Abstract
발견 결핵 (TB)의 치료 기간을 단축 항 감염 제를 진행 시급하다. 결핵균, TB의 병인 에이전트 인한 표현형 약제 내성을 나타내는 균의 존재를 신속하고 지속적인 요법으로 난치성이다. 는 C harcoal 갈치가 ssay (CARA)를 esazurin r에하는 복제 및 M. 결핵 비 복제에 대한 높은 처리량 검사 캠페인에 의해 발견 활성 분자를 특성화하는 도구로 개발되었다. 세균 한천 배지에서 활성탄 포함될 화합물 이월의 영향을 완화하는 것을 돕고, CARA에 마이크로 스폿 팅 전에 세포를 미리 희석 할 필요가 없다. 37 ° C에서 7~10일 잠복기 후에, 카라 마이크로 웰의 표면 상에 성장하는 마이코 박테리아 microcolonies하여 레사 주린의 감소는 반 정량적 ASSE 허용형광 측정을 통해 세균 수의 ssment. 카라는 약 박테리아의 숫자에서 2-3 로그 (10)의 차이를 감지하고 ≥99 % 세균 명 (MBC ≥99)에 이르는 최소 살균 농도를 예측한다. 카라는 분자가 복제 간균, 비 복제, 또는 두 가지 모두에 활성 상태인지 여부를 결정하는 데 도움이됩니다. 카라를 사용하여 파일럿 실험은 테스트 에이전트와 화합물 노출 시간의 농도가 집락 형성 단위 (CFU) 분석에 의해 추가로 평가해야하는의 식별을 용이하게한다. 복제 활성제는 살균 또는 정균 경우 또한, 카라 예측할 수있다.
Introduction
결핵균, 결핵의 병인 에이전트, 항생제 박멸에 반응하는 잠재 상태의 호스트에서 살아남을 수 있습니다. 감염시 결핵균의 표현형 (비 유전자) 저항 비 복제 바실러스 1,2- 집단에 부분적으로 기인 할 것으로 여겨진다. 표현형 약물 내성을 표시하는 클래스 I 영속 약물에 민감한 세포 3,4의 큰 집단 사이에 드문 확률 적 메커니즘을 통해 발생한다. 클래스 II 영속 감염 중 발생하는 미세 환경에서 외부 응력을 포함하여 호스트 면역 요인에 의해 비 복제를 렌더링됩니다. 우리는 최근에 클래스 II의 시험 관내 모델을 개발 비 복제 활성화 된 대 식세포와 육아종에서 결핵균에 직면 조건을 모방 지속성을. 클래스 II 지속성 멀티 응력 모델은이 조건을 포함하는 이러한 지방산 탄소원 완전히 HAL 느린 성장이러한 약산성 (PH 5.0), 저산소증 (1 % O 2) 산화 질소 및 기타 반응성 질소 중간체 5-9 같은 t 성장. 비 복제의이 멀티 스트레스 모델을 사용하는 대규모 스크리닝 및 기타 클래스 II 비 복제 모델은 그 활동이 아닌 복제 상태 5-7,9-18에 관한 것이다 다양한 분자를 산출했다. 같은 비 복제 스크린은 또한, 복제 모두 비 복제 균에 대해 활성을 갖는 분자의 범주를 밝혀 "이중 활성"7,10,12,19,20 불린다.
히트 - 투 - 리드 단계에서 항균 약물의 발견은 히트 확장, 예비 약리학 적 특성, 대상 식별 및 예비 생체 효능 연구를위한 리드를 선택하는 후보 분자의 광범위한 특성을 수반한다. 초기 단계로, 항 감염 제는 승, 경우 살균을 행동의 자신의 정균 또는 살균 메커니즘에 의해 분류된다hether 세균 명씩은 시간 및 / 또는 농도 의존적이다. 식민지 형성 단위 (CFU) 분석은 이러한 문제를 해결하기 위해 고전, 금 표준 방법입니다. CFU 분석에서, 박테리아 분취가 제거 직렬로 희석 한 후, 시험 제에 노출되며, 희석 분취 고체 세균 배지에 도포하고 생존 한 세포의 성장을 허용하기 위해 배양된다. 마지막으로, 세균 콜로니를 열거한다. CFU 분석은 생존 식민지를 열거 세포와 한천 페트리 접시를 희석 마이크로 타이 터 플레이트의 많은 수를 필요로한다. 느린 성장 마이코 박테리아의 CFU 분석은 식민지 판에 표시를 위해 약 3 주 필요 그들의 느린 생성 시간 (18 ~ 24 시간),에 의해 방해된다. 또한, 인큐베이터 공간은 종종 전문 바이오 안전성 수준-3 시설에서 제한된다.
복잡하지만, CFU 분석은 mycobacter에 비 - 복제 및 이중 활성 분자의 영향을 특성화 금 표준아이오와. 비 복제 분석은 세포 생존 6-8을 평가하기 위해 분석을 복제 결합되어 많은 높은 위양성의 요금이 적용됩니다. 예를 들어, 결핵균 복제에 대한 강력한 활성을 가진 화합물 (a "활성 복제") 비 복제 분석하는 동안 죽 실패 할 수 있습니다, 그러나 아직도의 비 복제 단계에서 이월 덕분에 죽일 수 복제 ( "조건을 복제하는")를 지원하는 조건 하에서 수행되는 분석의 복구 단계로 분석. 화합물은 더 이상 수행 활동이 아닌 복제, 또는 듀얼를 복제 여부 어려운 구별 할 수있게, 이중 활성 분자의 분석을 복잡하게한다.
상술 한 문제를 해결하기 위해, 우리는 M.의 tubercul으로 마이코 박테리아 종의 급속한, 세미 양적 열거에 대한 ssay (CARA)를 esazurin을 c harcoal 가르 연구 개발OSIS, M. 보비스 BCG, 그리고 M.는 smegmatis 7 (그림 1, 2). 시험관 내에서 완충 용액에 활성탄 급속 7 결핵을 치료하기 위해 사용되는 표준 약물 대부분 담즙산이. 활성화 분석법 마이크로부터 다시 수행 할 수있다 화합물을 결합 마이크로 CARA 숯, 그리고 CARA의이 기능은 직렬 7,21,22을 열거 형 사전 분석도 내용을 희석 할 필요가 없습니다. 마이크로 CARA의 한천 표면 microcolonies 마이코 박테리아의 수는 레사 주린의 첨가에 의해 추정되며, 그 환원 형, 레조 루핀 (resorufin) 청색 염료, 그 형광 광도법 (23)에 의해 측정된다 핑크 분자이다. M.가 smegmatis 1-2 일 같은 M. 결핵 및 M.의 보비스의 BCG 느린 성장 마이코 박테리아 7-10 일 동안 배양 마이크로 CARA. 카라는 ~ 2-3 로그 (10) diffe의 좁은 다이나믹 레인지를 가지고CFU에서 알수 있습니다. 대신 CFU 분석에 사용될 때, 단일 카라 마이크로 약 도금에 사용되는 희석액 120 트라이 스타일 아가 플레이트에 사용되는 다섯 96- 웰 판을 대체한다. CARA 데이터의 해석은 더 힘든 CFU 기반 분석을에서 테스트 할 수있는 배양 시간 및 화합물 농도를 결정함으로써 후속 연구를 안내하는 데 도움이됩니다.
Protocol
CARA 마이크로 1. 준비
- 2 L의 삼각 플라스크에 0.2 % 글리세롤 및 0.4 %의 활성탄을 포함하는 미들 7H11 한천의 오토 클레이브를 900 ㎖, 또는 대안 적으로, 1 L의 유리 비이커에 450ml의. 플라스크 또는 비커에 큰 오토 클레이브 교반 막대를 포함합니다. 알루미늄 호일로 플라스크 또는 비커의 입구를 덮고 오토 클레이브 테이프를 유리에 부착합니다.
- 현탁액에 목탄을 유지하기 위해 낮은 속도로 설정 자기 교반 플레이트 (약 55 ~ 65 °의 C)를 터치 쿨.
- 자기 교반 플레이트가있는 바이오 안전성 후드에서 무균 이후의 모든 단계를 수행합니다.
- 호일을 제거합니다. 100 ㎖ OADC 보충 추가 (OADC 보충 10 %로 사용되는 경우, 0.2 % 포도당, 0.5 % 알부민, 0.085 %의 NaCl, 0.0005 % 올레산 0.4 ㎎ / ㎖ 카탈라제의 생산량 최종 용지 농도)에 2 L의 삼각 플라스크에 또는 50 ml를 1 L 비이커에 OADC 및 혼합 계속합니다.
- 삼각 플라스크를 사용하는 경우, 약 25-4을 부어멸균 시약 저수지에 7H11-OADC 숯의 0 ml의. 비커를 사용하는 경우, 시약 저장 용기를 사용할 필요가 없다.
- 200 μL / 웰의 시약 저장 또는 커에서 7H11-OADC - 목탄으로 96 웰 마이크로 플레이트를 입력합니다. 한천 응고와 거품의 도입을 방지하기 위해 신속하게 작업 할 수 있습니다. 즉 진균 오염원이 될 수있는 바와 같이, 웰 고체 배지 외부 튀는 피한다. 멀티 채널 피펫을 이용하여 96- 웰 플레이트의 8 개의 행 (AH)에 7H11 OADC-숯의 전송에 대해 필터 (12)의 끝의 한 세트를 사용한다.
주 : 매체가 신속하게 굳은. 피펫 팁 막힘 방지하기 위해 자주 변경합니다. - 또한, 다수의 판을 준비하고 지원하기 위해 필터 팁과 함께 P1000 전자 멀티 채널 피펫을 사용하여 마이크로 플레이트 CARA을 붓는다.
참고 : 인해 마이크로 웰의 낮은 볼륨, CARA 마이크로의 한천이 쏟아져 분 이내에 굳은. - 개폐형 플라스틱 바에서 CARA 마이크로의 장소 스택GS는 건조 방지 할 수 있습니다.
- 스토어 CARA 마이크로 4 ° C에서.
90 분석법을 2. 복제 설정 및 MIC 비 복제
- M. 결핵, M.의 보비스의 BCG 접종 또는 M.는 OD 0.01-0.1의 580에 smegmatis 및 미들 7H9-ADN에서 중반 로그 단계 (OD 580 ~ 0.5)로 확장 (미들 7H9 0.2 % 글리세롤을 포함, 0.2 % 덱 스트로스 0.5 % 알부민, 및 0.085 %의 NaCl) 또는 7H9-OADC (미들 7H9 0.2 % 글리세롤 10 % OADC 보충 함유).
- 세포 배양 플라스크에 문화를 서 20 ㎖ ~로 M. 결핵 및 M.의 우형 BCG 성장과 M. 폴리 프로필렌 둥근 바닥 (4 ml의 문화) 또는 50 ML 원뿔 원심 분리기 튜브 (10 ~ 20 ml의 문화)에서 진탕 smegmatis. 20 % O 2, 5 % CO 2, 37 ℃에서 병원성 마이코 박테리아 부화 및 M.은 20 % O 2로 37 ° C에서 smegmatis.
- 최소한의-억제를 설정농도 (MIC 90) 복제 및 비 복제 조건을 (그림 2)에서 스타일의 실험.
참고 : 테스트 에이전트는 일반적으로 96 웰 마이크로 플레이트 당 각각 테스트 4,이 화합물을, 허용 중복 또는 quadruplicates으로 분석된다. 예를 들면, 96- 웰 플레이트에서, 하나의 시험 제제는 EH 행의 행의 다른 AD에서 분석 될 수있다. DMSO를 (비히클) 칼럼 1, 2이고, (12) 및 시험 제제 희석 시리즈 칼럼 11의 (높은 농도)을 컬럼 3 (최저 농도)에서 운영. MIC (90) 스타일 분석은 일반적으로 2 배 희석 시리즈를 사용합니다. 마이코 박테리아 14-16,18,24,25가 가능한 다수의 비 - 복제 모델이고 예시적인 목적으로, 우리는 비 복제 6,8,9의 다중 응력 모델을 사용한다.- 복제 가능한 분석을 위해, 명확한 바닥, 조직 문화가 처리 된 96 웰 플레이트의 모든 웰 내로 OD 0.01 (580)에서 7H9-ADN 200 μl의 세포를 배포 할 수 있습니다. <리> 비 복제 분석은 0.02 %의 틸록 사폴을 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 두 번 세포를 씻어 비 복제 배지 (0.05 % KH2PO4, 0.05 % 황산 0.005 %, 페릭 암모늄 시트 레이트에 재현 탁 셀 0.0001 % ZnCl 2, 0.1 % NH4Cl를, 0.5 % BSA, 0.085 %의 NaCl, 0.02 %의 틸록 사폴 0.05 % 부티레이트, pH는) 2 N NaOH로 5.0으로 조정.
- 비 복제 매체에서 OD 0.1 (580)에 세포를 희석하고 0.5 mm의 최종 농도에 새로 제조 한 M 재고에서에 NaNO 2를 추가합니다.
- 분명 바닥, 조직 문화가 처리 된 96 웰 플레이트의 모든 웰 내로 OD 0.1의 580에서 200 μl의 세포를 배포합니다.
참고 : DMSO의 100 배 재고 솔루션으로 화합물의 희석을 준비합니다. 따라서, 최종 농도에서 0.4-100 μg의 분자의 영향을 테스트하는 일반적인 MIC 판 / ml의 DMSO에 0.04-10 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 필요로한다.
- 디의 2 μl를 추가행 AE로 시험 제 1의 lutions 행 EH으로 시험 제 2의 희석 2 μL. 철저하게 섞는다.
- 열 1, 2, 12 (행 AH), 제어 우물에 2 μL 차량 제어 (보통 DMSO)를 추가합니다. 철저하게 섞는다.
- 각 실험 들어, 0.004 1 μg의 / ㎖ (복제 분석) 및 / 또는 0.08 ~ 20 ㎍ / ㎖ (비 복제 분석)에서 리팜피신 적어도 한 양성 대조군을 포함한다.
주 : 0.1 내지 25 μg의 / ㎖에서 6- 브로 모 -1H- 인다 졸 -3- 아민 (9)의 사용은 비 복제 멀티 응력 모델 선택적 갖는 화합물에 나노 2 의존적 활성 권장된다. - 분석 복제를 위해 7 일 (M. 결핵 및 M.의 우형 BCG) 또는 48 시간 (M.가 smegmatis) 20 % O 2 5 % CO 2에서 37 ° C에서 마이크로 품어. 비 - 복제 멀티 응력 모델 (<1 % O 2, 5 % CO 2에서 37 ℃에서 7 일간 배양한다 마이크로EM> M. 결핵 및 M.의 보비스 BCG).
CARA 마이크로 3. 예방 접종
- 카라가 판독으로 사용됩니다되는 시점에서,주의 깊게 잘 50-75 μL로 설정된 P200 멀티 채널 피펫을 사용하여 MIC (90) 스타일 분석 플레이트의 내용을 재현 탁. 부드럽게 피펫 위아래로 적어도 5 ~ 10 배는 피펫 팁을 사용하여 원을 그리 잘 내용을 소용돌이 친다.
- 전송 카라 마이크로에 대한 분석은 물론 내용의 10 μL. 분석 플레이트의 웰 내용물의 순서 카라 마이크로 플레이트의 웰 내용물의 순서와 일치하는지 확인. 환승시 튀는 것을 방지하고, 10 μL가 CARA 마이크로 웰의 중간에 발견되어 있는지 확인합니다. 카라 마이크로 플레이트에 흡수 10 μl를 확인합니다.
참고 : 이전 CARA 마이크로 플레이트에 세포를 안보에 필요하지 희석이 없습니다. - 플레이트 테이프와 마이크로 CARA의 귀속 스택과다음 개폐형 플라스틱 백에 넣습니다. 마이크로 플레이트 CARA을 품어 20 % O 2와 37 ° C (M.가 smegmatis) 또는 1 % O 2, 5 % CO 2 (M. 결핵 및 M.의 우형 BCG)에서.
- M. 결핵 및 M.의 우형 BCG의 경우, 분석을 복제 : 7 일 동안 배양; M. 결핵 및 M.의 우형에 대한 BCG 비 복제 분석을, 10 일 동안 배양; M.가 smegmatis에 대한 분석을 복제 1-2 일 동안 배양; M.가 smegmatis에 대한 비 복제의 분석은, 2~3일 품어.
주 : 시간이 추정치와 다른 복제, 비 복제 및 스트레스 조건에 따라 변경 될 수있다.
4. CARA 마이크로 개발
- 세균의 성장, 또는 더 큰, 거시적 식민지의 영화, 음 (차량) 제어 우물에서 볼 때 마이크로 카라을 개발합니다.
주 : 장기간 배양 한 후, CARA 마이크로 웰 자주건조 나타나고 우리는 멸균 PBS로 미리 습윤 아니라 내용을 권장합니다. 이것은 낮은 형광 또는 웰 - 투 - 웰 변동을 초래할 수 레사 주린 흡수기에서 숯불을 방지하는 역할을한다. - 멀티 채널 피펫 팁 (12) (P200)의 단일 세트를 사용하여 각 웰의 측면을 따라 멸균 PBS 40 μL 분주하고 PBS 한천 / 박테리아 microcolonies 상단에 걸쳐 분배 할 수있다.
- 카라 5 밀리그램 레사 주린 (최종 0.01 %)과 PBS 중 5 % 트윈 80 50 mL의 혼합 시약을 개발 준비한다. 소용돌이와 살균 필터.
주 : PBS 중 10 % 트윈 80 1 (부피 / 부피의) 대안 CARA 현상 시약 1에서 액상 용액 레사 주린 상업적으로 혼합하여 제조 할 수있다. - 12 채널 피펫을 사용하여 CARA 마이크로의 각 웰에 새로 제조 CARA 개발 시약의 50 μl를 추가합니다. 록 플레이트 앞뒤로 몇 번 각 웰에 한천과 박테리아 매트에서 시약을 배포 할 수 있도록 도와줍니다.
- 접시를 놓고 전NA 다시 봉합 할 수있는 비닐 봉투 및 M. 적어도 30 분 smegmatis 및 결핵균 또는 M.의 우형의 BCG에 대한 45 ~ 60 분 동안 37 ° C에서 품어.
참고 : 차량 제어 우물이 첫 번째 시간 이내에 핑크를 설정하지 않을 경우, 플레이트가 다시 체포와 오랜 시간 동안 배양 할 수있다. - 형광을 판독하기 전에, 그 뚜껑을 제거하고 실온에서 15 분 동안 생물 안전성 후드에서 CARA 마이크로 플레이트를 배치했다. 바이오 안전성 캐비닛의 외부 BSL3의 분광 광도계를 사용하는 경우, 접시 위에 광학 품질 PCR 스티커를 부착하고 부드러운 종이 타월로 스티커 표면에 부드럽게 눌러 단단히 밀봉.
- 590 nm에서 530 nm에서 여기 및 방출 읽을 상단을 통해 형광을 결정합니다. 그것은 빈 접시에 필요하지 않습니다.
5. 데이터 분석
- 선형 스케일에 Y 축의 로그 스케일 (10)과 형광의 X 축상의 플롯 억제 농도. 분산을 사용하여곡선을 사용 플롯은 "응답 변수 경사 (4 매개 변수) 대 억제제 로그인"으로 적합. ± 표준 오차를 의미로 플롯 데이터 포인트.
Representative Results
예상 CARA 결과는도 2에 기재된 표 1에 요약되어있다. 세포를 복제를 들어, 카라 표준 MIC 90 분석법 병렬로 실행되며, 비 - 복제 검정 들면 카라 연장선 상에 결합되는 적응 MIC 90 시험과 병렬로 실행된다. 배경 레벨 이상으로 상승하는 CARA 형광 장애가 발생 시험 약제의 농도는 카라-MBC ≥99 (도 3a)이다. 은 "≥99"첨자는 CARA-MBC는 ≥2 로그 (10) 박테리아 명 (≥99 % 킬)을 발생시킨다 테스트 에이전트의 예상 농도를 제공하고 있음을 나타냅니다.
액체 배지 MIC (90) 분석은 살균 및 정균 활성을 구별 할 수없는,이 구별은 CFU 분석에 의해 해결되어야한다. 으로컨벤션, 느린 성장 마이코 박테리아에 대한 정균 활동에서 살균을 구분하는 임계 값은 약 칠일 7,26 이상 2 ~ 3 로그 10 명이다. 카라의 동적 범위는 2-3 로그 10 명이므로, 카라 살균 또는 정균 활성의 추정치를 제공 할 수있다. 카라는 쉽게 인해 배경 수준 CARA 형광을 감소 이들 화합물의 실패 (그림 2)에 세균과 같은 일부 복제 활성을 나타냅니다. 그러나, 결핵균 복제에 대한 정균 활성을 갖는 어떤 화합물들은 심지어 화합물 이월의 부재 회복기 동안 세균의 재성장을 억제 계속 즉, 강력한 후 항생제 효과를 갖는다. 이 효과는 카라 분석에서 인식하기 어려울 수있다. 그들은 "정적 창"을 표시하는 경우 화합물은 오른쪽 betwee에> 4 배의 변화로 정의, 후 항생제 효과를 발휘 의심되는n은 MIC 및 CARA 곡선 (그림 3b). 정적 창은 결핵균을 복제에 대한 활성 분자 대신 살균의 세균이 될 수 있음을 나타냅니다. 일부 경우에서, 고정 윈도우는 카라 형광 (도 3C 및 3D)에 대한 확장 된 Y 축 검사 후에 명백하다.
CARA 및 MIC (90)의 데이터는 일반적으로 함께 (그림 4) 플롯됩니다. MIC (90)에 의해 테스트 CARA replicating- 비 복제 활성 분자 대표 데이터는도 4에 도시되어있다. 분자 4 대 활동 수업이 있습니다 : 1) 살균 복제 (그림 4a, 이소니아지드와 시연이); 2) 복제 정균 (리네 졸리 드,도 4b)으로 증명; 3) 비 복제 살균을 (oxyphenbutazone,도 4c)와 함께 보여; 그리고, 4) 담당자(PA-824,도 4D로 입증) licating 활동 (정균 또는 살균) 및 비 복제 살균. 중요한 것은,도 4a 및도 이소니아지드 및 리네 졸리가 MIC (90) 분석에 의해 비 복제 세균에 대한 활성을 가지고있는 것 같습니다 동안 CARA들이 시험이 아닌 복제 조건 하에서 비활성 제안을 입증 4b는. (도 5a - D) 리팜피신의 농도 증가에 노출 M. smegmatis를 복제, 분자의 시간과 농도 의존적 영향을 예측에 CARA의 유용성을 테스트하고, 1-24 시간 사이에 여러 번, 분취이 발견되었다 CARA 판 상. 이러한 데이터는 리팜피신은 빠르면 1 시간 (그림 5a)와 같은 영향을 미치는 3과 24 시간 (도 5B-D) 사이에 증가하고 살균 작용을 표시 지적하고, 2 ~ 10 μg의 / ㎖에서 ≥2-3 로그 (10) 사망4 시간 (그림 5D). 유사한 실험은 차량 제어 9 약물 농도 quadruplicates 테스트, 4 시점에서 표준 기반 CFU 분석에 의해 금지 될 것이다.
따라서, 카라 분자의 활성 프로파일을 식별하는 매체 처리량 신속한 메커니즘으로 신약 개발에 중요한 역할을 갖는다. CARA의 예측은 엄격하게 표준 CFU 분석을 사용하여 평가되어야한다. CFU 분석을위한 배양 접시에 0.4 % 활성탄 첨가 CARA 데이터에 대한 상관 관계를 개선 할 수 있으며, 보정의 크기는 일반적으로 화합물의 효능 (21, 22)에 비례 정확한 CFU 카운트 될 수있다.
그림 1 : CARA는 신약 개발의 예측 도구입니다. 이 그림은 같은 CARA의 유틸리티를 요약약물 검사 (단일 지점 검사, 체리 따기, 그리고 용량 - 반응 시험 법)과 시간이 많이 소요 히트에 리드 분석 (CFU 분석 및 목표 식별) 사이의 중간 단계. [골드 등의 등의 허가 적응., 항균제와 화학 요법 2015 년 7] 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 예상 결과와 국물의 MIC (90) 분석 및 CARA의 도식. 모두 MIC 90 CARA 결과는 8 가능한 활동을 위해 제공됩니다. 색상 코딩 MIC 90 마이크로 웰을위한은 (더 성장), 갈색 (성장) 흰색이며, CARA에 대한 마이크로 플레이트는 (형광), 핑크 (레조 루핀 (resorufin) 형광) 블랙 없다. 데이터는 가상이다. [골드 등의 등의 허가 적응., 항균제와 화학 요법 2015 년 7] 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : CARA의 용어 및 정의 전문. 카라 형광의 배경 수준에 기인하는 분자의 최소 살균 농도는 카라-MBC ≥99있다 (a). 복제 조건 하에서, MIC (90)의 오른쪽에 CARA-MBC ≥99의 ≥4 배 시프트는 종종 세균 활동을 표시하고 "고정 창"(b)라고한다. 강력한 후 항생제 효과 분자를 들어, 정적 창 관찰 (c) 및 필요하기 어려울 수 있습니다Y 축 (CARA 형광)의 확장 (d)에 시각화합니다. 데이터는 가상이다. [골드 등의 등의 허가 적응., 항균제와 화학 요법 2015 년 7] 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 예시 MIC 90 CARA는 선택 화합물에 대해 발생합니다. MIC 90 (적색) 및 CARA (블루)에 대한 데이터는 (a) 이소니아지드 (INH), (b) 리네 졸리 드, (c) oxyphenbutazone 및 (d) PA-824에 대해 입증된다. 야생형 결핵균 H37Rv 표준 복제 상태 또는 비 - 복제 7-9의 멀티 스트레스 모델에서 7 일간 화합물에 노출시켰다. 그림 2와 같이 MIC (90) 분석 및 CARA 실시 하였다. [골드 등의 등의 허가 적응., 항균제와 화학 요법 2015 년 7] 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 용량 -와 리팜피신의 시간에 따른 활동. 비 - 병원성, 급성장 M. smegmatis가 복제 조건으로 분취 하에서 리팜피신의 증가하는 농도에 노출은 CARA 채취 된 1 (a), 3 (b), 6 (c) 및 24의 (d) 시간. [골드 등의 등의 허가 적응., 항균제와 화학 요법 2015 년 7].COM / 파일 / ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 그림 2의 예상 결과의 요약. [골드 등의 등의 허가 적응., 항균제와 화학 요법 2015 년 7] 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
카라는 원래 비 복제 또는 이중 활성 분자 (7) 진행의 병목 현상을 완화하기 위해 개발되었다. 카라 차 심사 안타 CFU 분석 (그림 1)의 농도 - 반응 확인 사이의 중간 단계 역할을합니다. 하나의 CARA 판 살아남은 박테리아를 열거하는 데 사용되는 직렬 희석을 준비하는 데 필요한 다양한 마이크로 타이 터 플레이트 및 한천 페트리 접시를 대체 할 수 있기 때문에, CARA 빠르게 분자의 활동을 평가하고 화합물의 농도를 포함하여 한 번에 여러 변수를 테스트하는 간단한 방법을 제공합니다 상기 화합물에 대한 노출 시간.
CFU 분석에서, 종종 10 6 -fold까지 범위를 연속 희석뿐만 아니라, 한천 플레이트는 일반적으로 추가 ~ 800 배 (트라이 스타일의 페트리 접시에 8 ㎖의 상에 10 μL)에 의해 분자를 희석. 활성 화합물에 대한 우리의 두 단계, 멀티 스트레스 스크리닝 분석 M. TU 비는 복제berculosis는 분석의 비 - 복제 단계의 화합물에 존재하는 하나의 1/5 가지 분석 6-9 (복제) 상에 원래의 농도로 존재하며, 즉, 5 배의 이월 계수를 갖는다. 카라 완화 할 휴대 오버 효과 활성탄으로 작은 분자를 이온 봉쇄에 의해. 결핵 약물 임상 후보의 대부분은 7 스트렙토 마이신 아미노 글리코 사이드를 제외하고, 신속하고 완전히 활성탄 귀속. CFU 분석에 대한 한천 플레이트에서 활성탄의 포함에 의해 박테리아 성장 억제, 또는 박테리아 명을 방지 실시 오버 TMC207와 PA-824 7,21,22. 따라서, 세균 한천에서 활성탄을 혼입에 의해, 카라 세포 및 시험 제제의 희석액에 의존하지 않는다.
카라는 복제 활성 및 비 복제 활성 성분의 살균 효과의 정균 또는 살균에 미치는 영향을 예측하는 데 도움이 될 수 있습니다. g에서eneral, 카라 표준 MIC 90 분석법 병렬로 사용된다. 카라의 예측 능력은 MIC (90)와 CARA 결과 (그림 2, 표 1) 비교에서 온다. 항 미코 박테리아 제를 연구하는 데 사용하는 경우, 카라 정확하게 정균 (도 4b), 비 - 복제 살균제 (도 4C), 또는 이중 활성 (도 4D)를 복제, 살균제 (도 4a)를 복제하는 활성을 예측할 수있다. 카라는 용량과 시간에 걸쳐 화합물의 활동의 간단한 평가를 허용한다. CFU 분석은 단독 투여 량 및 시간의 넓은 범위의 화합물의 활성을 평가하기위한 노력과 재료가 많이 필요하지만 카라 결과에게 조건의 범위를 좁힐 때, 태스크 (화합물 명백히 활성 인도 5 관리된다 ).
카라는의 작용을 공부 유틸리티를 가지고 있지만마이코 박테리아에 NTI-감염 제는 분석은 한계가있다. 카라는 좁은 다이나믹 레인지 (2-3 로그 10)가 하나 이상 2 (10) 로그 (3) 세균 죽이되지 않을 수 있습니다 예상되는 조건에 대해 적절하지 않을 수 있습니다. CARA 예측은 이러한 CFU 분석 등의 세균 숫자를 열거하는보다 엄격한하고 정확한 방법을 사용하여 더 많은 연구를 필요로한다. 이러한 PAS 일부 항 감염 제의 후 항생제 효과는 결핵균 7 복제에 대해 살균 및 정균 활성을 갖는 화합물을 구별하는 수단으로 예측 카라 혼동 할 수있다.
카라의 품질을 개선하기 위해 두 가지 권장 사항이 있습니다. 체적 정확성을 유지하고 마이크로 웰의 외부 튀는을 피하면서 첫째, 하나는, 마이크로 빠르게 한천 응고 전에 CARA을 부어해야합니다. 에 관계없이 필요한 접시의 수, 우리는 m를 유지하는 데 도움 매체의 0.5 ~ 1 L의 배치를 만드는 것이 좋습니다플레이트를 부어하는데 필요한 시간에 해당하는 기간 동안 액체 형태 edium. 부분적으로 막힌 팁을 사용하는 것을 피한다 매체와 마이크로 작성하는 동안 자주 팁을 변경. 둘째, 하나는 복제 사이에 형광 인공적인 변동성을 최소화해야합니다. 마이코 박테리아 microcolonies는 이러한 결핵균과 같은 병원성 마이코 박테리아에 대한 특히, 종종 비정상적으로 성장한다. 예를 들어, 한천 표면에 성장 microcolonies은 크기, 형상, 높이가 다를 수 있고, 또는 마이크로 웰의 내벽까지 연장 될 수있다. 하나의 문제는 현상 시약과 균일 모든 세균을 포함한다. 또 다른 장애물은 37 ° C에서 장기간 배양 한 후, CARA 마이크로의 고체 세균 매체가 개발 시약을 흡수에 건조하고 경향이 될 수 있다는 것이다. 활성탄은 결합 레사 주린 형광 7 급랭 수 있기 때문에 현상액 레사 주린 흡수 건조 우물 활성 charcoa 잘 - 투 - 웰 변동이있을 수있다리터 담금질 레사 주린 형광. 개발 시약은 동일하게 모든 마이코 박테리아 식민지를 도달하고, 레사 주린은 활성탄보다 안전하게 유지 - 사전 습윤 즉시 개발 시약을 추가하기 전에 PBS 모든 CARA 마이크로 웰의 표면은 이러한 문제를 모두 완화합니다. 카라는 식별하고, 또는 다른 세균 종에 대한 중간 처리량 약물 발견 분석에서 마이코 박테리아 돌연변이의 표현형의 특성에 응용 프로그램을 가질 수있다.
Disclosures
공개 관심의 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 원고 및 화학 지원 J. 데이비드 워렌 (웨일 코넬 의과 대학)가 CARA을 개발하는 동안의 전문가 검토 크리스틴 번즈 - 황에 감사하고 있습니다. 이 작품은 번역 상 약에있는 빌과 멜린다 게이츠 재단, 애비 하워드 P. 밀스타인 프로그램의 TB 약 가속기 프로그램 및 NIH TB 연구 장치 (U19 AI111143)에 의해 지원되었다. 미생물학 및 면역학의 부서는 윌리엄 랜돌프 허스트 재단이 지원됩니다. SSK는 NIH 보조금 K08AI108799에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Middlebrook 7H9 | Beckton Dickinson | 271310 | |
| Middlebrook 7H11 | Beckton Dickinson | 298810 | |
| Middlebrook OADC | Beckton Dickinson | 212351 | |
| BSA, heat shock | Roche | 3118958001 | |
| activated charcoal | Sigma | C5510 | |
| PBS, Dulbecco's Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies / Invitrogen | 14190-144 | |
| tween 80 | Sigma | P8074 | |
| tyloxapol | Sigma | T8761 | |
| sodium nitrite | Sigma | 2252 | |
| rifampicin | Sigma | R3501 | |
| 6-bromo-1H-indazol-3-amine | Alfa Aesar | H34095 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| magnesium sulfate, heptahydrate | Sigma | M1880 | |
| ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
| zinc sulfate, heptahydrate | Sigma | Z0251 | |
| ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| butyric acid, liquid | Sigma | B103500 | |
| resazurin powder | Sigma | R7017 | |
| sodium chloride | J.T. Baker | 4058-01 | |
| prepared resazurin solution | Invitrogen | DAL1100 | |
| PCR stickers | Denville | B1212-5 | |
| spectrophotometer | Molecular Devices | M5 | |
| 96-well, tissue culture treated microplates | Corning | 3595 | |
| reagent reservoirs | VWR | 89094-678 | |
| resealable plastic bags | VWR | 395-94602 | |
| 14 ml Polypropylene round-bottom tubes | Corning | 352059 | |
| 50 ml conical centrifuge tube | Corning | 352070 | |
| 75 cm2 Cell culture flask | Corning | 431464U | |
| clear, flat bottom tissue culture treated 96-well microplate | Costar | 3595 | |
| Prism 6 for OS X | GraphPad | http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
References
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