Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter

Resumo

Descrevemos aqui um modelo de camundongo repórter transgênico para visualizar as células produtoras de IL-22 dentro de diferentes tecidos de camundongos. Este método pode ser usado para rastrear a localização de outras citocinas ou proteínas secretas no camundongo.

Resumo

ratinhos repórter têm sido amplamente utilizados para se observar a localização da expressão de genes alvo. Este protocolo centra-se em uma estratégia para estabelecer um novo modelo de rato transgénico repórter. Escolhemos para visualizar a expressão do gene interleucina (IL) 22 porque esta citoquina tem actividades importantes no intestino, onde contribui para a reparação de tecidos danificados por inflamação. Sistemas repórter oferecem vantagens consideráveis sobre outros métodos de identificação de produtos in vivo. No caso de IL-22, outros estudos havia células a partir de tecidos isolado pela primeira vez e, em seguida, re-estimularam as células in vitro. IL-22, que é normalmente secretada, foi aprisionado no interior das células utilizando um medicamento, e coloração intracelular foi usada para visualizar. Este método identifica células capazes de produzir IL-22, mas não determinar se eles estavam fazendo isso in vivo. O design repórter inclui a inserção de um gene para uma proteína fluorescente (tdTomato) para o gene de IL-22 de tal waY que a proteína fluorescente não pode ser segregada e, portanto, permanece preso no interior das células que produzem in vivo. Produtores fluorescentes podem então ser visualizado em secções de tecidos ou por meio de análise ex vivo através de citometria de fluxo. O processo de construção efectiva para o repórter incluídos recombineering um cromossoma artificial bacteriano que continha o gene de IL-22. Este cromossoma manipulado foi então introduzido no genoma do rato. Homeostático de IL-22 de expressão de repórter foi observada em diferentes tecidos de rato, incluindo o baço, timo, nódulos linfáticos, placas de Peyer, e no intestino, por análise de citometria de fluxo. A colite foi induzida por células T (CD4 ⁺ CD45RBhigh) de transferência, e expressão repórter foi visualizado. As células T positivas foram pela primeira vez presente nos linfonodos mesentéricos, e então eles acumulada no interior da lâmina própria das distais pequenos tecidos do intestino e cólon. A estratégia utilizando BACs deu expressão repórter boa fidelidade em relação a IL-22 expression, e é mais simples do que os procedimentos knock-in.

Introdução

expressão específica do tipo celular de genes repórter é útil para identificar as células que expressam activamente o alvo em tecidos sob estados homeostáticos e perturbados. Também permite a purificação destas células, que permanecem viáveis, para estudar as suas outras propriedades. Reporter ratinhos foram utilizados para elucidar o mecanismo de acção de citoquinas factores de transcrição específicos, e elementos reguladores. Estratégias anteriores ^{1, 2, 3,} em grande medida invocado batendo o repórter para o locus alvo no cromossoma do rato, um procedimento demorado e disp....

Protocolo

Todos os animais receberam a atenção adequada de acordo com os procedimentos experimentais descritos no Guia de 2011 para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório Comité das Frederick National Laboratory for Cancer Research.

1. Geração de IL-22-tdTomato Mice repórter por BAC recombineering

NOTA: Os ratos devem estar inconsciente e não se movem em resposta a um estímulo nocivo. Esterilizar a área cirúrgica com 70% de etanol e esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos usando um esterilizador de esferas de vidro.

1. Purifica-se o DNA de BAC (RP23-401E11, comprimento clone 228391 pb), utilizando um métod....

Resultados

Um murino IL-22 do transgene repórter foi criada usando recombineering para modificar um cromossoma artificial bacteriano transportando o locus de IL-22. A Figura 1 mostra um diagrama de vector contendo o gene de pBACe3.6 sacBII, um marcador de selecção positiva, e o gene de resistência ao cloranf enicol antibiótico ^11. Após a introdução tdTomato ao exão 1, a sequência do péptido de sinal foi interrompido, tal como mostrado na Fig.......

Discussão

IL-22 desempenha um papel essencial na inata defesa e tecido hospedeiro remodelação. IL-22 produtoras de células foram identificados ex vivo por coloração intracelular. No entanto, continua a ser difícil de controlar a expressão de IL-22 in situ, quer no seu estado normal ou em condições inflamatórias. Este protocolo descreve um novo método para desenvolver um modelo de ratinho repórter de IL-22, o que nos permite localizar as células que expressam o repórter in vivo. A codificação TdTomato ge.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RP23-401E11 BAC	Thermo Fisher Scientific	RPCI23. C	Precisa de ID do gene: 50929
NucleoBond BAC 100	Takara Clontech	740579
PCR SuperMix High Fidelity	Thermo Fisher Scientific	10790020
PI-SceI	New England Biolabs	R0696S
SpeI	New England Biolabs	R0133S
LB Caldo	Thermo Fisher Scientific	10855-001	1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Extrato de Levedura, 5 g de cloreto de sódio
Anti-rato CD3	eBioscience	11-0031
Anti-rato CD4	eBioscience	17-0041
Anti-rato CD45	Thermo Fisher Scientific	MCD4530
Anti-rato CD45RB	eBioscience	11-0455
Anti-rato RFP	Abcam Abcam	Ab62341
HBSS, sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol	Thermo Fisher Scientific	14175145	KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose
Dnase I	Roche	10104159001
ACK lysing buffer	Thermo Fisher Scientific	A1049201
Percoll	GE healthcare life sciences	17-0891-01
Colagenase D	Roche	11088858001
Dispase II (protease neutra, grau II)	Microscópio	4942078001
IX70	Olympus		Pedir orçamento
Microscópio Nikon Eclipse 80i	Nikon		Pedir orçamento
Dynal shaker	Electron Microscopy Science	61050-10
FACSAria	BD Bioscience		Pedir orçamento
LSRII SORP/citometria de fluxo	Becton, Dickinson and Company		Pedir orçamento

de fluorescência invertida Roche