Artigo de método

Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter

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DOI:

10.3791/54710

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25 de janeiro de 2017

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1Laboratory of Molecular Immunoregulation, Cancer and Inflammation Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

Descrevemos aqui um modelo de camundongo repórter transgênico para visualizar as células produtoras de IL-22 dentro de diferentes tecidos de camundongos. Este método pode ser usado para rastrear a localização de outras citocinas ou proteínas secretas no camundongo.

Resumo

ratinhos repórter têm sido amplamente utilizados para se observar a localização da expressão de genes alvo. Este protocolo centra-se em uma estratégia para estabelecer um novo modelo de rato transgénico repórter. Escolhemos para visualizar a expressão do gene interleucina (IL) 22 porque esta citoquina tem actividades importantes no intestino, onde contribui para a reparação de tecidos danificados por inflamação. Sistemas repórter oferecem vantagens consideráveis sobre outros métodos de identificação de produtos in vivo. No caso de IL-22, outros estudos havia células a partir de tecidos isolado pela primeira vez e, em seguida, re-estimularam as células in vitro. IL-22, que é normalmente secretada, foi aprisionado no interior das células utilizando um medicamento, e coloração intracelular foi usada para visualizar. Este método identifica células capazes de produzir IL-22, mas não determinar se eles estavam fazendo isso in vivo. O design repórter inclui a inserção de um gene para uma proteína fluorescente (tdTomato) para o gene de IL-22 de tal waY que a proteína fluorescente não pode ser segregada e, portanto, permanece preso no interior das células que produzem in vivo. Produtores fluorescentes podem então ser visualizado em secções de tecidos ou por meio de análise ex vivo através de citometria de fluxo. O processo de construção efectiva para o repórter incluídos recombineering um cromossoma artificial bacteriano que continha o gene de IL-22. Este cromossoma manipulado foi então introduzido no genoma do rato. Homeostático de IL-22 de expressão de repórter foi observada em diferentes tecidos de rato, incluindo o baço, timo, nódulos linfáticos, placas de Peyer, e no intestino, por análise de citometria de fluxo. A colite foi induzida por células T (CD4 + CD45RBhigh) de transferência, e expressão repórter foi visualizado. As células T positivas foram pela primeira vez presente nos linfonodos mesentéricos, e então eles acumulada no interior da lâmina própria das distais pequenos tecidos do intestino e cólon. A estratégia utilizando BACs deu expressão repórter boa fidelidade em relação a IL-22 expression, e é mais simples do que os procedimentos knock-in.

Introdução

expressão específica do tipo celular de genes repórter é útil para identificar as células que expressam activamente o alvo em tecidos sob estados homeostáticos e perturbados. Também permite a purificação destas células, que permanecem viáveis, para estudar as suas outras propriedades. Reporter ratinhos foram utilizados para elucidar o mecanismo de acção de citoquinas factores de transcrição específicos, e elementos reguladores. Estratégias anteriores 1, 2, 3, em grande medida invocado batendo o repórter para o locus alvo no cromossoma do rato, um procedimento demorado e dispendioso. Assim, um método mais simples para a geração de ratinhos repórter é desejável.

Citocinas são uma classe ampla de pequenas proteínas excretadas / péptidos que regulam as respostas imunitárias através da sinalização intercelular. A interleucina 22 (IL-22) é uma citoquina com muitos relataram actividades, incluindo fu barreiranction, reparação de tecidos, e inflamação 4. Embora a IL-22 foi inicialmente descoberto como um produto de células T 5, relatórios subsequentes demonstraram a sua expressão em células assassinas naturais (NK) em seres humanos e ratinhos 6 7 e em outras classes de linfócitos inatas 8. Apesar de extensa observação da IL-produzindo-22 células, visualização de IL-22 estimulação exigido anteriormente ex vivo e permeabilização a manchas com anticorpos. Portanto, o romance IL-22 ratos repórter seria uma ferramenta muito útil para investigar a função da IL-22 nos processos homeostáticos e patogênicos.

Aqui, nós desenvolvemos um modelo de ratinho transgénico repórter simplificado para observar as células IL-22 produtoras in vivo e in vitro. Usando um método TAS recombineering 9, que inserida a sequência de ADNc com poli A tdTomato fragmentos do sinal para a IL-22 locnós e substituído exão 1. As outras regiões, exons, e elementos reguladores não traduzidas não foram perturbado, uma vez que gostaria de imitar a regulação natural da IL-22, tanto quanto possível. O local de inserção repórter interrompe a sequência de sinal, resultando na acumulação do repórter no interior das células que produzem, ao contrário de IL-22 em si, que é rapidamente segregada. Este novo método também pode ser aplicado para a geração de ratinhos repórter de outras proteínas secretadas.

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Protocolo

Todos os animais receberam a atenção adequada de acordo com os procedimentos experimentais descritos no Guia de 2011 para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório Comité das Frederick National Laboratory for Cancer Research.

1. Geração de IL-22-tdTomato Mice repórter por BAC recombineering

NOTA: Os ratos devem estar inconsciente e não se movem em resposta a um estímulo nocivo. Esterilizar a área cirúrgica com 70% de etanol e esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos usando um esterilizador de esferas de vidro.

  1. Purifica-se o DNA de BAC (RP23-401E11, comprimento clone 228391 pb), utilizando um método de extracção alcalina 10, 11. Caracterizar o clone BAC por Spel digestão de 5 ug de RP23-401E11 para confirmar o tamanho correcto do gene alvo. NOTA: O DNA BAC foi digerido em 14 fragmentos.
  2. Inserir o gene repórter TdTomato no sítio Not I / Sal I do shuttle vector PLD53SC-A-GFP-B11 e substituir o gene da GFP no mesmo local. Em seguida, utilizando RP23-401E11 BAC como molde, amplificar as caixas de homologia (A e B) para o primeiro exão traduzido de IL-22 (exão 1) por PCR (95 ° C, 2 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 30 seg, e uma extensão final a 72 ° C durante 10 min). Num sistema de reacção de PCR de 50 uL, adicionar 50 ng (1 pi) de DNA de BAC, 0,5 ul de iniciadores (10 uM), 40 ul de PCR Supermix alta fidelidade, e 8 mL de H 2 O.
    NOTA: Os iniciadores para as caixas A e B são como se segue: Uma caixa para a frente: 5'-T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG e reverso: 5'-CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; Caixa de B Forward: 5'-G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA e Reverse: 5'-T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. Os locais das enzimas de restrição (Asc I e Pac I) estão sublinhados.
  3. Ligadura 500 ng de Asc I-digerido A e 500 ng de Fragm B Pac I-digeridoentos em 50 ng de PLD53SC-ATB (tdTomato) vector a 16 ° C durante 1 h.
  4. Transformar o vector PLD53SC-ATB purificada em células competentes BAC-11 e cultura deles em meio Luria-Bertani (LB) placas de agar com cloranfenicol (20? G / ml) e ampicilina (30 ug / ml) a 37 ° C. Escolha dois a três colónias de co-integrar a partir das placas principais CH / Amp.
  5. Inocular cada colónia em 1 ml de LB suplementado com 20 ug / ml de cloranfenicol e incubar durante 1 hora a 37 ° C e 225 rpm. Espalhe 100 ul de cada mistura sobre uma placa de LB-agar (10 g de peptona 140, 5 g de extracto de levedura, 12 g de ágar e 1 L de água; pH 7,5) suplementado com cloranfenicol e 4-4,5% de sacarose. Incubar a cultura durante a noite a 37 ° C.
  6. Escolha ambas as colônias grandes e pequenos e replate-los em duas placas LB-ágar com cloranfenicol. Em seguida, expor as placas com ou sem luz UV durante 30 segundos e escolher as colónias sensíveis aos raios UV para uma análise mais aprofundada.
  7. Identificar o DNA BAC modificado por PCR usando tdTomato / IL-22 iniciador heterozigotos (Forward: 5 'ACT TGT GCG ATC TCT GAT GGT; Reverso: 5' TGT AAT CGG ggA TGT CGG C). As condições de ciclos térmicos são as seguintes: 95 ° C durante 2 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 56 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 30 seg; e uma extensão final a 72 ° C durante 10 min.
  8. Confirmar a sequência da área modificada do BAC por sequenciação BAC direta da grande-prep BAC DNA 12.
  9. Anestesiar um rato receptor com uma dose de 0,25% tribromoetanol para dentro da cavidade peritoneal, quando da instalação do micro-injectadas em ratinhos zigotos / 6c C57BL pseudo-grávida.
  10. Linearizar a IL-22-tdTomato BAC construção (10 ug) por digestão com 5 ul de restrição endonucleasePi-Scel em 100 ul do sistema de reacção e microinject o DNA de BAC linearizado em ovos fertilizados de ratinhos C57BL / 6 fêmeas na fase pronuclear 13. screen ratinhos transgénicos por análise de mancha de Southern de DNA isolado a partir de biópsias da cauda usando os procedimentos padrão.

Preparação 2. uma única célula de baços, timo, linfonodos e placas de Peyer

NOTA: ratinhos repórter de IL-22-tdTomato foram mantidas no National Cancer Institute (NCI, Frederick, MD). O método de eutanásia está em conformidade com as orientações AVMA mais recentes sobre a eutanásia. Todos os ratinhos foram sacrificados usando inalação de CO 2 14.

  1. Euthanize um IL-22-tdTomato do mouse em uma câmara de CO 2 e colocá-lo em uma almofada limpo. Esterilizar a pele do abdômen por pulverização álcool 70% e cortá-la aberta. Remover o baço no flanco esquerdo e o timo por trás do esterno.
  2. Para colher os nós mesentericlymph (localizada no tecido mesentérica) e placas de Peyer (pequenos lymphoidnodules toda a região do íleo do intestino delgado), pegue a mesentérica branco perolado nodos perto de tele parede do intestino delgado dissecar usando fórceps com pontas finas-ponto serrilhadas primeiro e, em seguida, remover todo o intestino delgado e cólon para fora do corpo. Encontrar as manchas ovais estendidas (placas de Peyer) ao longo do intestino e cortá-los com tesoura. Moer estes tecidos linfóides (gânglios linfáticos e placas de Peyer) individualmente entre duas lâminas foscas em uma suspensão de uma única célula em soro fetal de bovino / 1% de PBS (FBS) a tampão em gelo.
  3. Picar o baço ou tecidos do timo utilizando o mesmo método que no passo 2.2. Centrifugar a suspensão do baço durante 8 min a 500 xg e 4 ° C. Adicionar 1 ml de tampão de lise ACK por baço para os sedimentos celulares.
  4. Misture bem e deixe-os repousar durante 1 min. Adicionar 9 ml de tampão de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) a cada amostra. Girar para baixo por centrifugação durante 8 min a 500 xg e 4 ° C para remover os glóbulos vermelhos.
    NOTA: Não adicionar tampão de lise ACK para as células do timo.
  5. Ressuspender os leucócitos, resultando em 5 ml de PBS e Pass as células através de um coador de células de 100 um. Recolher os sedimentos celulares por centrifugação a 500 xg durante 8 minutos.
  6. Ressuspender as células em 5 ml de meio RPMI ou em tampão FACS e contar as células viáveis, utilizando 0,4% de corante azul de tripano solução / PBS.

3. Isolamento de Intraepithelial linfócitos e lâmina própria células dos intestinos

  1. Abra a pele abdominal como no passo 2.1 cortar o intestino delgado, do duodeno (ao lado do estômago) para íleo (junto ao apêndice), e todo o cólon, bem acima do ânus. Remover o tecido adiposo extra e utilizando fórceps mesentéricos. Colocar os intestinos imediatamente em PBS arrefecido em gelo.
  2. Procure placas de Peyer (pequenos nódulos ásperas) ao longo da região distal do intestino delgado. Retire as massas usando uma pinça andopen intestino longitudinalmente com uma tesoura. Lave bem o intestino com 10 ml de PBS gelado.
  3. Incubar os tecidos em 20 ml de tampão de pré-digestão (5 mM de EDTAe ditiotreitol 1 mM em solução salina equilibrada de Hank (HBSS)) durante 30 min a 37 ° C com rotação lenta (50 rpm) num agitador. Depois de cada uma das incubações 2, remover a camada de células epiteliais, contendo os linfócitos intraepiteliais (IELS), por agitação em vórtice intensa (30 segundos a 12000 rpm) e transmitir todos os tecidos através de um filtro de células de 100 um.
  4. Adicionar 20 ml de solução de EDTA novo para o tecido para segunda incubação durante 30 min a 37 ° C. Passar as fracções IEL através de um filtro de células de 100 um e reuni-los com as fracções anteriores. Manter os fragmentos restantes do intestino em gelo a ser tratada no passo 3.9.
  5. Centrifugar as fracções IEL reunidas a 800 xg durante 5 min a 4 ° C. Lavam-se as fracções reunidas IEL com 10 ml de HBSS / 5% de FBS e colocá-los para baixo durante 5 min a 800 xg e 4 ° C.
  6. Ressuspender as células em 8 ml de meio de 44% de sílica coloidal 15, cobrindo-as de forma sílica coloidal 5 ml de 67%. Centrifugar a 44% / 67gradiente de mistura de células 0,5% durante 20 min à temperatura ambiente e 1500 x g.
  7. Recolher as células IEL da banda na interface. Em primeiro lugar, remover a camada superior do sobrenadante (cerca de 5 ml) com 1 ml da pipeta. Em seguida, IELs colheita na interfase do gradiente médio de sílica coloidal.
  8. Lavar as IELs por adição de 10 ml de meio RPMI. Rodar as células para baixo durante 5 min a 800 xg e 4 ° C. Ressuspender as IELs em 5 ml de meio RPMI para o passo 3.15.
  9. Para o isolamento dos linfócitos da lâmina própria (LPLs), mediu os fragmentos de tecido do intestino a partir do passo 3.4 em pequenos pedaços com uma tesoura (1 mm) e digerir os pedaços com 10 ml de tampão de digestão (0,05 g de colagenase, 0,05 g de ADNasel, e 0,3 g de dispase II em RPMI / FBS a 5%) durante 15-20 min a 37 ° C.
  10. Filtrar a mistura através de um filtro celular de 70 uM. O sobrenadante de escoamento contém o LPL libertado.
  11. Totalmente digerir os fragmentos do intestino, repetindo os passos 3,9-3,10 (normalmente, eles devem serrepetido 3 vezes). Cada vez, reunir os sobrenadantes contendo o LPLs.
  12. Recolher as células por centrifugação durante 5 min a 1500 xg e a temperatura ambiente e ressuspender as pastilhas em RPMI / FBS a 5%. Passá-las através de um filtro de células 40 ^ m.
  13. Ressuspender as células em peletes de 10 ml da fracção de 40% de um gradiente de meio de 40:80 de sílica coloidal e sobrepô-las em 5 ml da fracção de 80% em um tubo de 15 ml.
  14. Realizar a separação por gradiente de densidade por centrifugação durante 20 min a 1500 xg e 15 temperatura ambiente.
  15. Recolhe-se o LPLs, tal como descrito na etapa 3.7. Lavá-los uma vez com 10 ml de PBS e ressuspender as pastilhas em 1 ml de / 1% de FBS meio RPMI tampão ou PBS.
  16. Contar as células viáveis ​​(tanto IELS e LPLs) usando de 0,4% trypan solução corante azul / PBS.

4. Expressão de IL-22-tdTomato na colite

  1. Preparar suspensões de células de baço de ratinhos individuais de IL-22-TdTomato a uma concentração de 1 x 10 7 células / ml em PBS estéril, como descrito nos passos 2,1-2,4.
  2. Purificar as células T CD4 + usando o mouse CD4 celular método de isolamento de 10 Negativos. Classificá-los com anti-CD4-APC (clone RM4-5, 0,5 ul / 1 x 10 6 células em PBS / 1% de tampão FBS) e anti-CD45RB com FITC (clone 16A, 0,5 mL / 1 x 10 6 células em PBS / 1% de tampão FBS) por incubação a 4 ° C durante 30 min.
  3. Rodar as células para baixo durante 5 min a 500 xg e 4 ° C. Lavam-se as células com 2 ml de tampão de PBS / 1% de FBS e ressuspender-los em 1 ml de tampão de coloração de FBS / PBS a 1%.
  4. Executar as células T marcados numa máquina de citometria de fluxo 16. Portão as células em uma população de células T e classificar células duplamente positiva altas CD4 + CD45RB (o comprimento de onda detectado a 488 nm e 633 nm) lasers.
  5. Colher as células separadas por centrifugação durante 5 minutos a 500 xg e 4 ° C. Ressuspender os sedimentos celulares em tampão PBS estéril a 1 x 10 6 células / ml. Injetar as células (0,5 x 10 6) para o peritônio ofeach RAG1 - rato destinatário - /.
  6. Sacrifício dos ratinhos receptores sob CO 2 em vários pontos de tempo. Colher os nódulos linfáticos mesentéricos e os intestinos grosso e delgado, conforme descrito nas etapas 2.1 e 2.2. Coloque cada nó de linfa mesentérica e corte-aberto intestino (papel / intestino / papel sanduíche) em paraformaldeído a 4% (PFA; lidar com sob um exaustor) durante a noite para reparar os tecidos. Substitua o PFA com 18% de sacarose durante 16-24 horas e depois congelar os tecidos para seccionamento.
  7. Usar a máquina de criostato para cortar o tecido 17, 18, 19. Aquecer as secções de tecido para a temperatura ambiente durante cerca de 60 min e colocá-los em acetona durante 10 min à temperatura ambiente. Seca-se-lhes à temperatura ambiente durante aproximadamente 5 min.
  8. Adicionar FBS em excesso, removê-lo com uma pipeta e adicionar anti-RFP na proporção de 1: BSA 200 de diluição em 0,1% / 1x PBS. Incubar o anticorpo a 37 ° C durante 60 min.
  9. Lavar as secções em PBS 1x durante 10 min e aplicar o anticorpo secundário correspondente (de cabra anti-coelho 568) para o tecido, diluído 1: 300 em 1% BSA / PBS 1x, durante 30 min à temperatura ambiente.
  10. Lavar as lâminas em 1x PBS por 10 min, limpe-os secar e adicione lamelas.
  11. Visualize todas as amostras com um microscópio fluorescente sob iluminação consistente (RFP: filtro de excitação 540-580 nm) usando a objetiva de 40X.

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Resultados

Um murino IL-22 do transgene repórter foi criada usando recombineering para modificar um cromossoma artificial bacteriano transportando o locus de IL-22. A Figura 1 mostra um diagrama de vector contendo o gene de pBACe3.6 sacBII, um marcador de selecção positiva, e o gene de resistência ao cloranf enicol antibiótico 11. Após a introdução tdTomato ao exão 1, a sequência do péptido de sinal foi interrompido, tal como mostrado na Fig...

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Discussão

IL-22 desempenha um papel essencial na inata defesa e tecido hospedeiro remodelação. IL-22 produtoras de células foram identificados ex vivo por coloração intracelular. No entanto, continua a ser difícil de controlar a expressão de IL-22 in situ, quer no seu estado normal ou em condições inflamatórias. Este protocolo descreve um novo método para desenvolver um modelo de ratinho repórter de IL-22, o que nos permite localizar as células que expressam o repórter in vivo. A codificação TdTomato ge...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos a Kelli Czarra e Megan Karwan pela assistência técnica animal, Kathleen Noer e Roberta Matthai pela assistência à citometria de fluxo e Donna Butcher e Miriam R. Anver pela análise patológica. Este projeto foi apoiado por uma doação da Ely and Edythe Broad Foundation (para Scott Durum) e foi financiado no todo ou em parte com fundos federais do National Cancer Institute, National Institutes of Health, sob o Contrato No. HHSN261200800001E (MRA).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
RP23-401E11 BACThermo Fisher ScientificRPCI23. CPrecisa de ID do gene: 50929
NucleoBond BAC 100Takara Clontech740579
PCR SuperMix High FidelityThermo Fisher Scientific10790020
PI-SceINew England BiolabsR0696S
SpeINew England BiolabsR0133S
LB CaldoThermo Fisher Scientific10855-0011 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Extrato de Levedura, 5 g de cloreto de sódio 
Anti-rato CD3eBioscience11-0031
Anti-rato CD4eBioscience17-0041
Anti-rato CD45Thermo Fisher ScientificMCD4530
Anti-rato CD45RBeBioscience11-0455
Anti-rato RFPAbcam AbcamAb62341
HBSS, sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenolThermo Fisher Scientific14175145KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose
Dnase IRoche10104159001
ACK lysing bufferThermo Fisher ScientificA1049201
PercollGE healthcare life sciences17-0891-01
Colagenase DRoche11088858001
Dispase II (protease neutra, grau II)Microscópio4942078001
IX70OlympusPedir orçamento
Microscópio Nikon Eclipse 80iNikonPedir orçamento
Dynal shakerElectron Microscopy Science61050-10
FACSAriaBD BiosciencePedir orçamento
LSRII SORP/citometria de fluxoBecton, Dickinson and Company Pedir orçamento
de fluorescência invertida Roche

Referências

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