. El superenrollamiento inducida por HMGB1 en la P-ICLparece consistir principalmente de topoisomers que forman un arco de la mano izquierda (~ 14 topoisomers se identificaron sobre la ICL dirigida TFO que contiene plásmidos en comparación con ~ 7 topoisomers a partir del plásmido de control), lo que indica la formación de supercoils negativos. En conjunto, estos datos sugieren que los plásmidos con ICL dirigidas-TFO pueden ser utilizados como una herramienta para estudiar la asociación de alta afinidad de la proteína HMGB1 arquitectónico con las lesiones del ADN en las células humanas a través de ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina. Además, las modificaciones de arquitectura específicas de los sustratos de P-ICL por HMGB1 también se pueden estudiar usando ensayos de superenrollamiento y geles de agarosa de dos dimensiones.

Figura 1
Figura 1: ensayo de electroforesis en gel de agarosa alcalina para cuantificar dirigida por TFO eficiencia en la formación de ICL en el pSupFG1 plásmido (A) Carril escalera de ADN de 1, 1 kb;. carril 2, plasmid pSupFG1 (P) que se utiliza como un control; y el carril 3, TFO-dirigida ICL contiene pSupFG1 (P-ICL). Los plásmidos que albergan ICL migran más lentamente en el gel como se ha demostrado en el carril 3 (indicada por la flecha negro en el lado derecho del gel). (B) densitométrico cuantificación de las bandas en el carril 2 y el carril 3 indican que aproximadamente el 70% de los plásmidos son reticulado. Esta cifra ha sido modificado a partir de 16 de referencia. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: ChIP demostrando ensayo de enriquecimiento de HMGB1 en la ICL-que contiene la región dirigida TFO del plásmido reticulado (A). la amplificación por PCR de los fragmentos inmunoprecipitadas se resolved en un gel de agarosa al 1% usando un conjunto de cebadores proximales cerca del sitio dirigida por TFO ICL (B; P1 y P2, panel superior) y un segundo conjunto de cebadores utilizados como control de especificidad que eran más (aproximadamente 2000 pb) a partir de la ICL dirigida al sitio (B; P3 y P4, panel inferior). Carriles 2 y 3 indican enriquecimiento de HMGB1 cerca de la ICL dirigida TFO (carril 3) con respecto al ADN intacto (carril 2). Las calles 4 y 5 son controles de especificidad de anticuerpos utilizando un anticuerpo IgG. Carriles 6 y 7 son las muestras de entrada. Carril 8 es un control negativo para la reacción de PCR y no contiene ninguna plantilla de ADN. P, el plásmido pSupFG1. P-ICL, TFO-dirigida ICL-plásmido que contiene pSupFG1. Esta cifra ha sido modificado de referencia 16. (B) Un diagrama esquemático del plásmido pSupFG1 que muestra los sitios de los cebadores para P1 y P2, así como P3 y P4. Haga clic aquí para conocer el vers más grandesión de esta figura.

figura 3
Figura 3: 2D electroforesis en gel de agarosa que muestra la formación de supercoils negativos en plásmidos ICL contienen dirigidas-TFO, facilitado por HMGB1 El gel de agarosa 1x TBE revela la distribución térmica de los topoisomers generados por el plásmido solo (P) o el psoraleno-reticulado. plásmido (P-ICL). La movilidad de las especies supercoiled es más rápida en comparación con los plásmidos relajado. Cada banda representa un topoisomer que difiere de la banda por debajo o por encima de una vuelta más o menos superhelical, respectivamente. El arco con la mano izquierda representa superenrollado negativamente a las especies (-ve) y el arco diestro representa superenrollado positivamente (+ ve) especies. La ICL contiene población plásmido psoraleno (P-ICL) contiene más supercoiled especies que los plásmidos de control (P). R, plásmidos relajado; S, plásmidos superenrollado; 1D,primera dimensión de la electroforesis en gel; 2D, segunda dimensión de la electroforesis en gel. Esta cifra ha sido modificado a partir de 16 años. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La formación eficiente de ICL dirigidas-TFO depende de dos factores cruciales: En primer lugar, los componentes del tampón adecuado (por ejemplo, MgCl 2) y el tiempo de incubación de la TFO con su sustrato de ADN diana (depende de la afinidad de unión del TFO a su diana dúplex y las concentraciones se utiliza); y segundo, la dosis apropiada de UVA (365 nm) de irradiación para formar entrecruzamientos de psoraleno de manera eficiente. la formación de triplex óptimo se puede lograr mediante el uso de HPLC o de gel TFOs purificados. Las impurezas que contaminan el TFO pueden conducir a productos reticulados no deseados, que pueden complicar aún más el resultado experimental. Para aumentar la estabilidad de la TFOs unido covalentemente a un psoraleno 5'-HMT, los TFOs se deben almacenar en alícuotas a -80 ° C, como múltiples deshielo de congelación de la TFOs puede resultar en la degradación de los oligonucleótidos. Después de la formación de triplex para apuntar el psoraleno a un sitio específico (por ejemplo, 5'-TA-3 'y 5'-AT-3' son el prepsoraleno conferido sitios de reticulación), la formación ICL psoraleno requiere la irradiación con UVA. Una dosis de 1,8 J / cm 2 UVA es suficiente para la formación óptima de ICL en plásmidos in vitro. El tiempo de exposición se debe determinar mediante el uso de un fotómetro. Dependiendo de la fuente de la lámpara UVA, además de emisores de UV a 365 nm, la lámpara puede también emitir longitudes de onda más cortas, que pueden conducir a la formación de daños en el ADN no deseado a lo largo de la columna vertebral del ADN. Debido a que los plásmidos que contienen ICL-dirigidas-TFO serán utilizados para los estudios relacionados con la reparación del ADN de una ICL en un sitio específico, tales productos fotoquímicos no deseados pueden confundir los resultados de los estudios de reparación del ADN. Por lo tanto, un filtro de Mylar se debe utilizar para evitar la exposición de las muestras a longitudes de onda más cortas. formación ICL éxito también depende de la estabilidad de la estructura triplex durante la irradiación UVA. El momento de la irradiación UV requerida depende de la potencia de la fuente de UVA. En nuestro caso, se requiere 20 a 30 min para generar THe dosis de UVA deseado. Durante este tiempo, el calor generado por la lámpara puede causar la pérdida de agua por evaporación de las muestras. Tal pérdida de agua puede alterar la concentración de tampón y puede causar la desestabilización de las estructuras de triple hélice. La colocación de las reacciones en hielo durante la irradiación UVA ayudará a evitar la evaporación de las muestras.

Con el fin de determinar la eficacia de la formación de reticulación de psoraleno en los sustratos de plásmido, las muestras se resolvieron en geles de agarosa al 1% alcalinas (Figura 1). La mayoría de los protocolos para la electroforesis en gel alcalino sugieren un colorante de carga de gel 2x alcalina, aunque algunos protocolos sugieren que colorante de carga alcalina no es necesario, como la condición de tampón de desnaturalización del gel es suficiente para desnaturalizar las muestras. Si bien un tinte 2x funciona bien con muestras de ADN concentrados, dicho protocolo requiere la carga de un gran volumen de muestra. Por lo tanto, utilizar un colorante de carga de gel 6x alcalina. Para asegurar la desnaturalización apropiada del psoraleno reticulado plsustratos asmid, se incuban las muestras en el tampón de carga durante 10 minutos a temperatura ambiente. Además, Mg 2+ puede formar Mg (OH) 2 en condiciones alcalinas, que atrapa el ADN y puede hacer que se precipite. El tampón de reacción de formación de triplex contiene Mg 2+, y por lo tanto es importante incubar las muestras con EDTA para asegurar que el Mg 2+ está quelado antes de añadir el colorante de carga alcalina a las muestras. Después de la electroforesis, es importante para neutralizar el gel, como EtBr no intercalar con el ADN en condiciones alcalinas.

Un enfoque alternativo para evaluar la eficiencia de la formación de reticulación dirigido TFO es el uso de electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida, pero esta técnica es más laborioso, y requiere la digestión de restricción de los plásmidos seguidos por etiquetado isótopo radiactivo de los fragmentos. Este enfoque actual demuestra un método relativamente simple, pero eficaz para determine la eficiencia de la formación de ICL dirigida TFO sobre sustratos de plásmidos. Sin embargo, esta técnica se puede aplicar para evaluar la formación de ICL por otros agentes de formación de reticulación también.

resultado exitoso del ensayo ChIP plásmido depende de una serie de factores. Los pasos críticos dentro de las sugerencias de protocolo y solución de problemas se discuten aquí. Los pasos críticos que participan en este ensayo, incluyen la reticulación de formaldehído, la digestión de nucleasa microcócica, sonicación, lavados de la muestra, y la inversión de las formaldehído reticulaciones de proteínas de ADN en las muestras. Para eficiente reticulación de proteínas de ADN, es importante utilizar formaldehído fresco. botellas del stock de formaldehído al 37% no deben utilizarse durante más de seis meses después de su apertura, ya que la exposición a la luz y el oxígeno degrada formaldehído. Por lo tanto, también es beneficioso para realizar la reticulación de formaldehído sin luz en la campana de cultivo de células. Otro paso importante es micrococcal nucleasa (MNase) digestion de las muestras. digestión MNase no sólo escinde el ADN genómico en fragmentos más pequeños, sino también elimina los plásmidos persistentes que no fueron entregados a las células durante el procedimiento de transfección, lo que puede reducir drásticamente el fondo. El tiempo de incubación de la digestión MNase debe determinarse empíricamente. digestión más largo puede resultar en la pérdida de las muestras, mientras que los períodos de incubación más cortos pueden conducir a la eliminación ineficiente de ADN no deseado. Excelentes resultados se pueden ver después de 10 min de incubación a temperatura ambiente con mezclado ocasional de las reacciones por inversión de los tubos. Para la inmunoprecipitación eficiente, el ADN debe ser fragmentado a los tamaños de entre 800-1.200 pb. Esta fragmentación de ADN se puede lograr por tratamiento con ultrasonidos a fondo de las muestras. sonicación eficiente de las muestras puede lograrse mediante re-suspensión los gránulos en tubos de PCR de pared delgada y, posteriormente, colocándolas en un sonicador de baño de agua. pulsos de Sonic son más eficaces en comparación con sonicación continua. en adicion, es importante colocar las muestras en hielo entre pulsos para impedir la degradación de proteínas, y también es importante para complementar el tampón 1x chip con inhibidores de la proteasa, como proteínas estables son necesarios para el reconocimiento de anticuerpos y las subsiguientes etapas de precipitación. Sin embargo, durante el proceso de inmunoprecipitación, debido a la naturaleza hidrófoba de las perlas magnéticas, el ADN no específica se tira hacia abajo. Para reducir las señales de las plantillas de este tipo no específicos, lavado rigurosa es absolutamente necesario. Por último, adecuada reversión de las reticulaciones de proteínas de ADN de las muestras es necesario para la amplificación PCR de las plantillas de inmunoprecipitadas. Para lograr resultados óptimos, las muestras se deben incubar durante al menos 12 horas con SDS y proteinasa K. Hay beneficios de usar un chip de ensayo a base de plásmido sobre ensayos de chip genómicos. Por ejemplo, el daño del ADN objetivo se puede lograr fácilmente usando un sustrato de ADN de plásmido y un TFO, en comparación con la formación de lesiones-dirigida de TFO en un locus genómico. La Amonte de sustrato también puede ser controlado para modular la intensidad de las señales cuando se usa un plásmido dañado-dirigida de TFO. Además, tales sustratos se pueden utilizar en cualquier línea celular de elección y se ensayaron para la asociación con varias proteínas candidatas, para así ampliar el alcance de los estudios sobre el tratamiento y la reparación de ICL.

El ensayo de superenrollamiento se basa en la diferencia de forma entre lineal y el ADN plásmido superenrollado. plásmidos de ADN superenrollado son más compactos y migran más rápido a través de la matriz de gel en comparación con plásmidos relajado. Los pasos críticos dentro de las sugerencias de protocolo y solución de problemas se discuten aquí. Debido a que las proteínas de arquitectura facilitan modificaciones topológicas sobre sustratos de ADN dañadas, medido a través de la inducción de superenrollamiento de los plásmidos relajado, es fundamental para relajarse por completo los plásmidos con la topoisomerasa I. Es necesario examinar el grado de relajación del ADN causado por la topoisomerasa I a través de gel de agarosa electroforesis.El MgCl 2 presente en el tampón superenrollamiento puede precipitar con el tiempo, y la presencia de MgCl 2 afecta a la distribución térmica de los supercoils positivos y negativos, facilitando la formación de supercoils positivos. Por lo tanto, es beneficioso añadir MgCl 2 por separado a la mezcla o preparar tampón fresco cada vez. Para separar los topoisomers de las poblaciones de plásmidos, es importante llevar a cabo la electroforesis en gel a una tensión muy baja (~ 2 V / cm), de manera que la migración del ADN se basa predominantemente en la estructura / forma de las moléculas. Si la relajación de los plásmidos de topoisomerasa I no es completa, entonces el tiempo de incubación y / o la cantidad de enzima utilizada se debe aumentar. relajación completa debe garantizarse antes de pasar a la etapa de superenrollamiento del ADN posterior ya que el uso del ensayo de superenrollamiento con plásmidos de forma incompleta relajado puede conducir a una mala interpretación de los datos y los resultados pueden ser difíciles de reproducir. Una vez complete relajación se ha logrado, el ensayo de superenrollamiento es relativamente fácil de realizar. Un componente importante de este ensayo es el uso de un tampón de síntesis de reparación de ADN. Se requiere la fosfocreatina y la creatina fosfoquinasa a ser añadido a la mezcla cada vez para generar ATP. Después de la etapa superenrollamiento, es importante para eliminar las proteínas de la ADN plásmido mediante la incubación con SDS y proteinasa K. SDS ayuda a disociar las proteínas a partir del ADN y proteinasa K degrada la proteína, lo que deja el ADN intacto con varios niveles de superenrollamiento . Si la proteína no se elimina completamente, la distribución térmica de los topoisomers no será claramente visible. El ADN no puede ser purificado por fenol: cloroformo: alcohol isoamílico y se precipitaron con etanol ya que este método (y otros) pueden nick ADN, dando como resultado la pérdida de superenrollamiento. Otro paso importante es la adición de cloroquina en la memoria intermedia. La cloroquina es un agente intercalante y se desenrolla el ADN. Sobreintercalación, relaja el ADN superenrollado negativamente e introduce superenrollamiento positivo de ADN relajado que facilita la separación de los topoisomers que contienen una alta densidad de superenrollamiento. Por lo tanto supercoils positivos y negativos pueden ser diferenciados. Esto es generalmente un experimento fácil y es altamente reproducible cuando todos los puntos anteriormente se consideran.

Sin embargo, si no superenrollamiento es obvio, a continuación, es necesario determinar la actividad de la proteína de interés. El ensayo de superenrollamiento 2D se ha utilizado para estudiar modificaciones topológicas facilitado por las proteínas de arquitectura 27. Este ensayo se ha usado aquí en el contexto del tratamiento de daño en el ADN de ICL dirigidas-TFO en las células humanas. HMGB1 se une a ICL dirigidas-TFO con alta afinidad y especificidad, como se ha demostrado anteriormente a través de gel de ensayos in vitro movilidad electroforética turno de 20 y en células humanas usando el ensayo ChIP plásmido descrito dentro de 16. Aquí, ucantar el ensayo de superenrollamiento 2D se ha demostrado que tras la unión a las ICL dirigidas-TFO en HeLa extractos libres de células, asistencias HMGB1 en la formación de superenrollamiento negativo sobre los sustratos (Figura 3), que puede ser un paso importante en la reparación de la lesión porque superenrollamiento negativo es conocido para facilitar la eliminación de daños en el ADN a través de la vía NER 25. Hay muchas proteínas de arquitectura que han sido implicados en el procesamiento de daño en el ADN que podrían estudiarse usando este ensayo. Este enfoque se limita a los estudios in vitro, sin embargo, es un ensayo simple y útil para interrogar a la relación estructura-función de las proteínas de arquitectura en el contexto de la reparación de daños en el ADN. Sin embargo, el chip de protocolo puede ser modificado fácilmente para estudiar las interacciones ADN-proteína en el contexto del genoma, mientras que la evaluación de los efectos sobre el superenrollamiento del ADN por dichas interacciones puede llegar a ser bastante difícil. Nosotros y otros grupos han hecho pestudios basados en triplex erformed 1) por transfección estable del plásmido de ADN en el genoma de 28 al 30 02) por la orientación de un locus genómico 31-33 y 3) mediante la incorporación de la TFO psoraleno-modificado (y la irradiación UVA) en las células después de la transfección del plásmido 10.

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Acknowledgments

Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio Vásquez útil para los debates. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional del Cáncer [CA097175, CA093279 a KMV]; y la Prevención del Cáncer y el Instituto de Investigación de Tejas [RP101501]. La financiación de cargo de acceso abierto: Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional del Cáncer [CA093279 a KMV].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5'HMT Psoralen-AG30 Midland Certified Reagent Co., Midland, TX Custom order HPLC (or gel) purified
Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit Cell signaling Inc. 9003 Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.
GoTaq Green Promega M7122 PCR master mix
HMGB1 antibody Abcam Ab18256
Wizard Gel and PCR cleanup kit Promega A9281
Chloroquine-diphosphate salt Sigma C6628-50G For two-dimensional agarose gel electrophoresis
EcoRI New England BioLabs R0101S
GenePORTER transfection reagent Genlantis T201015
Vaccinia Topoisomerase I Invitrogen 38042-024
Blak-Ray long wave ultraviolet lamp Upland, CA B 100 AP UVA lamp
EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 Epigentek EQC-1100 Water bath sonicator
Mylar filter GE Healthcare Life Sciences 80112939
Agarose Sigma-Aldrich A6111
BIO-RAD Chemidoc BIO-RAD XRS+ system DNA imaging system
Glycine Fisher Scientific BP381-500
37% Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775-25ML Used for crosslinking 
Proteinase K New England Biolabs P8107S
DMEM ThermoFisher 11965092 Cell culture media
PBS ThermoFisher 70013073 Cell culture
Trypsin-EDTA ThermoFisher 25200056 Cell culture
Bromocresol green Sigma-Aldrich 114-359 DNA loading dye
Siliconized tubes Fisher Scientific  02-681-320 Low retention microfuge tube
Tris base Fisher Scientific BP152-1
Boric Acid Fisher Scientific A74-1
EDTA Fisher Scientific BP24731
Photometer InternationalLight Technologies ILT1400-A UVA dose measurement
Cell lines
Human U2OS osteosarcoma ATCC ATCC HTB-96 Cultured according to supplier’s recommendation
Human cervical adenocarcinoma HeLa ATCC ATCC-CCL-2 Cultured according to supplier’s recommendation
Proximal forward primer 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Proximal reverse primer 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Distal forward primer 5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Distal reverse primer 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc

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References

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Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks. J. Vis. Exp. (117), e54678, doi:10.3791/54678 (2016).

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