Summary
在这里，我们提出了针对艾滋病病毒枚举和表征猕猴CD8 + T细胞的优化协议。本文不仅对HIV免疫学领域，而且也适用于的 CD8 + T细胞应答已知影响疾病结果的生物医学研究的其它领域是有用的。
Abstract
肽主要组织相容性复合体I类（的pMHC-I）四聚体一直一个宝贵的工具来研究CD8 + T细胞反应。因为这些试剂直接结合到T细胞受体CD8 + T淋巴细胞的表面上，荧光染料标记的pMHC-I四聚体使抗原的精确检测（银）特异性CD8 + T细胞，而无需在体外重新-stimulation。此外，当多色组合流式细胞仪，的pMHC-I四聚体染色可以揭示抗原特异性CD8 + T细胞的重要方面，包括分化阶段，记忆表型，和激活状态。这些类型的分析已经在HIV免疫学领域特别有用的 CD8 + T细胞可影响发展为艾滋病。猴免疫缺陷病毒的猕猴（SIV）的实验感染提供了一个宝贵的工具来研究针对艾滋病病毒的细胞免疫功能。其结果是，相当大的逐行SS已经在该动物模型定义和表征T细胞应答已取得。在这里，我们提出了一个优化的协议用于通过的pMHC-I四聚体染色猕猴列举SIV-特异性CD8 + T细胞。我们的测定法允许每测试二的pMHC-I四聚体+ CD8 + T细胞群，这可能是用于跟踪由疫苗接种或SIV感染产生SIV-特异性CD8 + T细胞应答有用的同时定量和存储器表型。考虑在生物医学研究非人灵长类动物的相关性，这种方法适用于多种疾病设定学习的 CD8 + T细胞应答。
Introduction
CD8 + T细胞包含适应性免疫系统的重要组成部分，因为它们参与肿瘤免疫监视和向细胞内病原体1根除。简单来说，CD8 + T细胞表达特异性识别肽-主要组织相容性复合体I类（的pMHC-I）中的T细胞受体（TCR）的分子存在于宿主细胞的质膜。因为这些肽是从内源性合成的蛋白的水解产生的，细胞表面的pMHC-I复合物提供了一个窗口，进入细胞内环境。在病毒感染，例如，感染的细胞将显示含有病毒蛋白衍生肽，可以作为配体被巡逻的CD8 + T细胞中表达的TCR的MHC-I类分子。在一个特定的病毒特异性CD8 + T细胞遇到感染细胞呈递其的pMHC-1配体的情况下，T细胞受体接合将导致CD8 + T细胞的激活和大招三方共同导致靶细胞裂解。鉴于这些TCR /的pMHC-I相互作用的关键特性，确定了震级，特异性和响应CD8 + T细胞表型往往能揭示人类疾病的重要线索。
直到20世纪90年代初，抗原特异性CD8 + T细胞的量化依靠技术要求有限稀释法（LDA）2,3-。不仅在LDA需要数天才能完成，因此也未能检测缺乏增殖潜能的细胞。其结果是，在LDA大大低估抗原（抗原）特异性的 CD8 +参与免疫应答的T细胞的实际频率。虽然ELISPOT和细胞内细胞因子染色测定的发展极大地提高测量细胞免疫的能力，这些方法仍然需要在体外刺激用于定量抗原特异性T细胞4。但直到1996年的奥特曼，戴维斯和科尔eagues发表了具有里程碑意义的文章报告的pMHC-I技术的四聚体5的发展。临界该技术的成功是的pMHC-I类分子，其延伸的TCR /的pMHC-Ⅰ相互作用的半衰期，从而减少的pMHC-I四聚体中流式细胞测定法的洗涤步骤脱落的概率的多聚化。的pMHC-I四聚体在上述测定法的主要优点是能够精确地直接离体检测抗原特异性CD8 + T细胞，而无需在体外再刺激的能力。此外，具有多色彩的pMHC-I四聚体染色的组合流式细胞仪已经允许分化阶段，记忆表型，和Ag特异性CD8 + T-细胞2-4的激活状态的详细分析。在最近对通过表征的 CD8 + T细胞所有组成成分的技术进步的光的pMHC-Ⅰ多聚体染色6，应用FO广度R此方法很可能会继续扩大。
在生物医学研究领域很少有比艾滋病病毒免疫学7领域受益更多来自的pMHC-I四聚体染色。虽然CD8 + T细胞曾与由奥特曼，戴维斯和同事8,9出版时HIV病毒血症的初步控制了时间相关的，在随后的几年中使用的pMHC-I四聚体的显著扩大了我们的理解的HIV特异性CD8 + T细胞应答。例如，的pMHC-I四聚体染色帮助确认病毒特异性CD8 + T细胞反应在大多数HIV感染者10-12强劲的大小。这种方法还促进艾滋病毒和SIV特异性CD8 + T细胞应答的通过与在不存在的被称为“精英控制”抗逆转录病毒治疗，这种现象的病毒复制的自发控制相关的MHC-I类分子限制的表征
猕猴（ 猕猴 ）的实验SIV感染仍然是防治艾滋病毒/艾滋病18,19评估免疫干预的最佳动物模型。在过去的25年中，实质性的进展已在SIV-特异性CD8 + T细胞在此猴类的鉴定和表征制成，包括MHC-I等位基因的发现和肽结合基序13,20-27的定义。其结果是，的pMHC-I四聚体已经开发了用于SIV-特异性CD8 + T细胞的分析在这种动物模型28的反应。大多数这些试剂是由四猕猴MHC-I等位基因的基因产物： 马目-A1 * 001，马目-A1 * 002：01，马目-B * 008：01，和马目-B * 017：01。值得注意的是，猕猴不发表MHC-C座29。绝大多数在本实验中使用的的pMHC-I四聚体均在埃默里大学美国国立卫生研究院四聚体核心工厂生产。然而，一些这些试剂，包括结合到免疫的Gag CM9表位马目-A1 * 001四聚体，只能从由于许可协议商业来源获得。四个猕猴等位基因使用的pMHC-I四聚体以上列出的，我们已经成功地枚举CD8 + T细胞对共21 SIV抗原表位（ 表1），这是诱导疫苗接种或主SIV感染30,31（马丁等人 ，未发表意见）。
本稿件提供优化的pMHC-I四聚体染色方案，用于确定在恒河猴SIV-特异性CD8 + T细胞的频率和存储器的表型。为了降低TCR内化，从而改善的pMHC-I四聚体染色32;该测定用择孵育30分钟与蛋白激酶抑制剂（这里，达沙替尼使用PKI）的开始。 01四聚体：如下所述，使用马目-B * 017时这种处理是非常有用的。还提供了关于如何标记与荧光标记的pMHC-I四聚体和单克隆抗体（mAb）的细胞的指示。该协议还包括用于将细胞溶解相关分子颗粒酶B（GZM B）的细胞内检测一个细胞透步骤。抗CD3的mAb在此步骤中加入，以及改进这种TCR信号分子的检测。作为参考，在这种染色面板使用的所有荧光被列出。
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Protocol
在这个手稿中使用的外周血单个核细胞（PBMC）样品从设在威斯康星州国家灵长类动物研究中心的印度猕猴获得。这些动物在威斯康星研究生院动物护理和使用委员会33的大学批准的方案下，根据Weatherall报告进行照顾。麻醉下进行所有动物的程序并作出一切努力，以减少潜在的痛苦。
1.治疗PKI
注意：这是可选的，但建议马牧-B * 017：01四聚体。查看结果和讨论部分 。
- 重悬的PBMC在1.6×10 7个细胞/ ml的浓度R10培养基。
- 加入50μl该细胞悬浮液，以流式细胞术管相应的流量。加入50μl的PKI的100nM的解决方案，以每一管。
- 涡每管。孵育在37℃下30分钟。由此结束步骤，每个管应具有100μl包含8.0×10 5个 PBMC和PKI的50nM的细胞悬浮液。
- 继续执行的pMHC-I四聚体染色的步骤。
2.染色用荧光染料标记的pMHC-I四聚体
- 准备之前的pMHC-I四聚体预混，离心机在20000 XG至少15分钟的pMHC-I四管在4℃。这一步骤的目的是，以沉淀蛋白质的聚集体的的pMHC-I四聚体的解决方案，可能会增加背景染色。一旦离心步骤完成后，避免其中蛋白质聚集体将积累在管的底部移液。
- 准备足够的pMHC-I四预混染色所有的实验管。制备的过量的此主混合物的总体积的15％至帐户移液误差。
- 淡化色斑缓冲（ 如辉煌染色缓冲）的pMHC-I四聚体，使25微升的pMHC-I四聚体主结构是ADDEd可每次试验。
- 标签PBMC每个测试二的pMHC-I四聚体;一种共轭至别藻蓝蛋白（APC），而另一对亮紫（BV）421。
- 添加8.0×10 5个 PBMC至流式细胞管相应的流量在100μl的终体积。如果细胞进行上述的PKI的治疗，他们应已再悬浮于100微升在此步骤。
- 加入25微升的pMHC-I四聚体预混到流式细胞仪管相应的流量。通过此步骤结束时，在每个管中的最终体积应为125微升。
- 涡流每个管以匀化细胞悬浮液。
- 孵育在黑暗中在室温下45分钟。 45分钟孵化期间，准备表面染色单克隆抗体的鸡尾酒。
3.表面染色
- 准备足够的单克隆抗体预混染色所有的实验管。制备的过量的此主混合物的总体积的15％，占移液误差。
- 调整主结构与染色缓冲音量，使50微升的每个测试增加。
- 对于非CD8 + T细胞的适当的排斥和存储器的子集的划分，使用滴定针对在表面染色主混合物以下分子的单克隆抗体的量。
注：缀合到各单克隆抗体的荧光染料提供作为参考：CD14 BV 510，CD16 BV 510，CD20 BV 510，CD8αBV 785，CD28 PE Cy7的，并且CCR7 FITC。需要注意的是对CD14，CD16，和CD20的单克隆抗体缀合到相同的荧光染料（ 即，BV 510），因为它们将被包括在“转储”门。 - 包括在表面染色预混辨别死细胞可修复的染料[即胺活性染料（ARD）。确保ARD试剂缀合到荧光具有类似的发射光谱如在“转储”门使用的。在这种情况下，使用ARD水族。
- 加入50微升染色预混在3.1-3.4描述的流式细胞仪管相应的流量。通过此步骤结束时，在每个管中的最终体积应为175微升。
- 涡每管。孵育在黑暗中在室温下25分钟。
- 洗涤用洗涤缓冲液细胞（含牛血清白蛋白的0.1％和0.45克/升NaN 3的PBS溶液）。
注意：叠氮化钠是一种有毒物质。暴露在即使微量可引起症状。根据在哪里正在执行这些实验机构的环境健康与安全（EHS）办公室指定的指导方针处理这种物质。 - 离心管在510×g离心5分钟。上清液小心地倒入一个单独的废物容器中。一定不要打扰颗粒。
小心：不要滗洗涤缓冲液上清液成含漂白剂储，因为它可以与存在于洗涤缓冲液中的叠氮化钠反应，并导致在有毒气体34的形成。 Contact EHS的办公室那里正在为如何处置叠氮化钠的指导进行这些实验的机构。 - 倾析后，旋涡振荡细胞保持在每个管中的剩余液体。
4.细胞固定
- 加入250微升2％的多聚甲醛（PFA）溶液的所有管，以固定细胞。
注意：PFA是一种有毒物质。暴露在即使微量可引起症状。根据在哪里正在执行这些实验的机构，由EHS办公室指定的指导方针处理这种物质。- 由于2％PFA溶液必须是等渗的细胞，使用PBS制备该溶液。 2％的PFA溶液的百毫升就足够了多个实验。彻底振荡试管，以防止细胞聚集体的形成的另外2％PFA中后，立即。
- 孵育在黑暗中在4℃下20分钟。
- W¯¯灰细胞通过重复步骤3.7-3.9。一旦该步骤完成后，可以将细胞储存在黑暗中在4℃下24-48小时。在开始的阶段透，彻底涡管。
5.通透细胞
- 加入500μl通透缓冲。振荡试管。
- 孵育在黑暗中在室温下10分钟。
- 通过重复步骤3.7-3.9洗涤细胞。
6.细胞内染色
- 准备足够的单克隆抗体预混染色所有的实验管。
- 调整用PBS体积或使细胞内的mAb主混合物的50微升被每个测试加入染色缓冲液中。
- 在准备6.1和6.2中所述的单克隆抗体主结构采用滴定针对CD3和GZM B.单克隆抗体量
注：通过的pMHC-I四聚体的TCR接合可导致CD3内化，其可以与检测四聚体+ CD3 + CD8的干扰+T细胞，如果抗CD3单克隆抗体被加入到表面染色母液。为了避免这种情况，添加抗CD3单克隆抗体在此阶段，即，将细胞透化之后。缀合到每种mAb的荧光染料列出作为参考：CD3 PerCP经Cy5.5和GZM乙聚乙烯。 - 加入50μl的mAb鸡尾酒到相应的管中。孵育在黑暗中在室温下30分钟。
- 通过重复步骤3.7-3.9洗涤细胞。管子准备在流式细胞仪获得。
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Representative Results
这里所描述的协议已被用来确定在一个马目-A1 * 001 +猕猴的疫苗诱导的，的Gag CM9特异性CD8 + T细胞应答的大小和存储器的表型。对于这种分析，在一个8色流式细胞术染色面板用的APC-缀合马目-A1 * 001 /加格CM9四聚体。 图1A - F显示用于分析数据，这应适用于存在于每个测试两个四聚体门控策略。需要注意的是的pMHC-I四聚体+ CD8 + T细胞群以及以最小的背景（ 图1F和G）分离。记忆CD8 + T细胞在恒河猴可以被分类为基于CD28和CCR7的表面表达三个子集：中央存储器（T CM; CD28 + CCR7 +），过渡存储器（T EM1; CD28 + CCR7-）和效应内存（T EM2; CD28-CCR7-）35。该协议还包括用于GZM B和CD3的细胞内检测一个细胞透步骤。 图1G - 我展示了四聚体+门内记忆亚群和GZM B-表达CD8 + T细胞的划定。
背景染色可以产生在的pMHC-I四聚体标记检测结果不理想。为了避免这种情况，一些预防措施提出了建议。在协议部分所述，包含的pMHC-I四聚体试剂小瓶应始终在20000 XG离心前主混音的准备至少15分钟。这一步骤的目的是，以沉淀任何蛋白质聚集可能在的pMHC-I四聚体溶液。此外，还建议滴定在使用前每种试剂。理想情况下，MHC-I匹配的那个或不含有目的抗原特异性的 CD8 + T细胞群体应与有关的pMHC-I四聚体标记的细胞。此CAÑ由侧用不同量的一新获得的pMHC-I四聚体由SIV幼稚（阴性对照）和SIV感染（阳性对照）猕猴侧染色冷冻保存的PBMC来完成。在图2中 ，例如，1.0微升/ APC的共轭马目-B * 008的试验：01 / Nef的RL10四聚体，得到四聚体阳性和阴性CD8 + T细胞群之间的最佳的分离。最后荧光的选择也可显著影响从的pMHC-I四聚体染色所获得的结果。在这方面，的pMHC-I四聚体缀合变暗分子（ 例如 ，荧光素）应该避免。在我们的经验，缀合到明亮的荧光染料，如PE，APC和BV 421的pMHC-I四聚体，已经取得了最好的结果。
我们注意到，马牧-B * 017：当结合上面提到的明亮荧光01四聚体通常产生朦胧的染色均匀。这种情况的原因低荧光强度尚不完全清楚，但可能包括低亲和力TCR /马牧-B * 017：01相互作用并在四结合36,37快速TCR内化。沿着这些线路，PKI的已显示出抑制CD8 + T细胞32的表面上的TCR内化。其结果是，PKI的可以提高抗原特异性CD8 + T细胞的pMHC-I四聚体染色检测。我们已经证实在我们的实验中这种效果，其中，马目-B的质量* 017：01四聚体染色可通过预处理与PKI的PBMC（ 图3）可以大大改善。奇怪的是，与此PKI预处理没有显著改善这里测试（数据未示出）等的pMHC-I四聚体的染色，这表明马目-B * 017：01限制的CD8 + T细胞可能是在它们的灵敏度独特以PKI治疗。
图1：闸战略和成功的pMHC-I四聚体染色的代表性结果。我们从马目-A1 * 001 +猕猴评估疫苗诱导的Gag CM9特异性CD8 + T-细胞的大小和记忆表型PBMC中。这里，在一个8色流式细胞术染色面板用的APC-缀合马目-A1 * 001 /加格CM9四聚体。 （A - F）门控策略，流式细胞仪分析。首先，在对角聚集汗衫门被与FSC区（FSC-A），然后一边散射高度（SSC-H）与SSC区域绘制前向散射高度（FSC-H）创建（SSC-A; A和B） 。接下来，时间门被创造，其中包括只有那些记录了5 日和90 日在百分的事件。然后将所得的细胞门控的“转储通道”负，CD3 +细胞（C和D）。在这个阶段中，淋巴细胞群是基于它的FSC-A与SSC-A性能划定并随后分析是内CD8 +细胞（E和F）进行。概述的pMHC-I四聚体+细胞（G）之后，存储器表型分析，此门（H）内进行。猕猴记忆T细胞可以分为基于CD28和CCR7的表达三个子集：中央记忆（T CM; CD28 + CCR7 +），过渡存储器（T EM1; CD28 + CCR7-）和效应记忆（T EM2 ; CD28-CCR7-）。本协议还包括粒酶B（GZM B）的四聚体+ CD8 + T细胞（Ⅰ）中表达的细胞内评价用细胞透步骤。在直方图中的阴影区域对应于四聚体+ CD8 + T细胞与同种型匹配对照mAb染色。尽管BV 421结合的四聚体+人口，这是目前在这个染色在图中未示出，相同的选通策略应该被用来进行分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：01 / Nef的RL10四：一个APC标记马牧-B * 008的滴定的代表性结果。 PBMC从两个马牧-B * 008：01+猕猴被用于这个实验：一只动物SIV天真并担任阴性对照，而另一个是SIV感染并作为阳性对照。以确定马目-B的量* 008：01 / Nef的RL10四聚能产生四聚体+和tetramer- CD8 + T细胞之间的最佳的分离，从每只动物的PBMC与所示量的的pMHC-I四聚体试剂的孵育。基于这些结果，1.0微升/测试わ选为最佳量s到在将来测定中使用。用于分析该数据的选通策略在图1中说明。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：01四聚体：在马目-B * 017的荧光强度的PKI治疗的影响。 PKI的抑制剂抑制T细胞受体复合物的内化和由此通过荧光染料标记的pMHC-I四聚体32提高了抗原特异性CD8 + T细胞的检测。 （A - B）从两个马牧-B * PBMC 017：01+猕猴被用于这个实验：一只猴子是SIV天真并担任阴性对照组（A），而其他被感染SIV并担任阳性对照（B）。来自两个动物的PBMC在37℃下在PKI中的50nM的浓度存在下培养用于与APC缀合的马目-B * 017到染色前30分钟：01 / Nef的IW9四聚体，如在协议部分中描述。作为参考，另一套管进行同样的温育和染色条件，所不同的是二甲基亚砜（DMSO）溶液中加入，而不是公钥基础设施。用于分析该数据的选通策略在图1中说明。 请点击此处查看该图的放大版本。
| SIV蛋白 | 氨基酸位置 | 氨基酸序列 | MHC I类分子（新命名） | MHC I类分子（老nomenclaturE） | 表位短名称 |
| 插科打诨 | 181-189 | CTPYDINQM | 马牧-A1 * 001 | 马牧-A * 01 | 加格CM9 |
| 插科打诨 | 254-262 | QNPIPVGNI | 马牧-A1 * 001 | 马牧-A * 01 | 加格QI9 |
| 插科打诨 | 72-79 | GSENLKSLY | 马牧-A1 * 001 | 马牧-A * 01 | 加格GY9 |
| 信封 | 830-838 | FHEAVQAVW | 马牧-B * 017：01 | 马牧-B * 17 | 信封FW9 |
| 信封 | 233-241 | CAPPGYALL | 马牧-A1 * 001 | 马牧-A * 01 | 信封CL9 |
| 信封 | 620-628 | TVPWPNASL | 马牧-A1 * 001 | 马牧-A * 01 | 信封TL9 |
| 信封 | 788-795 | RTLLSRVY | 马目-A1 * 002：01 | 马牧-A * 02 | 信封RY8 |
| 信封 | 296-304 | RTIISLNKY | 马牧-A1 * 002：01 | 马牧-A * 02 | 信封RY9 |
| Vif蛋白 | 123-131 | RRAIRGEQL | 马牧-B * 008：01 | 马目-B * 08 | Vif蛋白RL9 |
| Vif蛋白 | 173-181 | RRDNRRGL | 马牧-B * 008：01 | 马目-B * 08 | Vif蛋白RL8 |
| Vif蛋白 | 66-73 | HLEVQGYW | 马牧-B * 017：01 | 马牧-B * 17 | Vif蛋白HW8 |
| Vif蛋白 | 100-109 | VTPNYADILL | 马牧-A1 * 001 | 马牧-A * 01 | Vif的VL10 |
| Vif蛋白 | 97-104 | WTDVTPNY | 马牧-A1 * 002：01 | 马牧-A * 02 | Vif蛋白WY8 |
| 启 | 13-22 | KRLRLIHLL | 马牧-B * 008：01 | 马目-B * 08 | 冯KL9 |
| 达 | 28-35 | STPESAML | 马牧-A1 * 001 | 马牧-A * 01 | 达SL8 |
| 奈夫 | 137-146 | RRHRILDIYL | 马牧-B * 008：01 | 马目-B * 08 | 奈夫RL10 |
| 奈夫 | 246-254 | RRLTARGLL | 马牧-B * 008：01 | 马目-B * 08 | 奈夫RL9b |
| 奈夫 | 8-16 | RRSRPSGDL | 马牧-B * 008：01 | 马目-B * 08 | 奈夫RL9a |
| 奈夫 | 165-173 | IRYPKTFGW | 马牧-B * 017：01 | 马牧-B * 17 | 奈夫IW9 |
| 奈夫 | 195-203 | MHPAQTSQW | 马牧-B * 017：01 | 马牧-B * 17 | 奈夫MW9 |
| 奈夫 | 159-167 | YTSGPGIRY | <TD>马牧-A1 * 002：01马牧-A * 02 | 奈夫YY9 |
表1：可用于在猕猴监测SIV-特异性CD8 + T细胞应答的pMHC-I四聚体的列表。
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Discussion
在此过程中值得讨论的有几个步骤，因为它们是产生最佳效果的关键。首先，由于生物样本的质量是任何流式细胞测定法38的成功的一个强有力的预测，都必须小心，以确保细胞是染色过程中存活，并在悬浮液中。与冷冻保存的样品时，因为它们更容易结块和通常含有死细胞的更高数量，这是特别相关的。在这些情况下，通过将细胞悬浮液通过的pMHC-I四聚体标记过程之前的70微米的细胞滤网可能大大改善的结果。第二，在测定中使用的荧光染料的适当的补偿是准确的数据分析的关键，尤其是当多个参数在相同的实验进行评估。在这方面，建议新鲜单色彩补偿控制来对每个的pMHC-I四聚体随时准备投入泰宁检测。我们主张，因为其广泛的抗Ig反应，事实上，它们产生正面和负面的人群明确的双峰分布的补偿款使用的珠子。由于这些珠粒不结合的MHC-I类分子，抗体缀合到相同的荧光团作为的pMHC-I四聚体（ 例如 ，APC和BV 421）应该被用作补偿控制。数的这种补偿珠粒可从多个供应商，并应根据制造商的说明使用。第三，由于在这里所描述的表型的策略需要基于三个分子（ 即，CD28，CCR7，以及GZM B）所示，选通控制，如荧光减一（FMO）试验的分级表达CD8 + T细胞亚群的划分或同种型匹配抗体，应该用于促进这些类型的分析。在我们的实验，例如，将含有的pMHC-I四聚体+ CD8 + T细胞群体感兴趣的分离的管重新总是与缀合到相同的荧光染料作为对CD28，CCR7，以及GZM B.重要的单克隆抗体同种型对照单克隆抗体染色，虽然上述准则可能有助于改善的整体质量的pMHC-I四聚体染色，它们不是唯一的变量可能会影响该测定的性能。考虑到每一个实验室环境的独特性，这里所描述的整个工作流程应在模拟样本进行至少一次，以允许实践和相应的调整。
奇怪的是，的pMHC-I四聚体阳性CD8 + T细胞在外周血单个核细胞偶尔观察到SIV幼稚（未感染的和未接种）恒河猴。这些情况下，不会出现是背景染色的基于数据的视觉检查的结果。相反，他们可能反映的pMHC-I分子和杀伤免疫球蛋白样受体（的KIRs）之间的相互作用猕猴NK细胞和CD8 + T细胞3的表面上表达9,40。事实上，马目-A1 * 002：01四聚体与对应于加格GY9和Env RY8表位的肽折叠已显示出结合到马目-KIRDL05 39。沿着这些线路，马牧-A1 * 002：01 /加格GY9和马牧-A1 * 002：01 /信封RY8更容易表现出上述银独立的pMHC-I四聚体染色。鉴于这种现象，重要的是控制用于在涉及以下感染或疫苗接种的SIV-特异性CD8 + T细胞应答纵向评估猴实验这个基线反应是很重要的。为了实现这一点，最好是在治疗的第一天获得的样品进行的pMHC-I四聚体染色。它也可能在相关的这些初始时间点的情况下，比较冻结PBMC在几个小规模分装与基线样品需要在未来的实验。
的pMHC-I四聚体染色的一个限制是已知的特异性和MHC-I限制性的c只有CD8 + T细胞一种通过该方法进行研究。这是因为它们的MHC基因位点的复杂组织猕猴尤为重要。事实上，一个单一的猕猴单倍型可以有几十个MHC-I基因，并非所有的编码与在细胞表面29上稳定表达的分子。其结果是，它可能难以确定该组由一个给定的动物表达功能的MHC-I类分子的。 01， 马牧-B * 008：01，和Mamu-不过，这警告可以通过设计实验，包括猴子是积极已知MHC-I等位基因，如马牧-A1 * 001， 马牧-A1 * 002来克服B * 017：01。
总之，本手稿提供了用于确定在恒河猴SIV-特异性CD8 + T细胞的频率和记忆表型的优化的pMHC-I四聚体染色协议。自的pMHC-I四聚体染色比IFN-γELISPOT和ICS测定更敏感的检测抗原特异性CD8的+ T-细胞，并且不需要在体外的Ag的刺激，在这里介绍的方法是研究的CD8 + T细胞应答在免疫缺陷病毒感染的结果的影响是特别有用的。从掌握该技术获得的实际知识也可能是丰富抗原特异性CD8 + T细胞作为功能研究的一部分，在各种疾病的设置6监测的 CD8 + T细胞应答是有用的。
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Acknowledgments
我们要感谢大卫·沃特金斯支持，使该方法存在的优化实验。研究本出版物中报道了由迈阿密中心的美国国立卫生研究院艾滋病研究下奖号P30AI073961提供一个试点补助的部分资助。内容完全是作者的责任，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20 °C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5 ml Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μl of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5 ml screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
- Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).
- Doherty, P. C.
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, Suppl 1 103-110 (2007).
- Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
- Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
- Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
- Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
- Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
- Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
- Valentine, L. E., et al. Infection with "escaped" virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
- Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
- Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
- Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
- Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
- Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
- Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
- Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
- Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
- Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
- Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
- Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
- Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
- Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
- Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Weatherall, D. The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
- Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Roederer, M., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C. , Blackwell Science. Boston. 1-49 (1996).
- Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
- Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).
