Aqui, apresentamos um protocolo para preparar amostras com baixo número de células para análise de microscopia eletrônica de transmissão (MET).
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Artigo de método
Uma abordagem alternativa para preparação de amostras com baixo número de celular de Análise TEM
Neste artigo
Resumo
Resumo
microscopia eletrônica de transmissão (TEM) fornece detalhes sobre a organização celular e ultra-estrutura. No entanto, a análise TEM de populações de células raras, especialmente as células em suspensão, tais como células estaminais hematopoiéticas (HSCs), permanece limitada devido à exigência de um elevado número de células durante a preparação da amostra. Há um cytospin ou monocamada algumas abordagens para a análise de MET a partir de amostras escassos, mas estas abordagens não conseguem obter os dados quantitativos significativos do número limitado de células. Aqui, uma abordagem alternativa e inovadora para preparação de amostras em estudos TEM é descrito para populações de células raras que permite a análise quantitativa.
Um número de células relativamente baixa, ou seja, 10.000 HSCs, foi utilizado com sucesso para a análise de TEM em comparação com os milhões de células, tipicamente utilizados para estudos TEM. Em particular, Evans azul coloração foi realizada após paraformaldeído-glutaraldeído (PFA-GA) de fixação para visualizar o pequeno pel celularvamos, o que facilitou a incorporação de agarose. Aglomerados de numerosas células foram observadas em seções ultra-finas. As células tinham uma morfologia bem conservada, e os detalhes de ultra-estruturais das mitocôndrias e vários complexos de Golgi eram visíveis. Este protocolo eficiente, fácil e reprodutível permite a preparação da amostra a partir de um número de células de baixo e pode ser usado para a análise TEM qualitativa e quantitativa sobre as populações de células raras a partir de amostras biológicas limitados.
Introdução
Detalhes ultra-estruturais e sub-organela das células foram revelados principalmente por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) estudos de tecidos ou pellets de células 1,2. peças sólidas de tecidos pode ser facilmente utilizada para estudos de microscopia electrónica. No entanto, análises de MET 1,3 em células em suspensão e necessitam de permanecer desafiador números elevados de células, isto é, milhões de células. Devido a isso, análises de ultra-estruturais das populações de células raras em suspensão, por exemplo, células estaminais hematopoiéticas (HSCs), não são facilmente avaliados. Várias tentativas para análise d....
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo comitê de animais institucional a Fundação de Pesquisa Infantil de Cincinnati. Para este estudo, as células estaminais hematopoiéticas foram isoladas a partir da medula óssea de ratinhos C57BL / 6 com idade consanguínea 2 - 4 meses. Separação de células utilizando FACS após coloração da BM com diferentes fabricantes de superfície, incluindo Linhagem, c-kit, Sca-1, Flt3 e CD34 foi utilizada para a purificação de HSC baseado em Lin Sca-1 + Flt3 c-kit + - estratégia gating - CD34 como protocolo padrão descrito anteriormente 8.
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Resultados
Um protocolo eficiente e consistente para a preparação da amostra para realizar a análise TEM de baixo número de células é descrito. Coloração pós-fixação com azul de Evans e da transferência de células para um tubo de 0,5 ml de microcentrífuga ajudou a visualizar o pequeno pellet celular 7. Osmification com tetróxido de ósmio em agarose levou a uma detecção fácil do sedimento celular escuro durante a desidratação e a incorporação.
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Discussão
Este método permite a análise TEM em números de celulares de baixo, usando Evans coloração azul e agarose a incorporação de localizar um pellet de células pequenas durante a desidratação, inclusão em resina e seccionamento processos. É importante notar que mantém agrupamentos de células em conjunto e preserva a ultra-estrutura celular, o que é desejável para examinar várias células para quantificação de dados.
Em estudos TEM, um sedimento celular, contendo milhões de células é muitas vezes n.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Núcleo de Pesquisa em Patologia pela assistência nos estudos de análise de microscópio eletrônico no Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati. O trabalho foi apoiado pelo NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 ao MDF).
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Materiais
CAUTION
Ciências aquosas da eletrônica Ferramenta de
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Paraformaldeído 20% aquoso Soln | microscopia eletrônica Sciences | 15713 | CAUTION Tóxico por inalação, contato com a pele. Use luvas, use exaustor. |
| 16350 | microscopia | de Gluteraldeído 70% Soln | Use luvas, use exaustor. |
| Tampão de cacodiladato | Microscopia eletrônica Ciências | 12300 | Faça tampão de cacodiladato 0,1 M (pH 7,4) em água destilada, armazene a 4 ° C. CUIDADO< / forte> Irritante por inalação ou contato com a pele, use luvas e trabalhe em capela de exaustão. |
| Evans Azul | Sigma | E-2129 | |
| Agarose de baixo ponto de fusão | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Tetraóxido de ósmio | Microscopia eletrônica Ciências | 19130 | 1 g em 50 ml de tampão de cacodiladato 0,1 M para fazer 2% de estoque de OsO4, CUIDADO Muito tóxico por inalação ou contato com a pele, oxidante forte, use roupas de proteção, proteção para os olhos, use exaustor. |
| LX-112 Kits de Incorporação (LADD®)< / forte > | |||
| DDSA (anidrido dodecenilsuccínico) | LADD | 21340 | Misture 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 juntos e, em seguida, adicione 1,4% DMP-30 |
| NMA (anidrido metil Nadic) | LADD | 21350 | |
| Resinas epóxi Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | < forte > CUIDADO < / forte> Tóxico por inalação, contato com a pele. Use luvas, roupas de proteção, use exaustor. |
| DMP-30 (2,4,6-Tri(dimetilaminometil)fenol) | LADD | 21370 | |
| Citrato de chumbo de Reynolds (EM Stain II) | Leica | CUIDADO Tóxico por inalação, evite o contato com a pele ou os olhos. | |
| Acetato de uranilo (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CUIDADO Tóxico por inalação, evite o contato com a pele ou os olhos. |
| Meio Dulbecco's Modificado de Iscove (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composição: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glicose, Ca, Mg, piruvato de grama etc. Para detalhes https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Molde de ponta de pirâmide | Cilindros de montagem Ted Pella | 10585 | |
| Ted Pella | 10580 | ||
| Ultra-micrótomo | (Leica EM UC7) | ||
| 200 grades de malha (nikil) | Microscopia eletrônica Sciences | G-200 Ni | |
| Microscópio eletrônico | Hitachi modelo H-7650 | ||
| Software de mecanismo de captura de imagem | AMT-600 | ||
| Placas de Petri de plástico de 35 mm | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super cola Cianoacrilato | Microscopia eletrônica Sciences | 72588 | |
| Lâminas de barbear Frascos | |||
| de cintilação de vidro | Fisher científico | 03-337-14 | |
| Lâminas de vidro | |||
| cílios | |||
| Ferramenta de laço de metal |
Referências
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
- Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr Opin Neurobiol. 14, 591-5....
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Reimpressões e permissões
