Artigo de método

Expansão Nanopatterned Substratos usar a técnica do ponto de Nanotopographical modulação do comportamento celular

DOI:

10.3791/54840

⸱

8 de dezembro de 2016

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University

Neste artigo

Resumo

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Um protocolo para produzir uma grande área de substrato nanopadronizado a partir de pequenos moldes nanopadronizados para estudo da modulação nanotopográfica do comportamento celular é apresentado.

Resumo

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A nanotopografia de substrato demonstrou ser um potente modulador do fenótipo e função celular. Para dissecar a modulação nanotopográfica do comportamento celular, uma grande área de substrato nanopadronizado é desejável para que células suficientes possam ser cultivadas na nanotopografia para análises bioquímicas e de biologia molecular subsequentes. No entanto, as técnicas atuais de nanofabricação têm limitações para gerar nanopadrões altamente definidos em uma grande área. Aqui, apresentamos um método para expandir substratos nanopadronizados de um nanopadrão pequeno e altamente definido para uma grande área usando a técnica de ponto. O método combina várias técnicas, envolvendo litografia macia para replicar moldes de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) de um molde bem definido, técnica de ponto para montar vários moldes PDMS em um único molde grande e nanoimpressão para gerar um molde mestre em substratos de poliestireno (PS). Com o molde mestre PS, produzimos substratos de trabalho PDMS e demonstramos a modulação nanotopográfica do espalhamento celular. Este método fornece uma avenida simples, acessível contudo versátil para gerar nanopatterns poço-definidos sobre grandes áreas, e é estendido potencialmente para criar dispositivos do micro/nanoscale com componentes híbridos.

Introdução

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Várias descobertas recentes revelam que a nanotopografia de substrato tem influência pronunciada no comportamento celular, desde a adesão, espalhamento e migração celular, até a proliferação e diferenciação1-6. Por exemplo, um tamanho celular menor e menor taxa de proliferação foram observados em células cultivadas em nanogrades profundas, levando até mesmo à apoptose, embora o alinhamento, alongamento e migração celular tenham sido aumentados, em comparação com os controles planos2,7-10. Além disso, a nanotopografia demonstrou facilitar a diferenciação de células-tronco em certas linhagens, como neurônio2,11,12, músculo13 e osso3,4. Além disso, devido às crescentes preocupações com a toxicidade dos nanomateriais projetados14,15, é necessário incorporar a nanotopografia em modelos in vitro fisiologicamente relevantes para uma avaliação precisa do risco dos nanomateriais. Para realizar as análises bioquímicas e de biologia molecular, são necessárias células suficientes para serem cultivadas em uma grande área de substrato nanopadronizado. No entanto, as técnicas convencionais de nanofabricação têm limitações para gerar nanopadrões altamente definidos em uma grande área.

A automontagem, incluindo litografia coloidal16 e desmistura de polímeros17, pode gerar prontamente nanoestruturas de grande área a baixos custos. Como a automontagem depende de interações entre os elementos de montagem, como partículas coloidais e macromoléculas, e possíveis interações entre esses elementos e o substrato, não pode ser um método autônomo de produção de nanoestruturas com posicionamento espacial preciso e formas arbitrárias18. A alta densidade de defeitos acompanhada também é uma desvantagem. O controle espacial preciso dos nanopadrões pode ser alcançado empregando a automontagem modelada, que usa abordagens litográficas de cima para baixo para fornecer o modelo topográfico e / ou químico para guiar a montagem de baixo para cima dos elementos de montagem19-21. Técnicas alternativas de nanofabricação, como litografia step-and-flash22 e litografia de nanoimpressão rolo a rolo23 foram desenvolvidas, mas têm uso limitado devido ao seu processo sofisticado ou à necessidade de equipamentos especializados. No entanto, um molde ou um molde mestre com padrões definidos em nanoescala é necessário para técnicas de nanofabricação modeladas ou alternativas.

Tais modelos e moldes mestres são gerados convencionalmente usando litografia de feixe de elétrons, íons ou fótons focalizada. Por exemplo, a litografia por feixe de elétrons (EBL)24 e a litografia por feixe de íons focalizados25 podem gerar padrões definidos com uma resolução abaixo de 5 nm. A litografia de dois fótons demonstrou um tamanho de característica tão pequeno quanto 30 nm26. Embora as técnicas de litografia de feixe focalizado permitam a geração de estruturas em nanoescala bem definidas, o investimento de capital e o processo demorado e caro restringem seu uso generalizado em pesquisas acadêmicas27. Portanto, é altamente desejável desenvolver técnicas facilitadoras, porém acessíveis, para produzir uma grande área de superfícies nanopadronizadas com alta fidelidade.

Relatamos uma técnica de ponto simples e econômica para gerar uma grande área de superfície nanopadronizada a partir de um pequeno molde bem definido28. Este protocolo fornece procedimento passo a passo desde a replicação de moldes de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) usando um padrão escrito por EBL, até a montagem de vários moldes PDMS em um único molde grande, até a geração de um molde mestre em substratos poliméricos, como poliestireno (PS), até a produção de substratos de trabalho. Com os substratos nanopadronizados expandidos, demonstramos a modulação nanotopográfica do espalhamento celular.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. A replicação de PDMS moldes a partir de um molde EBL

  1. Fabricar molde de silicone 29
    1. revestimento da rotação de 200 ul de polimetil metacrilato (PMMA) solução sobre um substrato 1 x 1 cm de silício (Si) a 2.500 rpm durante 1 minuto para formar uma película fina.
    2. Cozer a película de PMMA sobre o substrato de Si a 180 ° C durante 2 min.
    3. Escreva o nanopattern projetado no filme PMMA usando um feixe de electrões focado em uma dose de 300 uC / cm 2 de área.
    4. Desenvolver o nanopattern PMMA no desenvolvedor para 80 seg.
    5. Depositar o nanopattern de PMMA com uma camada de níquel de 50 nm de espessura usando um evaporador de feixe de electrões a uma tensão de 10 kV, corrente de emissão de 0,5 mA com uma velocidade de deposição de 0,5 Ã / seg saída.
    6. Levantar a parte de PMMA em 20 ml removedor a 80 ° C durante 20 min.
    7. etch iónico reactivo (RIE) a nanopattern para o substrato de Si para obter um molde de Si a profundidade desejada.
      NOTA: mistura gasosa de tetrafluoromethane (FC 4) / oxigénio (O2) (90% / 10%) com uma potência de plasma indutivamente acoplado (ICP) de 400 W de potência e RIE de 150 W é usado para gravar Si substrato a uma profundidade de 560 nm.
  2. molde silanizar Si
    1. Coloque uma lamela de vidro e o molde Si em um 100 milímetros PS placa de Petri e transferi-los num exsicador de vidro localizada em um exaustor.
    2. Gota de 10 ul de 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane sobre a lamela.
      Cuidado: 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane pode causar corrosão da pele e lesões oculares graves. Use equipamento de proteção pessoal adequado (PPE).
    3. Cobrir a placa de Petri parcialmente.
    4. Manter o exsicador sob vácuo durante 5 horas num exaustor de fumos para completar a silanização do molde Si.
  3. Prepare PDMS pré-polímero
    1. Pesar 10 g de resina PDMS e 1,05 g agente de cura em um barco de pesagem descartáveis.
    2. Misturar o pré-polímero de PDMS cuidadosamente usando uma colher de plástico.
    3. Desgasificar o pré-polímero de PDMS-se num exsicador de plástico sob vácuo durante cerca de 20 minutos até uma mistura clara é observado.
  4. Replicar moldes PDMS
    1. Coloque o molde Si silanizada em uma placa de Petri de 60 milímetros.
    2. Verter o pré-polímero de PDMS no molde Si na placa de Petri.
    3. Coloque a placa de Petri num exsicador de plástico e degas por cerca de 10 min até que todas as bolhas desapareçam.
    4. Transferir a placa de Petri a uma placa de aquecimento e cura do pré-polímero de PDMS, a 70 ° C durante 4 h.
    5. Retire o molde PDMS do molde Si com cuidado usando uma pinça.
      NOTA: moldes PDMS pode ser armazenado em condições ambientes durante até uma semana. Após a cura, há algumas moléculas de PDMS não reticuladas resina e agente de endurecimento residual nos moldes 30 PDMS. As moléculas de baixo peso molecular vai gradualmente se difundem para fora e se acumulam na superfície ao longo do tempo. Isto afecta as propriedades topográficas e mecânicas da superfície do PDMS 31. o diffusão não é significativa dentro de uma semana.

2. Costura de PDMS Moldes em um grande, Mold Individual

  1. Prepare moldes múltiplos PDMS repetindo o passo 1.4.
    NOTA: Pesar mesma quantidade de mistura de PDMS de cada vez para obter moldes de PDMS mesma espessura.
  2. Determinar a orientação de anisotrópicos PDMS nanopatterns tais como nanogratings sob um microscópio óptico e marcá-lo na parte traseira dos moldes PDMS com uma caneta marcadora.
    NOTA: Não é necessário marcar a orientação de nanotopografia isotrópica, tais como nanopillars.
  3. Limpar um substrato de Si com etanol em um exaustor e seque-o com ar comprimido.
  4. Aparar as áreas unpatterned de cada molde PDMS com uma lâmina.
    NOTA: Para os moldes de PDMS que serão colocados na periferia do molde costurado, apenas as áreas unpatterned em contacto com os outros deve ser aparada.
  5. Coloque o molde PDMS aparadas com a nanopattern face para baixo sobreo lado do espelho do substrato de Si e alinhe outros moldes perto mas não tocando o molde circundante (s).
  6. Prepara-se uma camada adesiva de PDMS
    1. Fundido um pré-polímero de PDMS g desgaseificada (PDMS resina e relação de agente de cura: 10: 1,05) numa lâmina de vidro limpo (7,5 cm x 2,5 cm) para formar uma camada de espessura de 0,5 mm.
    2. Cozer a camada de PDMS, a 100 ° C numa placa de aquecimento durante 3-5 minutos. Utilize uma agulha para tocar na camada e assegurar que a camada é parcialmente mas não completamente curada.
      NOTA: PDMS parcialmente curada não pode fluir como pré-polímero de PDMS não curado, mas é pegajoso em comparação com PDMS curados.
  7. Coloque a camada de PDMS na parte traseira de moldes PDMS alinhados e rapidamente inverter esta montagem e transferi-lo para a placa de aquecimento.
  8. Aplicar uma força de compressão (5 kPa) usando um bloco metálico na parte superior do conjunto para assegurar um bom contacto entre a camada adesiva e a parte traseira de PDMS de moldes de PDMS, e curar o PDMS camada de adesivo a 100 ° C durante 1 h.
    NOTA: Ajuste cuidadosamente a posição do bloco de metal para evitar a inclinação da montagem.
  9. Remova o bloco de metal e retire a, molde PDMS costurado single do substrato de Si.

3. Geração de um molde mestre no PS Substratos

Nota: O molde PDMS costurado imobilizado sobre uma lâmina de vidro pode ser usado para gerar um molde mestre em uma placa de PS ou uma película fina de PS, a partir do qual podem ser produzidos substratos nanopatterned de trabalho.

  1. Gerar um molde mestre em uma placa PS
    1. Prepare uma placa PS
      1. Secam-se os peletes de PS em uma estufa de vácuo a 80 ° C durante dois dias.
      2. Pré-aqueça uma máquina de imprensa a 230 ° C.
      3. Montar uma placa de alumínio, uma folha de politetrafluoretileno (PTFE) e o espaçador de alumínio em uma ordem de baixo para cima.
      4. Carregar 3,5 g de PS em pelotas o espaçador de alumínio com uma abertura quadrada de 3 cm (L) x 3 cm (W) x 0,3 cm (H).
        NOTA: O espaçador é de aproximadamente 0.1 cm mais espessos que os moldes de PDMS, e, assim, o substrato final nanopatterned PS é cerca de 0,1 cm de espessura.
      5. Coloque outra folha de PTFE e, em seguida, uma outra placa de alumínio no espaçador de alumínio.
      6. Coloque o conjunto na máquina da imprensa.
      7. Pré-aqueça os peletes Ps a 230 ° C durante 30 min.
      8. Aplicar uma pressão de compressão (0,1 MPa) no conjunto durante 5 minutos.
      9. Solte a pressão e, em seguida, voltar a aplicar uma pressão de compressão de 0,5 MPa na montagem.
      10. Repita o passo 3.1.1.9, com um aumento de pressão de 0,5 MPa até à pressão de 1,5 MPa desejável é atingida.
      11. Desligue o aquecedor da máquina da imprensa e esfriá-la abaixo de 70 ° C a uma pressão constante de 1,5 MPa.
      12. Tomar o conjunto para fora e armazenar a placa de PS num forno de vácuo a 80 ° C para impedir a humidade de entrar novamente a placa PS.
    2. Nanoimpressão o molde PDMS costurado na placa PS
      1. Coloque a placa PS em um espaçador de alumíniodefinido em uma de 3 polegadas lâmina de silício.
        NOTA: As dimensões interiores do espaçador são as mesmas que as da placa de PS de modo que a placa PS cabe para a direita no espaçador.
      2. Aquecer a placa PS numa placa de aquecimento a 250 ° C durante 30 min.
      3. Coloque o molde PDMS costurado com nanopatterns face para baixo sobre a placa PS fundido.
        Nota: Um dos lados do molde PDMS é posto em contacto com a superfície da placa de PS em primeiro lugar e o outro lado é gradualmente reduzido em contacto com a superfície de PS para evitar a formação de bolhas de ar na interface.
        Cuidado: A superfície da placa de aquecimento é quente. Desgaste thermogloves durante o processo de nanoimpressão.
      4. Coloque uma placa de alumínio na lâmina de vidro do molde PDMS costurado.
      5. Aplicar uma pressão de compressão (12,5 kPa) usando blocos de metal sobre a chapa de alumínio e esperar durante 3 min.
        NOTA: Certifique-se de que a placa de alumínio não está inclinado.
      6. Levante e substituir o bloco de metal da placa de alumínio e increase a pressão de compressão a 25 kPa.
      7. Repita o passo 3.1.2.6 com a pressão aumentada para 50 kPa.
        NOTA: Este passo é remover o ar aprisionado entre o molde e a placa de PDMS PS.
      8. Manter a temperatura da placa de aquecimento entre 240 e 250 ° C, sob a pressão constante de 50 kPa durante 15 minutos.
      9. Desligue o fogão e esfriar a instalação inteira.
        NOTA: Um ventilador pode ser usado para acelerar o processo de resfriamento.
      10. Remover os blocos de metal após a temperatura esteja abaixo de 50 ° C, e cuidadosamente descascar para fora do molde PDMS costurada a partir da placa PS.
        NOTA: O substrato PS tem os nanopatterns reversa e pode ser utilizado como um molde mestre para produzir substratos de PDMS de trabalho.
  2. Gerar um molde mestre em uma película fina PS
    1. Prepara-se uma película fina PS
      1. Dissolve-se 1 g de PS em 10 mL de tolueno num exaustor de fumos.
        Atenção: O tolueno pode causar irritatio pelen e lesões oculares graves, e pode causar dano aos órgãos através da exposição repetida ou prolongada. Utilizar EPI adequado.
      2. Spin-coat solução PS 1 ml em um 2-em wafer a 2.500 rpm por 1 min para formar ~ 1 mm de espessura PS película fina.
      3. Evaporar o tolueno a partir do filme, definindo o filme PS no bolacha de Si num exaustor de fumos durante 3 dias.
      4. Recozer a película fina PS num forno de vácuo a 80 ° C durante a noite.
    2. Nanoimpressão o molde PDMS em uma película fina PS
      1. Coloque o molde PDMS costurado com nanotopografia face para baixo sobre a película fina PS, que é definido numa placa de aquecimento.
      2. Aplicar uma pressão de compressão de 12 kPa no molde PDMS usando blocos de metal do lado do vidro do molde PDMS.
      3. Aumentar a temperatura da placa de aquecimento a 180 ° C e mantê-lo durante 15 min.
        Cuidado: A película fundida PS pode funcionar como um lubrificante. Preste atenção para evitar que os blocos de metal de deslizar para fora.
      4. Desligue a placa de aquecimentoe arrefecer a instalação inteira.
        NOTA: Um ventilador pode ser usado para acelerar o processo de resfriamento.
      5. Remover os blocos de metal após a temperatura cai abaixo de 50 ° C, e cuidadosamente descascar para fora do molde PDMS cosido a partir do filme de PS.
        NOTA: O filme nanopatterned PS vai servir como um molde mestre para produzir substratos PDMS de trabalho.

4. Nanotopographical modulação do comportamento celular

Nota: células epiteliais humanas são cultivadas nas nanotopographies representativos para demonstrar modulação nanotopographical da célula se espalhando.

  1. Fundido substratos de trabalho PDMS do molde mestre gerado a partir de qualquer Passo 3.1 ou 3.2, dependendo da aplicação.
  2. Usando um arco de aço oco perfurador, cortar os substratos PDMS nanopatterned em discos para se ajustar a configuração de uma placa multi-poço específico (por exemplo, placa, de 24 poços).
  3. Utilize uma pinça para colocar os discos PDMS nas cavidades ófa placa multi-poços.
  4. Esterilizar os substratos PDMS usando 70% de etanol e, em seguida, a exposição de UV, durante 30 minutos cada.
  5. Lavar o PDMS substratos com 1x de fosfato estéril tamponado salino (PBS) três vezes.
  6. Revestir os substratos PDMS com proteínas de matriz extracelular (por exemplo, 20 ug / ml de fibronectina) durante 30 min à temperatura ambiente.
  7. Lavar os substratos PDMS três vezes com PBS estéril, cada uma durante 5 minutos.
  8. Suspender A549 de células de cancro de pulmão humano em meio de Eagle modificado por Dulbecco com soro bovino fetal a 10% e contar as células utilizando um hemocitómetro.
  9. Placa as células a uma densidade de sementeira de 2.000 células / cm2 sobre os substratos e cultura PDMS-los a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO 2 durante um dia.
  10. Lavam-se as células com PBS três vezes.
  11. Fixar as células em uma mistura de paraformaldeído a 4% e 2% de glutaraldeído em PBS durante 4 h e desidratar as células usando um CO 2 PO críticasecador de int para a digitalização de observação microscópica electrónica 29.
    Atenção: O paraformaldeído e glutaraldeído pode causar queimaduras na pele e lesões oculares graves. Operar em uma capa química e utilizar EPI adequado.

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Resultados

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A técnica do ponto pode gerar uma grande área de substratos nanopatterned com alta fidelidade. A Figura 1a e 1b exibir a grande área de nanopatterns transferidos a partir do molde PDMS costurada a placa PS e PS película fina sobre um substrato de Si, respectivamente. A comparação entre o molde original é EBL-escrita (Figura 1C) e o PDMS finais de substrato de trabalho (Figura 1D), confirma que os nanopatterns EBL-escrita...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós apresentamos um método simples, acessível, mas versátil para gerar uma grande área de substrato nanopatterned. Para expandir fielmente nanopatterns altamente definidos, grande atenção deve ser dada às várias etapas críticas. O primeiro é para aparar as PDMS vários moldes. unpatterned áreas dos moldes PDMS precisa ser removido. Além disso, as paredes laterais dos moldes deve ser cortada verticalmente perfeito quanto possível para minimizar as diferenças entre os moldes. Colectivamente, a porção de áreas unpatterned n...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi parcialmente apoiado pela NSF CBET 1227766, NSF CBET 1511759 e Byars-Tarnay Endowment. Reconhecemos com gratidão o uso das Instalações de Pesquisa Compartilhada da West Virginia University, que são apoiadas, em parte, pela NSF EPS-1003907.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
JEOL de emissão de campo SEMJEOLJSM-7600FEBL
Kurt J. LeskerModelo: LAB 18 evaporador de feixe eletrônicodeposição de níquel
Trion Minilock III ICP/RIETecnologia TrionModelo: Minilock-phantom III
Máquina de prensaPHI Prensa HidráulicaMolde: SQ-230H
Revestidor giratórioLaurell TecnologiasModle: WS-400A-6NPP-LITE
CO2 secador críticoTousimisModle: Autosamdri-815
Wafer de silícioUniversity Wafer1080
Placas de alumínioMcMaster-carr9057K123
Folhas de teflonMcMaster-carr8711K92
Placa de Petri de 100 mmFALCON
Placa de Petri de 60 mmFALCON353004
Lamínula de vidroFisher Scientific12-542-B
Corrediça de vidroFisher Scientific12-550-34
Barcos de pesagem descartáveisFisher Scientific13-735-743
Dessecador de vidroFisher Scientific02-913-360
Dessecador de plásticoBel-Art ProductsF42025-000
Placa de aquecimentoFisher Scientific1110049SH
Pinça Ted Pella, inc.5726
LâminaFisher ScientificS17302
Blocos de metalMcMaster-carr
PunchBrettuns Village Leather Craft Supplies Archpunch
Poli (metacrilato de metila)MicroChem495 PMMA A4
PDMSDow CorningSylgard 184 kit
PoliestirenoDow ChemicalStyron 685D
1H,1H,2H,2H-perfluorooctilmetildiclorossilanoOakwood Chemical7142
DesenvolvedorMicroChemMIBK/IPA na proporção
RemovedorMicroChemPG Etanol Fisher
ScientificBP2818500
ToluenoFisher ScientificT324-500
Solução salina tamponada com fosfatoSigma AldrichD8537
Dulbecco' s meio de águia modificadoSigma AldrichD5796
Soro fetal bovinoAtlanta BiologicalsS11550
ParaformaldeídoMicroscopia Eletrônica Ciência15712-S
Glutaraldeído Fisher ChemicalG151-1
FibronectinaCorning356008
A549 célulasATCCATCC CCL-185
Evaporador de feixe E 3530031: 3

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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