Artigo de método

A técnica de rim perfundidos rato isolado

DOI:

10.3791/54712

⸱

17 de novembro de 2016

 ,  , 
1Institute of Anatomy, Swiss National Centre of Competence in Research Kidney, University of Zürich, 2Department of Physiology, University of Regensburg

Neste artigo

Resumo

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O mouse rim isolado perfundido (MIPK) é uma técnica para manter um rim do rato em condições ex vivo perfundidos e funcionais durante 1 h. Os tampões e técnica cirúrgica encontram-se descritos em pormenor.

Resumo

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O mouse rim isolado perfundido (MIPK) é uma técnica para manter um rim do rato em condições ex vivo perfundidos e funcionais durante 1 h. Este é um pré-requisito para o estudo da fisiologia do órgão isolado e para muitas aplicações inovadoras que possam ser possíveis no futuro, incluindo decellularization perfusão de bioengenharia nos rins ou a administração de anti-rejeição ou drogas edição do genoma em altas doses para preparar o rim para transplante. Durante o tempo da perfusão, o rim pode ser manipulada, a função renal pode ser avaliada, e vários produtos farmacêuticos administrados. Após o procedimento, o rim transplantado ou pode ser processado para a biologia molecular, bioquímica, ou microscopia.

Este artigo descreve o perfusado e da técnica cirúrgica necessária para a perfusão ex-vivo de rins de rato. Os detalhes do aparelho de perfusão são dados e os dados são apresentados mostrando o vESPONSABILIDADE da preparação do rim: fluxo sangüíneo renal, resistência vascular, e urina dados como funcionais, micrografias eletrônicas de transmissão de diferentes segmentos dos néfrons como leituras morfológicas e Western blot de proteínas de transporte de diferentes segmentos dos néfrons como leitura molecular.

Introdução

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A perfusão isolada de órgãos tem sido objecto de um esforço contínuo entre os fisiologistas por muitas décadas 1. A técnica permite que a função do órgão, sem influências sistêmicas, tais como pressão arterial, hormônios ou nervos, a ser estudado. Carl Eduard Loebell é considerado para ser o primeiro a ter descrito a perfusão bem sucedida de um rim isolado, em 1849 2. Desde então, o aparelho de perfusão foi submetido refinamento significativa. Frey e Gruber introduzido um pulmão artificial para bombas de oxigenação e pulsátil para perfusão contínua 2. Enquanto os primeiros pesquisadores estudaram principalmente os rins de mamíferos de....

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Protocolo

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Todos os procedimentos que envolvem animais descritos neste manuscrito foram conduzidos de acordo com a lei suíça e aprovado pela administração veterinária do Cantão de Zurique, Suíça.

1. Preparação Tampão

  1. Preparar soluções 1 - 4 e a solução de hormônio antidiurético (ADH) (Tabela 1).
  2. Prepara-se o tampão de diálise (Tabela 1).
    NOTA: Este é o tampão utilizado como o tampão de diálise durante a perfusão. Mais tarde, os eritrócitos serão diluídas neste tampão para formar o perfusato final.
  3. preparação de eritrócitos.
    1. Dilui-se 250 ml de concentrado de eritrócitos hu....

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Resultados

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Com o método descrito, rins isolados do rato podem permanecer viáveis ​​durante pelo menos 1 h. Foi testada a viabilidade dos tecidos depois de 1 hora de perfusão contínua com funcional (fluxo sanguíneo renal e resistência vascular, gasometria do fluxo venoso, taxa de filtração glomerular, urinário fraccionada Na + e K + excreção, e osmolaridade urinária) e morfológico (eletrônica de transmissão microscopia, TEM) em quatro métodos rins de tipo selvagem C57BL / 6. Al.......

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Discussão

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O mouse rim isolado perfundido é uma ferramenta para o estudo da função renal em um ambiente controlado ex vivo, durante 1 hora, fazendo a ponte entre experiências in vivo em animais intactos, o que pode ser falho pelo impacto de vários fatores sistêmicos e experimentos in vitro em segmentos dos néfrons isolados ou células cultivadas, o que necessariamente negligenciam o impacto da estrutura de órgãos intactos na função. Há, ao conhecimento dos autores, nenhuma técnica alternativa com a qual p.......

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Divulgações

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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes e nada mais a divulgar.

Agradecimentos

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Os autores gostariam de agradecer a Hans-Joachim Schurek pelos inestimáveis conselhos científicos. Os autores gostariam de agradecer a Monique Carrel e Michèle Heidemeyer pela excelente assistência técnica, David Penton Ribas e Nourdine Faresse pela leitura crítica do manuscrito e a Carsten Wagner e Jürg Biber pelo anticorpo NaPi-2a. Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional Suíço de Competência em Pesquisa "Kidney.CH" e por uma bolsa de projeto (310030_143929/1) da Fundação Nacional de Ciência da Suíça.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Circuito de perfusão:
Câmara úmida 834/8Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-2901
Cânula com cesto e porta lateralHarvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-2947
Termostato TC120-ST5 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-4544
ISM 827/230V Bomba de rolos Reglo AnalogueHarvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-0114
Reservatório encamisado para solução tampão 1 LHarvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3438
Reservatório encamisado para solução tampão 0,5 LHarvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3436
Transdutor de Pressão APT300 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3862
TAM-D Plugsys TransdutorHarvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-1793
SCP Plugsys servo controladorHarvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-2806
Windkessel Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3717
Aquisição de dados HSE-USBHarvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3330
Dialisador de baixo fluxo Diacap PolysulfoneB.Braun7203525
PE-Tubing para canulação da aorta 1,19 mm I.D. x 1,70 mm O.D.Commodities Científicas Inc.BB31695-PE/8
NomeEmpresaNúmero de catálogo<strong>Comentários
Reagentes tampão:
Aminoplasmal 10%B.Braun134518064
Piruvato de sódioSigma-AldrichP2256-25G
Sal monossódico de ácido L-glutâmico hidratadoSigma-AldrichG1626-100G
Sal de sódio de ácido L-(-) málicoSigma-AldrichM1125-25G
Sódio-L-lactatoSigma-AldrichL7022-10G
sal de sódio de ácido alfa-cetoglutáricoSigma-AldrichK1875-25G
NaClSigma-Aldrich31434-1KG-R
NaHCO3Sigma-AldrichS5761-5KG
KClSigma-Aldrich60130-1KG
UréiaSigma-AldrichU5378-500G
CreatininaSigma-AldrichC4255-10G
AmpicilinaRoche10835242001
MgCl2 * 6H2OSigma-AldrichM2393-500G
D-GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
CaCl2 * 6H2O Riedel-de-Haë n12074
NaH2PO4Sigma-AldrichS9638-500G
Na2HPO4Sigma-AldrichS0876-500G
Hormônio Antidiurético dDAVPSigma-AldrichV2013-1MG
FITC-InulinaSigma-Aldrich
Filtro usado para filtração de eritrócitosMacherey-NagelMN 615
BGA Análise:
ABL 80 flexRadiômetro Microscópio Eletrônico ApS
Médico:
Philips CM100 TEMFEI

Referências

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  1. Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81 (2112), 621-623 (1935).
  2. Skutul, K. Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv. 123 (4-6), 249-273 (1908).
  3. Nizet, A.

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