Abstract
Las biopelículas consisten en grupos de bacterias encapsuladas en una matriz de auto-secretada. Juegan un papel importante en la contaminación industrial, así como en el desarrollo y persistencia de muchas infecciones relacionadas con la salud. Una de las biopelículas más bien descritos y estudiados en la enfermedad humana se produce en la infección pulmonar crónica de los pacientes con fibrosis quística. Al estudiar biofilms en el contexto del huésped, muchos factores pueden afectar a la formación y el desarrollo de biopelículas. Con el fin de identificar cómo los factores del huésped pueden afectar a la formación y el desarrollo de biopelículas, se utilizó un método cubre objetos de cámara estática para crecer biopelículas en presencia de factores derivados del huésped en forma de sobrenadantes de esputo. Las bacterias se sembraron en cámaras y se expusieron a filtrados de esputo. Después de 48 h de crecimiento, las biopelículas se tiñeron con un kit de viabilidad comercial biopelícula antes de la microscopía confocal y análisis. Tras la adquisición de imágenes, las propiedades del biofilm pueden evaluarse utilizando diferentes plataformas de software.Este método nos permite visualizar las propiedades clave de la formación de biopelículas en presencia de diferentes sustancias, como los antibióticos.
Introduction
biopelículas bacterianas son grupos de microorganismos que están unidos entre sí y encerrados en una matriz de auto-secretada. 1,2 Clásicamente, que representan bacterias unidas físicamente a una superficie abiótico o biótico formado bajo condiciones de flujo. Las biopelículas también se han demostrado para crecer en condiciones estáticas (ausencia de flujo) y distal de las superficies, tales como en la interfase aire-líquido de piscinas térmicas o unas películas formadas en tubos de ensayo. Estas biopelículas hace tiempo se reconoce en el medio ambiente y son un detrimento importante para los procesos industriales, ya que se pueden formar en los depósitos de agua o en las tuberías, lo que resulta en la contaminación biológica, la corrosión y los bloqueos. 3,4
Las biopelículas son también críticos en establecimientos de salud, ya que se ha demostrado estar implicado en infecciones relacionadas con el catéter, infecciones pulmonares en pacientes con fibrosis quística, así como en numerosas otras infecciones. 5,6 Uno de los rasgos distintivos de las infecciones biofilm es el dearrugado susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos y deficientes despeje de la sistema inmune innato. 7-9 El más estudiados, escenarios clínicamente relevantes que supongan una infección basada en la biopelícula se produce en pacientes con fibrosis quística (FQ), que están infectados crónicamente con las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa puede someterse a una serie de cambios durante el establecimiento de la infección crónica que la hacen muy difícil de tratar. 10,11 Las biopelículas pueden activar diferencialmente la inmunidad innata y conducir la inflamación. 12-14 Como estas infecciones provocan un aumento de la morbilidad y la mortalidad en los pacientes con FQ, es crucial para entender los factores que pueden afectar el desarrollo del biofilm en este contexto.
Un estudio reciente sugiere que host-factores son críticos en la formación de agregados de biopelícula P. aeruginosa. 15 Estas biopelículas contribuyen a la reducción de la susceptibilidad a los antibióticos y los mecanismos de defensa del huésped. el presena vez de factores derivados del huésped, tales como la elastasa de neutrófilos, así como productos secretados a partir de microorganismos presentes en el pulmón con FQ, tienen el potencial para modular en gran medida la formación y el desarrollo de biopelículas. 16 Además, las biopelículas interactuar con el anfitrión para modular la expresión de numerosos caminos e iniciar la inflamación. Si bien los métodos de alto rendimiento, tales como el ensayo de cristal violeta estándar, puede proporcionar alguna información con respecto al proceso de biopelícula, la visualización de la biopelícula en respuesta a estos factores proporcionan más información en profundidad.
En este manuscrito se describe un método para el uso de factores de el esputo de pacientes con FQ para estudiar el desarrollo de biopelículas in vitro. Este método permite una rápida visualización de biofilms expuestos a esputo que contiene factores del huésped utilizando un kit de biofilm viabilidad comercial. Esta técnica se puede utilizar para identificar visualmente los cambios que ocurren durante el crecimiento de biopelículas en presencia de exógenonos productos, y representa un método mejorado para analizar los cambios en el desarrollo de biopelículas en diversas condiciones.
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Protocol
Tenga en cuenta que se requiere Junta Ética de Investigación (REB) para recoger y almacenar muestras de esputo de sujetos humanos. Estos estudios fueron aprobados por el Hospital para Niños Enfermos REB # 1000019444.
1. Preparación de muestras de esputo CF
- Recoger muestra de esputo de los pacientes durante las visitas rutinarias a la clínica de la fibrosis quística y mantener en hielo.
- El transporte de la muestra de esputo en el hielo en la primera hora de la recogida, para el laboratorio de investigación, al objeto de tratamiento.
2. Procesamiento de esputo
- Registrar el volumen de la muestra de esputo obtenido. Añadir solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 2 veces el volumen de la muestra (es decir, 2 partes de PBS, 1 parte de muestra).
- Mezclar bien la muestra con una pipeta de transferencia. Vortex la muestra a la máxima temperatura durante 1 minuto para mezclar completamente.
- Alícuota de 1 ml de la mezcla anterior en el número 1,5 ml tubos de microcentrífuga apropiados y giran hacia abajo a 5000 xg durante20 min a 4 ° C.
- Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y desechar el sedimento.
- Esterilizar por filtración del sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micras y recoger en un tubo de microcentrífuga limpio.
NOTA: La esterilidad del filtrado se ensayó en placas sobre agar LB e inoculando medios líquidos. - Almacenar el sobrenadante del esputo a -80 ° C para su uso futuro.
NOTA: El esputo de múltiples pacientes también pueden ponerse en común después de la filtración. - Antes de su uso, diluir el esputo filtrado 1/10 v / v (100 l de esputo, 900 l de medios de comunicación) en los medios de comunicación deseada.
NOTA: En este caso, se utilizó caldo lysogeny estándar (LB) los medios de comunicación.
3. Método cubreobjetos calibrada para la formación de biopelículas
- Crecer aislado bacteriano de la noche a la mañana interés en los medios deseada a 37 ° C con agitación (200 rpm).
Nota: Se usó una serie de diferentes bacterias, incluyendo aislados clínicos de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Burkholderia cepacia y Achromobacter xylosoxidans. Elección de los medios depende de las cepas y las condiciones de interés, sin embargo, los medios de comunicación LB pueden ser utilizados para los experimentos iniciales. - De cultivo durante la noche, colocar 40 l de cultivo en 4 ml de medio fresco y crecer durante 3-4 horas a 37 ° C con agitación (200 rpm) para obtener un cultivo con una densidad óptica a 600 nm (OD 600) de aproximadamente 0,5 -0.6.
- Se diluye la cultura desde el paso 3.2 a 1/5 en los medios de comunicación deseado con un 10% de filtrado de esputo o sin filtrado de esputo (como control). Otros concentración del filtrado de esputo puede ser probado (es decir, 50% o 100%).
- Utilice 200 l de la dilución para sembrar pozos de cámaras de diapositivas.
- Permiten que las bacterias se adhieran durante 4 horas a 37 ° C sin agitación.
- Después de 4 horas, retire el soporte y lavar suavemente la biopelícula con medio fresco 1x. Reemplazar con 200 l de medio nuevo.
NOTA: Para estudiar los efectos de esputo en el biofilm, las Fresmedios h deben contener el sobrenadante del esputo. - Permitir que las biopelículas que crecen para la cantidad deseada de tiempo a 37 ° C sin agitación, en sustitución de los medios de comunicación cada 12 horas, sin lavar hasta el momento para la microscopía.
NOTA: Para estudiar el efecto de los sobrenadantes del esputo en la susceptibilidad antibiótica de biopelículas, los antibióticos se añaden a los medios de comunicación después de 24 h de crecimiento de la biopelícula y se mantienen en los medios hasta que las manchas y la imagen de las biopelículas.
4. Las biopelículas de tinción y microscopía confocal
- Tras el tiempo de crecimiento deseada (24-48 h funciona mejor), quitar el medio de pozos de cámara y lavar suavemente cada cámara dos veces con 300 l de PBS estéril.
- Preparar la mezcla de tinción para biopelícula mediante la mezcla de 1 l de cada colorante (proporcionado en el kit de viabilidad) para cada ml de solución necesaria. Hacer colorante en solución de agua o medios de comunicación.
NOTA: El agua se recomienda por el fabricante. - Añadir 200 l de mezcla de colorante a cada pocillo de covergla chamberedss e incubar a temperatura ambiente, en la oscuridad durante 45 min.
- Retire la mezcla de tinción de las cámaras y lavar cada pocillo con 300 l de PBS estéril. Retirar PBS y reemplazar con agua fresca o medios de comunicación.
- Proceder con la visualización de las biopelículas mediante microscopía confocal.
5. La visualización de biopelículas con microscopía confocal
- Leer biopelículas manchadas en las cámaras inmediatamente después de la tinción (a menos de 1 hora). Minimizar el retardo en la visualización de las diapositivas por tinción 1 a 2 cámaras de 8 pocillos a la vez.
- Realizar las imágenes usando microscopio confocal láser para juegos de excitación y filtros para la adquisición.
NOTA: Aquí, el sistema confocal de disco giratorio con láseres borealis espectrales (verde: 491nm, Rojo: 561 nm) se utilizó para la excitación. Emisión conjuntos de filtros de 515/40 y 624/40 fueron utilizados para visualizar las manchas de la kit biofilm viabilidad. - Tome imágenes utilizando un objetivo 25X en agua microscopio confocal con la cámara.
- Tome 3-5 imágenes de cada pocillo.
NOTA: Por lo tanto durante otras 8 cubreobjetos así la recámara, se generarán imágenes 24-40. - Guardar las imágenes para su análisis.
NOTA: Las imágenes deben ser guardados como archivos TIFF-OME para ser analizados mediante COMSTAT 18,19. Instrucciones para el análisis de imágenes biofilm se pueden encontrar en http://www.comstat.dk/. Una vez que las imágenes se importan, parámetros tales como espesor medio, la biomasa y la cobertura de la superficie para cada canal (rojo y verde) se pueden analizar.
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Representative Results
El diseño general del experimento está representado en la Figura 1. El uso de este protocolo proporciona un método conveniente para visualizar los cambios en las biopelículas que crecen durante diferentes períodos de tiempo (por ejemplo, 24, 48 o 72 hr). Es importante destacar que las señales exógenas, tales como esputo filtrados, se puede añadir a visualizar los cambios en el desarrollo de biopelículas. Como se ve en la Figura 2, la presencia de 10% filtrados de esputo puede cambiar la arquitectura de la biopelícula (Figura 2A, paneles inferiores). 16 Estas imágenes pueden ser analizados mediante el software COMSTAT para obtener matrices de biopelícula clave, incluyendo espesor medio de la película biológica, la biomasa total y cobertura de la superficie. Esto se refleja en un aumento general en el grosor del biofilm (Figuras 2B y 3). 16 Los efectos de los antibióticos sobre las biopelículas en el esputo presencia se muestra en la Figura 3. por visuali zing los cambios en el desarrollo de biopelículas, se puede apreciar mejor cómo diferentes factores pueden afectar el crecimiento de la biopelícula, en un grado mucho mejor que los ensayos de biofilm tradicionales, como la tinción con cristal violeta.
Figura 1: Diseño general del experimento. Diagrama de flujo del protocolo básico. An (O / N) cultivo de una noche se diluye 1 / 1.000 y se dejó crecer hasta una DO final de 600 0.5. Esto vuelve a diluir 1 / 1.000 y 200 l se sembraron en bien de cubreobjetos de cámara y se dejó que se unieran durante 3-4 horas. Después de esto, los medios de comunicación se elimina y se reemplaza con medio fresco. Las biopelículas se dejaron crecer durante el tiempo deseado. Media, productos exógenos o antibióticos se pueden añadir a las biopelículas. Después del crecimiento, se quita los medios de comunicación, las biopelículas se tiñen y se realiza la imagen confocal.ge.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas de desarrollo del biofilm después de la exposición a los filtrados de esputo. (A) Imágenes representativas de complejo Burkholderia cepacia (BCC) aislados clínicos siguientes 48 h de crecimiento en cubreobjetos de cámara con medio solo (paneles superiores) o en presencia de 10 filtrados% de esputo (paneles inferiores), seguido por tinción con kit biofilm viabilidad. 1 unidad de la escala representan 19,68 micras. (B - C) Espesor medio de los aislados (B) y muertas: proporción en vivo (C) de múltiples imágenes de BCC aislados que han crecido durante 48 horas en cámaras de diapositivas en ausencia (barras blancas) o presencia (barras negras) del esputo filtrados. Cada barra representa la media de 45 imágenes trazadacon el error estándar de la media. ** P <0,001 en comparación con el control (medio solo) mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Figura adaptada de Kennedy et al. 16 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes representativas de tratamiento antibiótico en biofilms expuestos a filtrado de esputo. (A) Imágenes de aislados clínicos de Burkholderia vietnamiensis tras 48 h de crecimiento en cubreobjetos de cámara con medio solo (izquierda) o en presencia de 10% de esputo filtrados (derecha) con o sin 1.000 mg / m de tobramicina. Las biopelículas se desarrollaron durante 24 h en medio solo o medio suplementado con 10% (v / v) de esputo filtrados. Después de 24 horas, se retiró el medio y se sustituyó por mediun (+/- esputo) que contiene antibióticos. 1 unidad de la escala representan 19,68 micras. (B - C) Espesor medio de los aislados (B) y muertas: proporción en vivo (C) de múltiples imágenes (n = 9) de B. vietnamiensis aislados que han crecido durante 48 horas en cámaras de diapositivas en la ausencia o presencia de esputo filtrados. Cada barra representa la media de 45 imágenes trazados con el error estándar de la media. ** P <0,001 en comparación con el control (0 g / ml) mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Figura adaptada de Kennedy et al. 16 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los métodos descritos en este documento permiten la visualización de las biopelículas bacterianas cultivadas en la presencia de productos exógenos. No es sorprendente que la producción de los exoproductos es de importancia cuando se utiliza este tipo de sistema. Por ejemplo, ditiotreitol (DTT), se utiliza a menudo en muestras de esputo humanos para ayudar a licuar las muestras. Sin embargo, el efecto de la TDT solo puede disminuir el desarrollo de biopelículas y la viabilidad (datos no mostrados). Por lo tanto, los controles adecuados para todas las condiciones son necesarias. Además, la adición de productos de esputo humanos crea variabilidad inherente en el experimento debido al hecho de que el esputo de cada paciente tiene un microbioma único. Para ajustar esto, hemos utilizado muestras de esputo agrupados para evitar resultados específicos del paciente. Además, la elección del medio de comunicación adecuado es importante cuando se utiliza cualquier sistema modelo. Se recomienda a los medios de comunicación estándar para la formación de biopelículas del organismo previsto para la configuración inicial del sistema. Si el objetivo del experimento es identify cómo los productos exógenos están afectando la formación de biopelículas, se sugiere un nutriente rich media que proporciona una adecuada formación de biopelículas. Esto permitirá que la nutrición suficiente para el crecimiento, mientras que la determinación de cómo los factores exógenos pueden afectar a la biopelícula. Otros medios, tales como medios mínimos o definidos, se pueden utilizar para ciertas condiciones imitar mejor. Otros medios de comunicación se han utilizado con buenos resultados en este sistema (datos no mostrados). La unión de las biopelículas a la cubreobjetos cámaras es robusto, por muy grande que se debe tener cuidado al retirar / adición de medios o durante las etapas de lavado de las biopelículas para evitar la interrupción de las biopelículas.
El uso de la mancha-muertos viven según el protocolo del fabricante ha dado buenos resultados para el sistema descrito. Una serie de factores puede afectar a la proporción de fluorescencia de las imágenes (incluyendo la absorción de colorante de las bacterias, la densidad relativa de la configuración de la biopelícula y la ganancia del detector), sin embargo, este método debe relacionarse con lo que se observa en la imagens. Otras medidas pueden ser utilizadas para representar la cantidad relativa de biofilm muerto / vivo, tales como la biomasa a partir de las células muertas como una proporción de la biomasa total presente en la biopelícula (como se deriva de COMSTAT). El uso de los recuentos bacterianos para confirmar la viabilidad del biofilm en experimentos repetidos se recomienda confirmar las observaciones visuales de este modelo. Debido a la heterogeneidad inherente de biopelículas, múltiples imágenes de cada cámara y múltiples cámaras se deben utilizar para cada condición en un experimento. Esto se suma al coste y la duración de estos experimentos.
La adquisición de imágenes es importante antes del análisis de los datos de estos experimentos. Se debe tener cuidado para no saturar imágenes, y en la determinación de la configuración de microscopio. Dependiendo del nivel de detalle requerido y el microscopio disponible, un número de diferentes objetivos (10X, 25X, 40X y 63X) se puede utilizar para adquirir imágenes, aunque nos encontramos con que objetivo 25X da mejores imágenes. El espesor de tél pila Z también puede afectar a la calidad general de la imagen y el nivel de detalle. Tener imágenes tomadas cada 0,5-1 micras parece proporcionar imágenes claras en 25X objetivo, manteniendo las imágenes Z-pila en un tamaño que puede ser analizada por COMSTAT en los sistemas de ordenador estándar.
Estos experimentos son más costoso y consume tiempo que otros ensayos de unión, y no se puede hacer en un alto rendimiento manera. En este procedimiento, las bacterias se adhieren a una superficie de borosilicato, que no es un reflejo de una condición in vivo y puede afectar a la formación y el desarrollo de biopelículas. Sin embargo, proporcionan información adicional y pueden generar hipótesis para biofilm mecanismo relacionado con la resistencia a los antibióticos y la respuesta fisiológica a la señal exógena. Si el objetivo del experimento es entender cómo biofilms cambian en respuesta a diferentes factores, en lugar de la identificación de compuestos anti-biopelícula usando métodos de alto rendimiento, por ejemplo, la información adicional obtenida usando tsu técnica hace que el método de mérito. Así, el método actual es un avance significativo respecto a los ensayos de unión limitadas anteriores, tales como el ensayo de cristal violeta, que es más comúnmente utilizado para estudiar las biopelículas.
Los pasos críticos a este procedimiento incluyen: 1) Asegurar el procesamiento oportuno de las muestras de esputo para evitar la degradación; 2) Ser amable con los cambios medios en las biopelículas para evitar la interrupción de la biopelícula y 3) Hacer mediciones repetidas de imágenes biopelícula para asegurar una representación exacta del espesor de la película biológica debido a la heterogeneidad de la formación de biopelículas.
Una vez que el sistema está puesta a punto para una especie bacteriana dada, se puede probar un número de diferentes condiciones, incluyendo los efectos de factores exógenos en varios aislados clínicos. Este sistema ha sido utilizado para estudiar el efecto de los antibióticos en biofilms expuesto a esputo humano 16 y comparar los aislados clínicos de alta resistencia y resistencia intermedia. 17 Las modificaciones a la cubreobjetos cámaras, tales como el recubrimiento de la parte inferior con mucina o colágeno micro-andamio (por ejemplo, puracol), pueden extenderse aún más la gama de experimentos posibles. Puede ser posible adaptar este sistema para estudiar las interacciones directas, tales como las que existen entre las células epiteliales y bacterias, o entre diferentes especies bacterianas. Esta es una expansión del modelo descrito por Jurcisek et al. 20 El método utiliza el crecimiento de la cámara de deslizamiento similar a la descrita aquí y utiliza formalina para fijar biopelículas antes de la visualización. Por otra parte, en este método visualizamos biopelículas inmediatamente después de la tinción y no utilizar un fijador. Además, añadimos factores exógenos para poner a prueba el efecto de los antibióticos sobre las biopelículas. Por tanto, este modelo tiene el potencial de promover considerablemente nuestra comprensión de biopelículas bacterianas en la enfermedad humana.
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Disclosures
Ninguna.
Acknowledgments
TB reconoce una beca de investigación de la fibrosis quística Canadá.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
References
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