Abstract
発見し、結核（TB）治療期間を短縮する抗感染を進行する緊急の必要があります。 結核菌、結核の病原体は、原因表現型の薬剤耐性を示す菌の存在に迅速かつ持続的な化学療法に難治性です。 ssay（CARA）esazurin C harcoal Aガーrは 結核菌を複製し、非複製に対するハイスループットスクリーニングキャンペーンによって発見された活性分子を特徴づけるためのツールとして開発されました。細菌学的寒天培地中の活性炭の含有は、化合物のキャリーオーバーの影響を緩和するのに役立ちますし、CARAマイクロプレート上にスポッティングする前に、細胞を事前に希釈する必要がなくなります。 37℃で7〜10日間のインキュベーション期間の後、CARAマイクロプレートウェルの表面上に成長マイコバクテリアの微小コロニーによるレサズリンの還元は、半定量的ASSEを可能にします蛍光法を介した細菌数のssment。 CARAは約細菌数で2-3ログ10差を検出し、≥99％の細菌を殺す（MBC≥99）に至る最小殺菌濃度を予測します。 CARAは、分子が複製されている菌、非複製、またはその両方にアクティブであるかどうかを判断するのに役立ちます。 CARAを用いたパイロット実験は、試験薬剤および化合物暴露の時間の濃度は、コロニー形成単位（CFU）アッセイによりさらに評価を必要とするの識別を容易にします。複製活性物質は殺菌性または静菌性である場合に加えて、CARAは予測することができます。
Introduction
結核菌 、結核の病原体は、抗生物質の根絶に難治性である潜伏状態で、ホストの中で生き残ることができます。感染中の結核菌の表現型（非遺伝的）抵抗は非複製桿菌1,2の集団と、部分的に起因すると考えられています。表現型の薬剤耐性を表示するクラスI存続は、薬剤感受性細胞3,4の大集団の中でまれな確率論的機構を介して起こります。クラスII存続は、感染中に発生した微小環境における外部ストレスを含む宿主免疫の要因によって非複製をレンダリングされます。我々は最近、活性化マクロファージおよび肉芽腫で結核菌が直面条件を模倣するために、クラスII非複製持続性のin vitroモデルを開発しました。クラスII持続のマルチストレスモデルは、その条件を含む、脂肪酸の炭素源、及び完全にHALのような遅い成長、このような穏やかな酸性度（pH値5.0）、低酸素（1％O 2）、一酸化窒素および他の反応性窒素中間体5-9のようにTの成長、。非複製のこのマルチ応力モデルを用いた大規模スクリーニング、および他のクラスII非複製モデルは、その活性が非複製状態5-7,9-18に対して向けられる多様な分子をもたらしました。同じ非複製画面も複製および非複製桿菌の両方に対して活性を有する分子のカテゴリを明らかにし、「二重の活性物質」7,10,12,19,20と呼ばれます。
ヒット・ツー・リード段階で抗菌薬の発見は、ヒットの拡張、予備的な薬理学的特性評価、標的の同定、および予備的なin vivoでの有効性試験のためのリード線を選択する候補分子の大規模な特性評価を伴います。初期段階として、抗感染薬は、それらの作用静菌または殺菌機構により分類し、殺菌場合、ワットされていますhether細菌の死滅は、時間および/または濃度依存性です。コロニー形成単位（CFU）アッセイは、これらの問題に対処するための古典的な、金の標準的な方法です。 CFUアッセイでは、細菌は、連続的に希釈し、アリコートを除去した後、試験剤に曝露され、そして希釈液のアリコートを、固体細菌学的培地に塗布し、生存細胞の成長を可能にするためにインキュベートします。最後に、細菌コロニーが列挙されています。 CFUアッセイは、生存コロニーを列挙するために、細胞および寒天を含むペトリプレートを希釈するためにマイクロタイタープレートを大量に必要とします。成長の遅いマイコバクテリアのためのCFUアッセイは、コロニーがプレート上に表示されるようにするために約3週間を必要とする彼らの遅い世代時間（18-24時間）、によって妨げられています。また、インキュベータ空間は、しばしば特殊な生物学的安全レベル3の施設に制限されます。
面倒ながら、CFUアッセイはmycobacter上の非複製およびデュアル活性分子の影響を特徴づけるためのゴールドスタンダードでありますIA。非複製アッセイは、細胞生存率の6-8を評価するためのアッセイを複製に結合されているような多くの高偽陽性率の対象となっています。例えば、 結核菌を複製に対して強力な活性を有する化合物（「アクティブ複製」）非複製アッセイ中に殺すために失敗することがありますが、それでもの非複製相からのキャリーオーバーによって殺すことができます複製（「複製条件」）をサポートしている条件下で実施されるアッセイの回復期にアッセイ。化合物は、さらに、それが困難な活動は非複製、複製、またはデュアルたかどうかを区別すること、二重活性分子の分析を複雑に繰り越します。
上記課題を解決するために、我々はそのようなM. tuberculなどのマイコバクテリア種の急速な、半定量的列挙にssay（CARA）をesazurin C harcoal AガーRを開発しましたOSIS、M.ボビス BCG、およびM.はスメグマチス 7（ 図1および図 2）。 インビトロでの緩衝液において、活性炭は急速結核7を治療するために使用される標準的な薬物の大部分を隔離します。アッセイマイクロプレートから繰り越すことができる化合物を結合し、CARAのこの機能は、シリアル前列挙7,21,22にアッセイウェルの内容物を希釈する必要がなくなりマイクロCARAで活性炭。 CARAマイクロプレートの寒天表面上のマイコバクテリア微小コロニーの数はレサズリンを添加することによって推定され、その還元型、レゾルフィン青色色素は、その蛍光分光光度計23によって測定されたピンク色の分子です。 M.のために1-2日間インキュベートされたマイクロプレートをCARAはスメグマチスや、 結核菌とM.ボビス BCGのような成長の遅いマイコバクテリアのための7-10日。 CARAは〜2-3ログ10 diffeの狭いダイナミックレンジを持っていますCFUでrence。代わりにCFUアッセイの使用する場合、単一CARAマイクロプレートは、連続希釈液およびめっきに使用される120トライスタイルの寒天プレートに使用される約5 96ウェルプレートに置き換えられます。 CARAデータの解釈はより面倒CFU-基づくアッセイをでテストするためにインキュベーション時間および化合物濃度を決定することによって、その後の研究を導くのに役立ちます。
Protocol
CARAマイクロプレートの調製
- あるいはオートクレーブ900 2Lのエルレンマイヤーフラスコ中の0.2％のグリセロール及び0.4％の活性炭を含むミドルブルック7H11寒天mlの、または、1 Lのガラスビーカー450ミリリットル。フラスコやビーカーに大きなオートクレーブ滅菌攪拌棒を含めます。アルミホイルでフラスコやビーカーの開口部をカバーし、オートクレーブテープでガラスに取り付けます。
- 懸濁液中の木炭を維持するために低速度に設定した磁気攪拌プレート上（約55〜65℃）に触れないようにクール。
- 磁気撹拌プレートを持つバイオセーフティフード内で無菌的に後続のすべての手順を実行します。
- ホイルを外します。 100ミリリットルOADCサプリメントを追加します（OADCサプリメント、10％で使用した場合、0.2％デキストロース、0.5％アルブミン、0.085パーセントのNaCl、0.0005％のオレイン酸、および0.4 mg / mlでカタラーゼの収率最終培地濃度）2 L三角フラスコへ、または1リットルのビーカーに50ミリリットルOADC、および混合を続けます。
- 三角フラスコを使用した場合、約25-4を注ぎます無菌試薬槽に7H11-OADC-炭の0ミリリットル。ビーカーを使用する場合は、試薬リザーバを使用する必要はありません。
- 200μL/ウェルの試薬槽やビーカーから7H11-OADC-木炭で96ウェルマイクロプレートを埋めます。寒天固化や気泡の導入を避けるために、迅速に作業。それが真菌汚染の原因になる可能性がありとして、井戸の外に固形培地をはね避けてください。マルチチャンネルピペットを用いて、96ウェルプレートの8行（AH）へ7H11-OADC-炭の転送のために12フィルターチップの1セットを使用します。
注：メディアはすぐに固化します。ピペットチップを詰まらないようにするには、頻繁に変更します。 - あるいは、多数のプレートを調製する際に支援するためにフィルターチップとP1000電子マルチチャンネルピペットを使用して、マイクロプレートCARAを注ぎます。
注：これによりマイクロプレートウェルの低体積に、CARAマイクロプレート内の寒天を注ぐの分以内に固化します。 - 再密封可能なプラスチック製のBAでCARAマイクロプレートの場所スタックgsが乾燥避けるために。
- 4℃でマイクロストアCARA。
2. 90アッセイを複製および非複製MICの設定
- 結核菌 、M。ボビス BCGを接種するか、M.は OD 0.01から0.1の580でスメグマチスとミドル7H9-ADNで対数期中期（OD 580〜0.5）に拡張（ミドル7H9は0.2％グリセロールを含む、0.2％デキストロース0.5％のアルブミン、0.085％のNaCl）又は7H9-OADC（ミドル7H9 0.2％グリセロール及び10％OADCサプリメントを含みます）。
- 細胞培養フラスコで培養を立って20ミリリットル〜として結核菌 およびM.ボビス BCGを育てるとM.は、ポリプロピレン丸底（4ミリリットル文化）または50mlコニカル遠心管（10〜20ミリリットル文化）で振とうしながらスメグマチス 。 20％O 2および5％CO 2、37℃での病原性マイコバクテリアをインキュベートし、M.、20％のO 2、37℃でスメグマチス 。
- 最小限の阻害を設定します濃度（MIC 90）条件（ 図2）を複製し、非複製の下-style実験。
注：試験薬剤は、通常、96ウェルマイクロプレートあたり、それぞれ、試験4、または2の化合物を可能にするために、重複または四連でアッセイされます。例えば、96ウェルプレート中で、一つの試験薬剤は、行EHの行のADと他のでアッセイすることができます。 DMSO（車両）は、列1、2、および12であり、試験薬剤の希釈系列は、カラム11（最高濃度）に3列（最低濃度）から実行されます。 MIC 90スタイルのアッセイは、典型的に2倍希釈系列を使用します。そこマイコバクテリア14-16,18,24,25に利用可能な多数の非複製のモデルがあり、例示的な目的のために、我々は、非複製6,8,9のマルチストレスモデルを使用しています。- 複製アッセイのために、透明底、組織培養処理した96ウェルプレートのすべてのウェルにOD 0.01の580で7H9-ADNで200μlの細胞を配布します。 <非複製アッセイのためLI>、0.02％チロキサポールを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を2回洗浄し、非複製培地（0.05％KH 2 PO 4、0.05％のMgSO 4、0.005％クエン酸第二鉄アンモニウムで再懸濁細胞、0.0001％のZnCl 2、0.1％NH 4 Clで、0.5％のBSA、0.085パーセントのNaCl、0.02％チロキサポール、0.05％酪酸; pHを2 N NaOHで5.0に調整）。
- 非複製培地でOD 0.1の580に細胞を希釈し、最終濃度0.5mMに新たに調製した1 MストックからのNaNO 2を追加します。
- 透明底、組織培養処理した96ウェルプレートのすべてのウェルにOD 0.1の580で200μlの細胞を配布します。
注：DMSO中の100倍ストック溶液として化合物の希釈液を調製します。このように、最終濃度0.4〜100μgので分子の影響を試験する典型的なMICプレート/ mlのDMSO中0.04から10 mg / mlでのストック溶液を必要とするであろう。
- ディの2μLを加えます行AEと行EHに試験剤2の希釈液を2μlに試験剤1のlutions。完全に混合。
- カラム1、2、12（行AH）、対照ウェルに2μlの車両制御（通常はDMSO）を追加します。完全に混合。
- 各実験について、このような0.004〜1 / mlの（複製アッセイ）および/または0.08〜20μgの/ mlの（非複製アッセイ）からのリファンピシンなどの少なくとも1つのポジティブコントロールが含まれています。
注：0.1〜25 / mlの非複製のマルチストレスモデルにおける選択的ナノ2依存性の活性を有する対照化合物として推奨されているに6-ブロモ-1H-インダゾール-3-アミンを使用する9。 - アッセイを複製するために、7日（ 結核菌 およびM.ボビス BCG）、または1から48時間（M.がスメグマチス ）のために20％O 2、5％CO 2で37℃でマイクロプレートインキュベートします。非複製のマルチストレスモデルは、<（1％O 2および5％CO 2で37℃で7日間インキュベートし、マイクロプレートem>のM。結核とM.ボビス BCG）。
CARAマイクロプレートの3接種
- CARAは、読み出しとして使用された時点で、慎重によく50-75μLに設定P200マルチチャンネルピペットを使用してMIC 90スタイルのアッセイプレートの内容物を再懸濁します。静かにピペットで上下に少なくとも5〜10倍とは、ピペットチップを使用して、円を描くようによく内容を旋回させます。
- CARAマイクロプレートに移し、アッセイウェルの内容物を10μl。アッセイプレート上のウェルの内容の順序がCARAマイクロプレートのウェル内容の順序と一致していることを確認してください。転送中に飛散を避け、10μlのは、CARAのマイクロプレートウェルの中央にスポットされていることを確認します。 CARAマイクロプレートに吸収10μlのを確認してください。
注：前CARAマイクロプレート上の細胞をスポッティングするために必要な一切の希釈はありません。 - プレートテープでマイクロCARAのスタックをバインドし、その後、再密封可能なビニール袋に入れます。マイクロCARAインキュベート20％O 2、37°C（M.がスメグマチス ）または1％O 2および5％CO 2（ 結核菌およびM.ボビス BCG）で。
- アッセイを複製、 結核菌とM.ボビス BCGの場合：7日間インキュベート。 結核菌とM.ボビス BCG非複製アッセイのために、10日間インキュベート。 M.はスメグマチスのために、アッセイを複製し、1〜2日間インキュベートします。 M.はスメグマチスのために、非複製アッセイは、2〜3日インキュベートします。
注：時間は見積もりであり、異なる複製、非複製、およびストレス条件のために応じて修正することができます。
4. CARAマイクロプレートの開発
- 細菌の増殖、または大きく、肉眼で見えるコロニーのフィルムは、負（車両）コントロールウェルに表示されたときにマイクロプレートCARAを開発します。
注：長時間のインキュベーション後、CARAのマイクロプレートウェル、多くの場合、ドライ表示され、我々は、滅菌PBSでプリウエット内容をよくお勧めします。これは、低蛍光またはウェル間の変動につながる可能性がレサズリンを、吸収から炭を防止する役割を果たす。 - マルチチャンネルピペットで12 P200チップの単一のセットを使用して、ウェルの側面に沿って滅菌PBS40μlのを分配し、PBSは、寒天/細菌微小コロニーの上部に配布することができます。
- CARAは、5mgレサズリン（最終0.01％）、PBS中5％のTween80 50ミリリットルを混合することにより、試薬を開発して準備します。渦と滅菌フィルター。
注：PBS中の10％Tween80を1（体積/体積）の代替CARA現像試薬が1で溶液レサズリン商業的に調製された混合することにより調製することができます。 - 12チャンネルピペットを用いて、CARAマイクロプレートの各ウェルに試薬を開発し、新たに調製したCARAの50μLを加えます。ロックプレートは前後に数回は、各ウェル中の寒天および細菌マット全体で試薬を分配するのに役立ちます。
- プレートを置き私ナジッパー付きビニール袋とは、Mのために少なくとも30分間スメグマチスと結核菌やM.ボビス BCGのために45から60分間37℃でインキュベートします。
注：ビヒクル対照ウェルを1時間以内ピンク色をオンに失敗した場合、プレートを再度袋及びより長い時間インキュベートすることができます。 - 蛍光を読み取るに先立ち、削除彼らのふたで、室温で15分間、バイオセーフティフード内でマイクロCARAを配置します。安全キャビネットの外でBSL3分光光度計を使用する場合は、板の上に光学的品質のPCRステッカーを付着し、ソフトペーパータオルでステッカーの表面を軽く押して、しっかりと密封します。
- 590 nmで530 nmでの励起および発光で読み取るトップ介して蛍光を決定します。これは、ブランクプレートをする必要はありません。
5.データ解析
- リニアスケール上のY軸上のログ10スケールと蛍光上のX軸上のプロット阻害剤濃度。散乱を使用します曲線を採用したプロットは、「応答可変勾配（4パラメータ）に対する阻害剤をログに記録」としてフィット。 ±標準誤差としてプロットデータポイント。
Representative Results
予想CARA結果を図2に記載され、 表1に要約されています。細胞を複製するために、CARAは、標準的なMIC 90アッセイと並行して実行され、非複製アッセイのために、CARAは伸長相に結合されている適合MIC 90アッセイと並行して実行されます。バックグラウンドレベルを超えて上昇するCARA蛍光の故障につながる試験物質の濃度は、CARA-MBC≥99（ 図3a）です。 「≥99 "添字がCARA-MBCは≥2ログ10細菌の死滅（≥99％の死滅）を生じる試験物質の推定濃度を提供することを示しています。
液体ブイヨンMIC 90アッセイは、殺菌や静菌作用とを区別することができないと、この区別は、CFUアッセイによって解決されなければなりません。によって大会、成長の遅いマイコバクテリアのための静菌作用から殺菌を区別する閾値は約7日間7,26オーバー2-3ログ10キルです。 CARAのダイナミックレンジも2~3ログ10キルであるので、CARAは、殺菌又は静菌活性の推定値を提供することができます。 CARAは、簡単にバックグラウンドレベル（ 図2）にCARA蛍光を減少させることにより、これらの化合物の故障に静菌などの一部の複製活性物質を特定します。しかし、 結核菌を複製に対する静菌活性を有するいくつかの化合物は、それらがあっても、化合物のキャリーオーバーの不存在下で回復期の間に細菌の再増殖を抑制し続けることを意味し、強力な抗生物質投与後効果を持っています。この効果は、CARAアッセイにおいて認識することが困難であることができます。彼らは「静的なウィンドウ」を表示ならば、化合物は、右betweeへ> 4倍のシフトとして定義され、抗生物質投与後効果を発揮すると疑われていますnはMICとCARA曲線（ 図3b）。静的なウィンドウには、 結核菌を複製に対して活性分子ではなく、殺菌性の静菌であり得ることを示しています。いくつかのケースでは、静的なウィンドウのみCARA蛍光（ 図3C及び3D）のための拡張Y軸の検査後に明らかです。
CARA及びMIC 90のデータは、通常、（ 図4）を一緒にプロットされています。 MIC 90とCARAによって試験replicating-及び非複製活性分子のための代表的なデータは図4に示されています。分子のための4つの主要な活動のクラスがあります：1）イソニアジド、 図4aで実証殺菌（）を複製します。 2）複製静菌（リネゾリド、 図4b）で実証。オキシフェンブタゾンで実証3）非複製殺菌（ 図4c）。そして、4）担当者アクティブlicating（PA-824、 図4dで実証）（静菌または殺菌）および非複製殺菌。重要なことは、 図4aおよび図4bは、しばらくイソニアジドとリネゾリドは、MIC 90アッセイによる非複製細菌に対する活性を有するように見えることを示している図 、CARAは、彼らがテストした非複製条件下で不活性である示唆しています。 （ 図5a - D）リファンピシンの濃度を増加にさらされたM.スメグマチスを複製、分子の時間および濃度依存への影響を予測する際にCARAの有用性をテストするには、1〜24時間の間の様々な時間で、アリコートをスポットしましたCARAプレート上。これらのデータは、リファンピシンは、早ければ1時間（ 図5a）のような影響を及ぼさ3および24時間（ 図5B-D）との間で増加殺菌活性を示したことが示され、そして2によって〜を10μg/ mlで≥2-3ログ10を殺しました4時間（ 図5d）。同様の実験は、ビヒクル対照の四重及び9薬物濃度を試験する、および4の時点で、標準CFUに基づくアッセイによって法外です。
したがって、CARA媒体スループット、分子の活性プロファイルを識別するための迅速な手段として創薬において役割を有します。 CARAの予測は厳密に標準CFUアッセイを用いて評価されるべきです。 CFU解析のためのペトリ皿に0.4％活性炭の添加は、CARAデータとの相関を向上させることができ、より正確なCFUカウントになることがあり、補正の大きさは、一般的に、化合物の効力21,22に比例します。
図1：CARAは、薬物発見における予測ツールです。この図は、CARAの有用性をまとめたもの薬物スクリーニング（シングルポイントスクリーニング、チェリーピッキング、および用量反応アッセイ）と時間がかかるのヒット・ツー・リードアッセイ（CFUアッセイおよび標的の同定）との間の中間段階。 [ ゴールドらの許可を得て適応。、抗菌剤および化学療法、2015年 7] この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 予想される結果とブイヨンMIC 90アッセイおよびCARAの概略図。どちらのMIC 90およびCARA結果は、8つの可能な活動のために提示されています。 MIC 90マイクロプレートウェルのために（成長なし）白で、茶色（成長）、およびCARAのためのコーディングは色マイクロプレートは、黒（蛍光なし）とピンク（レゾルフィン蛍光）です。データは推測に基づくものです。 [ゴールドらの許可を得て適応。、抗菌剤および化学療法、2015年 7] この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 専門CARAの用語と定義。 CARA蛍光のバックグラウンドレベルをもたらす分子の最小殺菌濃度はCARA-MBC≥99（A）です。複製条件下では、MIC 90の右側にCARA-MBC≥99の≥4倍のシフトは、多くの場合、静菌作用を示し、「静的なウィンドウ」（B）と呼ばれています。強力な抗生物質投与後効果を有する分子の場合、静的なウィンドウが（c）を観察し、必要とすることが困難な場合がありますY軸（CARA蛍光）の膨張は（d）に可視化します。データは推測に基づくものです。 [ ゴールドらの許可を得て適応。、抗菌剤および化学療法、2015年 7] この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 実例MIC 90および選択化合物のためのCARA結果。 MIC 90（赤色）とCARA（青）のデータは、（a）は、イソニアジド（INH）、（b）は、リネゾリド、（C）オキシフェンブタゾン、及び（D）PA-824のために示されます。野生型のヒト結核菌H37Rvを、標準的な複製状態または非複製7-9のマルチストレスモデルで7日間化合物に曝露しました。 図2に示すように、MIC 90アッセイおよびCARAを行いました。 [ ゴールドらの許可を得て適応。、抗菌剤および化学療法、2015年 7] この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： リファンピシンの用量および時間依存性活性。非病原性、急成長しているM.スメグマチスは、図1（a）、図3（b）、図6（c）にCARAのためにサンプリングし、図24（d）の時間た複製条件アリコート下リファンピシンの漸増濃度に暴露しました。 [ ゴールドらの許可を得て適応。、抗菌剤および化学療法、2015年 7].COM /ファイル/ ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1：図2の予想結果のまとめ 。 [ ゴールドらの許可を得て適応。、抗菌剤および化学療法、2015年 7] この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
CARAは、もともと非複製またはデュアルアクティブ分子7を進んでボトルネックを軽減するために開発されました。 CARAは、一次スクリーニングのヒットとCFUアッセイ（ 図1）の濃度-応答確認の間の中間ステップとして機能します。単一CARAプレートが連続希釈液を準備するために必要な多数のマイクロタイタープレート、および生存細菌を列挙するために使用される寒天を含むペトリ皿に取って代わることができるので、CARAは、化合物濃度を含め、急速に分子の活性を評価し、一度に複数の変数をテストするための簡単な手段を提供しますおよび化合物への曝露時間。
CFUアッセイでは、多くの場合、10 6倍までの範囲で段階希釈液に加えて、寒天プレートは、典型的には、（トライスタイルペトリ皿で8ミリリットルの上に10μl）を追加〜800倍の分子を希釈します。非複製M. TU上の活性化合物のための私たちの二段、マルチストレススクリーニングアッセイberculosisアッセイの非複製段階中に存在する化合物は、五分の一伸長アッセイ6-9の（複製）段階で元の濃度で存在する、すなわち、5倍のキャリーオーバ率を有します。 CARAは、キャリーオーバー効果活性炭で小分子を隔離することによって緩和されます。結核薬および臨床候補の大部分は、アミノグリコシド、ストレプトマイシン7を除いて、迅速かつ完全に活性炭に結合します。 CFUアッセイのための寒天プレートにおける活性炭の含有は、実施オーバーTMC207およびPA-824 7,21,22により、細菌の増殖阻害、または細菌死滅を防ぎます。したがって、細菌学的寒天に活性炭を組み込むことによって、CARAは、細胞と試験薬剤の連続希釈に依存しません。
CARAは、複製活性物質及び非複製活性成分の殺菌影響の静菌または殺菌影響を予測することができます。グラムでeneral、CARAは、標準的なMIC 90アッセイと並行して使用されます。 CARAの予測力は、MIC 90とCARA結果（ 図2、 表1）を比較するから来ています。抗マイコバクテリア薬を研究するために使用する場合、CARAは正確に静菌（ 図4b）を複製し、非複製殺菌（ 図4c）、またはデュアルアクティブ（ 図4d）、殺菌（ 図4a）を複製している活動を予測することができます。 CARAはまた、投与量と時間の両方を横切る化合物の活性の簡易評価が可能になります。単独のCFUアッセイは用量および時間の広い範囲にわたって化合物の活性を評価するための努力と多くの材料を必要とするが、CARA結果は、化合物が明らかにアクティブであるものに条件の範囲を狭めると、タスクが管理対象となります （ 図5 ）。
CARAはの行動を研究する上で有用性を有しているがマイコバクテリアにNTI感染症、アッセイには限界があります。 CARAは、狭いダイナミックレンジ（2-3ログ10）を有し、かつ1以上2ログ3から10の細菌を殺すがないことも予想していた条件のために適切でないかもしれません。 CARAの予測は、CFUアッセイなどの細菌数を、列挙するために、より厳格かつ正確な方法を用いて、さらなる研究が必要です。このようなPASのようないくつかの抗感染症の抗生物質投与後効果は、 結核菌 7を複製に対して殺菌や静菌活性を有する化合物を区別するための予測ツールとしてCARAを混乱することができます。
CARAの品質を改善するには、2つの推奨事項があります。容積測定精度を維持し、マイクロウェルの外に飛散を回避しながら、まず、一つは、寒天が固化する前に、マイクロプレートを急速にCARAを注ぐ必要があります。かかわらず、必要なプレートの数の、我々はメートルを維持するのを助けるために、媒体の0.5〜1 Lのバッチを作るお勧めしますプレートを注ぐのに必要な時間の期間のための液体形態でedium。媒体とマイクロ充填しながら頻繁にヒントを変更すると、部分的に詰まったチップを使用して回避することができます。第二に、1は、反復間の蛍光の人為的な変動を最小限に抑える必要があります。マイコバクテリア微小コロニーは、 結核菌などの病原性マイコバクテリアのために、特に、しばしば不規則に成長します。例えば、寒天表面上に成長する微小コロニーのサイズ、形状、高さが変化してもよい、またはマイクロウェルの内壁まで延びていてもよいです。 1つの課題は、発展途上試薬で均一にすべての菌をカバーするものです。もう一つのハードルは、37℃での長時間のインキュベーションの後、CARAマイクロプレートの固体細菌学媒体が開発した試薬を吸収する乾燥しやすくなるかもしれないということです。活性炭はレサズリンを結合して、蛍光7を消光することができるので、原因レサズリン現像液および活性化charcoaを吸収するドライウェルにウェル間の変動があるかもしれませんレサズリンの蛍光を消光リットル。開発試薬を添加する直前にPBSですべてCARAのマイクロプレートウェルの表面を事前に湿潤これらの問題の両方を軽減する - 開発試薬は、同様にすべてのマイコバクテリアコロニーに達し、レサズリンは安全に活性炭上に残っています。 CARAは、マイコバクテリア変異体の表現型を同定し、特徴付ける、または他の細菌種のための培地スループット創薬アッセイにおける用途を有することができます。
Disclosures
開示する特別な利害関係はありません。
Acknowledgments
CARAを開発しながら、我々は、化学の支援のための専門家の原稿のレビューとJ.デイヴィッド・ウォーレン（ワイルコーネル医科大学）のためのクリスティン・バーンズ・黄に感謝しています。この作品は、トランスレーショナル医学ビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団、アビーとハワードP.ミルスタインプログラムのTB薬物アクセラレータプログラム、およびNIH TB研究ユニット（U19 AI111143）によってサポートされていました。微生物学および免疫学の専攻は、ウィリアム・ランドルフ・ハースト財団によってサポートされています。 SSKは、NIHの助成K08AI108799によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Middlebrook 7H9 | Beckton Dickinson | 271310 | |
| Middlebrook 7H11 | Beckton Dickinson | 298810 | |
| Middlebrook OADC | Beckton Dickinson | 212351 | |
| BSA, heat shock | Roche | 3118958001 | |
| activated charcoal | Sigma | C5510 | |
| PBS, Dulbecco's Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies / Invitrogen | 14190-144 | |
| tween 80 | Sigma | P8074 | |
| tyloxapol | Sigma | T8761 | |
| sodium nitrite | Sigma | 2252 | |
| rifampicin | Sigma | R3501 | |
| 6-bromo-1H-indazol-3-amine | Alfa Aesar | H34095 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| magnesium sulfate, heptahydrate | Sigma | M1880 | |
| ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
| zinc sulfate, heptahydrate | Sigma | Z0251 | |
| ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| butyric acid, liquid | Sigma | B103500 | |
| resazurin powder | Sigma | R7017 | |
| sodium chloride | J.T. Baker | 4058-01 | |
| prepared resazurin solution | Invitrogen | DAL1100 | |
| PCR stickers | Denville | B1212-5 | |
| spectrophotometer | Molecular Devices | M5 | |
| 96-well, tissue culture treated microplates | Corning | 3595 | |
| reagent reservoirs | VWR | 89094-678 | |
| resealable plastic bags | VWR | 395-94602 | |
| 14 ml Polypropylene round-bottom tubes | Corning | 352059 | |
| 50 ml conical centrifuge tube | Corning | 352070 | |
| 75 cm2 Cell culture flask | Corning | 431464U | |
| clear, flat bottom tissue culture treated 96-well microplate | Costar | 3595 | |
| Prism 6 for OS X | GraphPad | http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
References
- Nathan, C. Fresh approaches to anti-infective therapies. Sci. Transl. Medicine. 4 (140), 140-142 (2012).
- Gomez, J. E., McKinney, J. D. M. tuberculosis persistence, latency, and drug tolerance. Tuberculosis (Edinb). 84, 29-44 (2004).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. Lancet. , 497-500 (1944).
- Bryk, R., et al.
- Gold, B., et al. Nonsteroidal anti-inflammatory drug sensitizes Mycobacterium tuberculosis to endogenous and exogenous antimicrobials. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 16004-16011 (2012).
- Gold, B., et al. Rapid, semi-quantitative assay to discriminate among compounds with activity against replicating or non-replicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 6521-6538 (2015).
- Gold, B., Warrier, T., Nathan, C. Mycobacteria Protocols, Methods in Molecular Biology. Parish, T., Roberts, D. 1285, Springer. 293-315 (2015).
- Warrier, T., et al. Identification of Novel Anti-mycobacterial Compounds by Screening a Pharmaceutical Small-Molecule Library against Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Infect. Dis. , 580-585 (2015).
- Zheng, P., et al. Synthetic Calanolides with Bactericidal Activity Against Replicating and Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Chem. Chem, J. .M. ed. , (2014).
- Darby, C. M., et al. Whole cell screen for inhibitors of pH homeostasis in Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 8, e68942 (2013).
- Darby, C. M., Nathan, C. F. Killing of non-replicating Mycobacterium tuberculosis by 8-hydroxyquinoline. J. Antimicrob. Chemother. 65, 1424-1427 (2010).
- de Carvalho, L. P., Darby, C. M., Rhee, K., Nathan, C. Nitazoxanide Disrupts Membrane Potential and Intrabacterial pH Homeostasis of Mycobacterium tuberculosis. ACS Med. Chem. Lett. 2, 849-854 (2011).
- Xie, Z., Siddiqi, N., Rubin, E. J. Differential antibiotic susceptibilities of starved Mycobacterium tuberculosis isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4778-4780 (2005).
- Grant, S. S., et al. Identification of novel inhibitors of nonreplicating Mycobacterium tuberculosis using a carbon starvation model. ACS Chem. Biol. 8, 2224-2234 (2013).
- Zhang, M., et al. Streptomycin-starved Mycobacterium tuberculosis 18b, a drug discovery tool for latent tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 56, 5782-5789 (2012).
- Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem. Biol. 7, 1190-1197 (2012).
- Cho, S. H., et al. Low-oxygen-recovery assay for high-throughput screening of compounds against nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 51, 1380-1385 (2007).
- Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 92, 453-488 (2012).
- Rebollo-Lopez, M. J., et al. Release of 50 new, drug-like compounds and their computational target predictions for open source anti-tubercular drug discovery. PLoS One. 10, e0142293 (2015).
- Tasneen, R., et al. Contribution of the nitroimidazoles PA-824 and TBA-354 to the activity of novel regimens in murine models of tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 129-135 (2015).
- Grosset, J. H., et al. Assessment of clofazimine activity in a second-line regimen for tuberculosis in mice. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 188, 608-612 (2013).
- Shiloh, M. U., Ruan, J., Nathan, C. Evaluation of bacterial survival and phagocyte function with a fluorescence-based microplate assay. Infect. Immun. 65, 3193-3198 (1997).
- Wang, F., et al. Identification of a small molecule with activity against drug-resistant and persistent tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E2510-E2517 (2013).
- Wayne, L. G., Hayes, L. G. An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence. Infect. Immun. 64, 2062-2069 (1996).
- Barry, A. L., et al. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents: approved guideline. 19, National Committee for Clinical Laboratory Standards. (1999).
