Summary
ここでは、エイズウイルスに対するアカゲザルCD8 + T細胞を列挙し、特徴づけるための最適化されたプロトコルを提示します。この記事では、HIV免疫学の分野にだけでなく、CD8 + T細胞応答が疾患の転帰に影響を与えることが知られている生物医学研究の他の分野のみならず便利です。
Abstract
ペプチド-主要組織適合性複合体クラスI（のpMHC-I）四量体は、CD8 + T細胞応答を研究するための貴重なツールとなっています。これらの試薬は、直接CD8 + Tリンパ球の表面上のT細胞受容体に結合するので、蛍光色素標識のpMHC-I四量体は、抗原（Ag）からの正確な検出を可能にする特異的CD8 + T細胞のin vitro再を必要とせず-刺激。マルチカラーフローサイトメトリーと組み合わせた場合にさらに、のpMHC-I四量体染色は、分化段階、メモリー表現型および活性化状態を含む、Ag特異的CD8 + T細胞の重要な側面を明らかにすることができます。分析のこれらのタイプは、CD8 + T細胞は、AIDSへの進行に影響を与える可能性がHIV免疫学の分野において特に有用です。サル免疫不全ウイルス（SIV）とアカゲザルの実験的感染は、エイズウイルスに対する細胞性免疫を研究するための貴重なツールを提供します。その結果、かなりのprogreSSは、この動物モデルにおいてT細胞応答を定義し、特徴付けるてなされたものです。ここでは、のpMHC-I四量体染色によりアカゲザルでSIV特異的CD8 + T細胞を列挙するための最適化されたプロトコルを提示します。私たちのアッセイは、ワクチン接種またはSIV感染によって生成されたSIV特異的CD8 + T細胞応答を追跡するのに有用である可能性がありますテストごとに2つのpMHC-I四量体+ CD8 + T細胞集団の同時定量およびメモリ表現型解析が可能になります。生物医学研究における非ヒト霊長類の妥当性を考慮すると、この方法は、複数の疾患の設定におけるCD8 + T細胞応答を研究するために適用可能です。
Introduction
それらは、腫瘍免疫監視に関与し、細胞内病原体1の撲滅に寄与するようにCD8 + T細胞は、適応免疫系の重要な成分を含みます。簡単に言えば、CD8 + T細胞は、特異的に、宿主細胞の原形質膜上に存在するI（のpMHC-I）分子をペプチド-主要組織適合性複合体クラスを認識するT細胞受容体（TCR）を発現します。これらのペプチドは、内因的に合成されたタンパク質のタンパク質分解に由来するので、細胞表面のpMHC-I複合体は、細胞内環境にウィンドウを提供します。ウイルス感染時に、例えば、感染した細胞は、CD8 + T細胞をパトロールによって発現のTCRに対するリガンドとして機能することができるウイルス由来のペプチドを含むMHC-I分子を表示します。ウイルス特異的CD8 + T細胞は、そののpMHC-Iリガンドを提示する感染細胞を検出した場合には、TCRの関与は、CD8 + T細胞の活性化とultiをもたらしますmately細胞溶解をターゲットにつながります。 CD8 + T細胞応答の大きさ、特異性、および表現型を決定し、これらのTCR /のpMHC-Iの相互作用の重要性を考えると、多くの場合、ヒトの疾患についての重要な手がかりを明らかにすることができます。
1990年代初頭までは、Ag特異的CD8 + T細胞の定量化は、技術的に厳しい限界希釈アッセイ（LDA）2,3に依存していました。だけでなく、LDAが完了するまでに数日必要でしたが、それはまた、増殖能力を欠いていた細胞を検出することができませんでした。その結果、LDAは非常に免疫反応に関与する抗原銀（Ag）特異的CD8 + T細胞を実際の頻度を過小評価しました。 ELISPOTおよび細胞内サイトカイン染色アッセイの開発は非常に細胞性免疫を測定する能力を改善したが、これらの方法は依然としてAg特異的T細胞4を定量するためのインビトロ刺激を必要としました。それは1996年アルトマン、デイビス、および高専までではなかったですeaguesはのpMHC-I四量体技術5の開発を報告し、その画期的な記事を掲載しました。この技術の成功に重要なことにより、フローサイトメトリーアッセイの洗浄ステップ中に脱落のpMHC-I四量体の可能性を低減する、TCR /のpMHC-Iとの相互作用の半減期延長のpMHC-I分子の多量体でした。上記アッセイ上のpMHC-I四量体の主な利点は、正確に、インビトロ再刺激を必要とすることなく、直接ex vivoでのAg特異的CD8 + T細胞を検出する能力です。また、マルチカラーフローサイトメトリーでのpMHC-I四量体染色の組み合わせは、分化段階、メモリー表現型、およびAg特異的CD8 + T細胞2-4の活性化状態の詳細な分析を可能にしました。 6染色多量のpMHC-IによりCD8 + T細胞レパートリーを特徴付けるための最近の技術の進歩を考慮して、アプリケーションの幅FORこの方法論は引き続き拡大する可能性があります。
生物医学研究におけるいくつかの領域は、HIV免疫学7のフィールドよりのpMHC-I四量体染色からより多くの恩恵を受けています。 CD8 + T細胞は、時間的アルトマン、デイビス、と同僚8,9によって公開時点によってHIVウイルス血症の初期制御に関連付けられていたが、その後の年のpMHC-I四量体の使用が大幅に我々の理解を拡大しましたHIV特異的CD8 + T細胞応答。例えば、のpMHC-I四量体染色は、ほとんどのHIV感染者10月12日におけるウイルス特異的CD8 + T細胞応答の強固な大きさを確認助けました。この方法はまた、HIVおよび抗レトロウイルス療法、「エリート制御」として知られる現象の非存在下でのウイルス複製の自発的なコントロールに関連付けられたMHC-I分子によって制限SIV特異的CD8 + T細胞応答の特徴付けを容易に
アカゲザル（ アカゲザル ）の実験SIV感染は、HIV / AIDS 18,19に対する免疫介入を評価するための最良の動物モデルのまま。過去25年間で、実質的な進歩がMHC-I対立遺伝子の発見およびペプチド結合モチーフ13,20-27の定義を含め、このサル種におけるSIV特異的CD8 + T細胞の同定および特徴付けになされたもので。その結果、のpMHC-I四量体は、SIV特異的CD8 + T細胞の分析のために開発されていますこの動物モデル28における応答。 MAMU-A1はMAMU-A1は*、001 * 002：：、01 MAMU-B * 008：これらの試薬のほとんどは、4アカゲザルMHC-I対立遺伝子の遺伝子産物で作られている01、およびMAMU-B * 017：01。注目すべきは、アカゲザルは、MHC-C遺伝子座29を発現しません 。本実験で使用したのpMHC-I四量体の大部分はエモリー大学のNIH四量体コア施設で生産されました。それにもかかわらず、免疫優性のGag CM9エピトープに結合MAMU-A1 * 001四量体を含む、これらの試薬のいくつかは、唯一のライセンス契約のために商業的供給源から得ることができます。上記の4つのアカゲザルの対立遺伝子のpMHC-I四量体を使用して、我々は、ワクチン接種またはプライマリSIV感染30,31によって誘導された21 SIVエピトープ（ 表1）の合計に対して、CD8 + T細胞を正常に列挙している（マーチンらら 、未発表の観察）。
現在の原稿が提供しますアカゲザルにおけるSIV特異的CD8 + T細胞の頻度および記憶表現型を決定するためのpMHC-I四量体染色プロトコルを最適化しました。 TCRの内在化を減少させ、それによってのpMHC-I四量体染色32を改善するために、アッセイは、タンパク質キナーゼ阻害剤（ここでは、ダサチニブが使用されるPKI）で待機30分のインキュベーションで始まります。 01四量体：後述するようにMAMU-B * 017を使用している場合、この治療は、特に有用です。蛍光標識のpMHC-I四量体およびモノクローナル抗体（mAb）で細胞を標識する方法の説明も提供されます。このプロトコルはまた、細胞溶解関連分子のグランザイムB（GZM B）の細胞内検出のための細胞透過のステップを含みます。 CD3に対するmAbは、このTCRシグナル伝達分子の検出を向上させるだけでなく、この工程で添加されます。参考として、この染色パネルに用いられる全ての蛍光色素が記載されています。
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Protocol
この原稿で利用末梢血単核細胞（PBMC）のサンプルは、ウィスコンシン国立霊長類研究センターに収容インドのアカゲザルから得ました。これらの動物は、ウィスコンシン大学院動物実験委員会33の大学によって承認されたプロトコルの下ウェザーレポートに従って世話しました。すべての動物の手順は、麻酔下で実施し、すべての努力は、潜在的な苦痛を最小限にするために行われました。
1. PKI治療
注：これはオプションですが、MAMU-B * 017に推奨：01四量体。 結果と考察セクションを参照してください。
- 1.6×10 7細胞/ mlの濃度で、R10培地中で再懸濁PBMC。
- サイトメトリーチューブ対応するフローにこの細胞懸濁液の50μlのを追加します。各チューブにPKIの100 nMの溶液50μlを追加します。
- 各チューブをボルテックス。 37℃で30分間インキュベートします。このの終わりまでにステップは、各チューブは、8.0×10 5 PBMCおよびPKIの50 nMのを含む100μlの細胞懸濁液を持っている必要があります。
- pMHC-I四量体染色工程に進みます。
蛍光色素で標識されたのpMHC-I四量体2.染色
- pMHC-Iテトラマーマスターミックスを準備する前に、4℃で少なくとも15分間、20,000×gで遠心分離器のpMHC-I四量体チューブを。このステップの目的は、バックグラウンド染色を増加させることができるのpMHC-I四量体溶液中のタンパク質凝集体をペレット化することです。遠心分離工程が行われると、タンパク質凝集体が蓄積してきたであろう、チューブの底からピペッティングを避けます。
- すべての実験のチューブを染色するのに十分なのpMHC-I四量体のマスターミックスを調製します。エラーをピペッティングするためのアカウントにこのマスターミックスの総体積の15％の過剰を準備します。
- 染色バッファー（ 例えば 、ブリリアントステインバッファー）中の希釈のpMHC-I四量体のpMHC-Iテトラマーマスターミックス25μlをADDEになるように、各テストにD。
- テストごとに2つのpMHC-I四量体でラベルPBMC。ブリリアントバイオレット（BV）421にアロフィコシアニン（APC）およびその他に結合1。
- 100μlの最終体積でチューブサイトメトリー対応するフローに8.0×10 5 PBMCを追加します。細胞は上述のPKI処理を行った場合は、既にこの段階で、100μl中に再懸濁されるべきです。
- サイトメトリーチューブ対応するフローへのpMHC-Iテトラマーマスターミックス25μlのを追加します。このステップの終わりまでに、各チューブ内の最終容量は125μlであるべきです。
- 細胞懸濁液を均質化するために各チューブをボルテックス。
- 45分間室温で暗所でインキュベートします。この45分間のインキュベーションの間に表面染色mAbのカクテルを準備します。
3.表面染色
- すべての実験のチューブを染色するのに十分なmAbのマスターミックスを調製します。アカウントにこのマスターミックスの総体積の15％超過を準備ピペット操作エラーの。
- 50μlのは、テストごとに追加されるように、染色バッファーでマスターミックスの音量を調節します。
- 適切な非CD8 + T細胞の排除およびメモリサブセットの描写のために、使用は、表面染色マスターミックスの次の分子に対して向けられたモノクローナル抗体の量を滴定しました。
注：CD14 BV 510、CD16 BV 510、CD20 BV 510、CD8αBV 785、CD28 PE Cy7の、およびCCR7 FITC：各モノクローナル抗体に結合させた蛍光色素は、参考資料としてご提供するものです。 CD14、CD16、およびCD20に対するmAbは、それらが「ダンプ」ゲートに含まれることになるので、同じ蛍光色素（ すなわち、BV 510）に結合されていることに注意してください。 - [ すなわち、アミン反応性染料（ARD）]表面染色マスターミックスに死細胞を識別するための固定可能な染料を含めます。 ARD試薬は、「ダンプ」ゲートに使用されるものと同様の発光スペクトルと蛍光色素に結合していることを確認します。この場合、ARDアクアを使用します。
- 50μlのを追加します。染色マスターミックスチューブサイトメトリー対応するフローを3.1〜3.4にします。このステップの終わりまでに、各チューブ内の最終容量は175μlであるべきです。
- 各チューブをボルテックス。 25分間室温で暗所でインキュベートします。
- 洗浄緩衝液（PBSウシ血清アルブミン、0.1％を含有する溶液0.45グラム/ LのNaN 3）で細胞を洗浄します。
注意：アジ化ナトリウムは有毒物質です。でも、微量への暴露は、症状を引き起こす可能性があります。これらの実験は行われている教育機関での環境・健康・安全（EHS）オフィスで指定されたガイドラインに従って、この物質を取り扱います。 - 5分間、510×gで遠心分離管。慎重に個別の廃棄物容器に上清をデカントします。ペレットを乱さないようにしてください。
注意：それは洗浄緩衝液中でアジ化ナトリウムの存在と反応し、有毒ガス34の形成をもたらすことができるように漂白剤を含むリザーバーに洗浄緩衝液上清をデカントしないでください。 C言語これらの実験は、アジ化ナトリウムを処分する方法のガイドラインのために行われている教育機関でEHSオフィスをontact。 - デカントした後、各チューブ内に保持残った液体中の細胞をボルテックス。
4.細胞固定
- 細胞を固定するために、すべてのチューブに2％パラホルムアルデヒド（PFA）の溶液250μLを加えます。
注意：PFAは有毒物質です。でも、微量への暴露は、症状を引き起こす可能性があります。これらの実験は行われている教育機関でEHSオフィスで指定されたガイドラインに従って、この物質を取り扱います。- 2％PFA液を細胞に等張性でなければならないので、この溶液を調製し、PBSを使用しています。 2％PFA溶液を100ミリリットルの複数の実験のために十分です。十分にすぐに細胞凝集体の形成を防止するために、2％PFAを添加した後、全てのチューブをボルテックス。
- 20分間4℃で暗所でインキュベートします。
- Wステップ3.7から3.9を繰り返して灰細胞。このステップが完了すると、細胞は24〜48時間、4℃で暗所に保存することができます。透過処理の段階に進む前に、徹底的にチューブをボルテックス。
細胞の5.透過処理
- 透過化緩衝液500μlを追加します。ボルテックスすべてのチューブ。
- 10分間室温で暗所でインキュベートします。
- ステップ3.7から3.9を繰り返して細胞を洗浄。
6.細胞内染色
- すべての実験のチューブを染色するのに十分なmAbのマスターミックスを調製します。
- 細胞内のmAbマスターミックス50μlのは、テストごとに追加されるように、PBSまたは染色バッファーで音量を調整します。
- CD3およびGZM B.に対して向けられたmAbの滴定量を用いて6.1および6.2に記載されたmAbのマスターミックスを調製します
注：のpMHC-I四量体によってTCR結合は、四量体+ CD3 + CD8の検出を妨害することができますCD3内在、+になることができますT細胞を、抗CD3 mAbで表面染色マスターミックスに追加された場合。細胞を透過性にした後、これを回避するために、この段階では、抗CD3モノクローナル抗体を加える、つまり、。 CD3 PerCPをCy5.5標識とGZM B PE：各mAbに結合させた蛍光色素は、参考として記載されています。 - 対応するチューブにモノクローナル抗体カクテルの50μlのを追加します。 30分間室温で暗所でインキュベートします。
- ステップ3.7から3.9を繰り返して細胞を洗浄。チューブは、フローサイトメーターで取得する準備ができています。
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Representative Results
ここで説明するプロトコルは、MAMU-A1 * 001 +アカゲザルにおけるワクチン誘導性のGag CM9特異的CD8 + T細胞応答の大きさ及びメモリ表現型を決定するために使用されています。この分析のために、APC結合MAMU-A1 * 001 /ギャグCM9四量体は、8色フローサイトメトリー染色のパネルに使用しました。 図1Aは、 - Fは、各テスト中に存在する両方の四量体に適用されるべきデータを分析するために使用されるゲーティング戦略を示しています。 pMHC-I四量体+ CD8 + T細胞集団がよく、最小限の背景（ 図1FおよびG）で分離されていることに注意してください。 ;、過渡的なメモリ（T EM1; CD28 + CCR7-）、およびエフェクター中央メモリ（CD28 + CCR7 + T CM）：アカゲザルにおけるメモリCD8 + T細胞は、CD28およびCCR7の表面発現に基づいて、3つのサブセットに分類することができますメモリ（T EM2; CD28-CCR7-）35。このプロトコルはまた、GZM BおよびCD3の細胞内検出のための細胞透過のステップを含みます。 図1Gは - 私は、四量体+ゲート内のメモリのサブセットとGZM Bを発現するCD8 + T細胞の描写を示しています。
バックグラウンド染色は、のpMHC-I四量体標識アッセイにおいて次善の結果をもたらすことができます。これを回避するために、いくつかの注意が提案されています。プロトコルセクションで述べたように、のpMHC-Iテトラマー試薬を含むバイアルは、常にマスターミックスの調製前に少なくとも15分間20,000×gで遠心分離されるべきです。このステップの目標は、のpMHC-I四量体溶液中に存在し得る任意のタンパク質凝集体をペレット化することです。また、使用前に各試薬を滴定することもお勧めします。理想的には、行うか、関心のAg特異的CD8 + T細胞集団を含まないMHC-Iをマッチさせた細胞は、関連のpMHC-I四量体で標識されるべきです。このCAnはSIVのナイーブ（陰性対照）と新たに得られたのpMHC-I四量体の様々な量と並んでSIV感染（陽性コントロール）マカク側から低温保存したPBMCを染色することによって達成されます。 図2では、例えば、1.0μL/ APC結合MAMU-B * 008のテスト：01 /ネフRL10四量体は四量体陽性および陰性CD8 + T細胞集団との間の最良の分離を得ました。最後に、蛍光色素の選択も大幅のpMHC-I四量体染色から得られた結果に影響を与えることができます。この点で、のpMHC-I四量体は、回避されるべきである分子（ 例えば 、フルオレセイン）を暗くするためにコンジュゲート。我々の経験では、このようなPE、APC、およびBV 421のような明るい蛍光色素とコンジュゲートのpMHC-I四量体は、最良の結果が得られています。
私たちは、そのMAMU-B *を気づいている017：01四量体は、典型的には、前述した明るい蛍光色素に結合させた場合であっても、薄暗い染色が得られます。その理由低蛍光強度は完全には明らかではないが、低親和性TCR / MAMU-B * 017含まれる場合があります：01の相互作用と四量体は、36,37の結合時の迅速なTCRの内在化を。これらの線に沿って、のPKIは、CD8 + T細胞32の表面上のTCRの内在化を阻害することが示されています。結果としてのPKIは、のpMHC-I四量体染色によりAg特異的CD8 + T細胞の検出を向上させることができます。 01四量体染色、実質的にPKI（ 図3）でPBMCを前処理することによって改善することができます。MAMU-Bの品質* 017がどこに我々は、我々の実験では、この効果を確認しています。 01制限CD8 + T細胞の感受性に一意である可能性があります：不思議なことに、このPKIによる前処理が大幅にMAMU-B * 017はことを示唆し、ここで試験した他のpMHC-I四量体（データは示されていない）の染色を改善しませんでしたPKI処理します。
図1：ゲーティング戦略と成功のpMHC-Iテトラマー染色の代表的な結果。我々はMAMU-A1 * 001 +アカゲザルからのPBMCにおけるワクチン誘導のGag CM9特異的CD8 + T細胞の大きさとメモリの表現型を評価しました。ここでは、APC結合MAMU-A1 * 001 /ギャグCM9四量体は、8色フローサイトメトリー染色パネルに用いました。 （A - F）フローサイトメトリー分析のためのゲーティング戦略。まず、斜めにクラスタ化されたシングレット上のゲートは、SSCの面積に対するその後FSC面積（FSC-A）および側方散乱の高さ（SSC-H）に対する前方散乱の高さ（FSC-H）をプロットすることによって作成された（SSC-A; AおよびB） 。次に、時間ゲートは、5 番目と90 番目の百分位内に記録されたイベントのみを含め、その作成されました。得られた細胞は、その後、「ダンプチャネル"負、CD3 +細胞（CおよびD）でゲートしました。この段階で、リンパ球集団は、そのFSC-A及びSSC-Aの特性に基づいて描写し、その後の分析は、CD8 +細胞（EおよびF）内で行いました。 pMHC-I四量体+細胞（G）を概説した後、メモリー表現型解析は、このゲート（H）内で行いました。 （; CD28 + CCR7 + T CM）、過渡的なメモリ（T EM1; CD28 + CCR7-）、およびエフェクターメモリー（T EM2中央メモリ：アカゲザルメモリーT細胞は、CD28およびCCR7の発現に基づいて3つのサブセットに分類することができます。 ; CD28-CCR7-）。本プロトコルは、グランザイムB（GZM B）四量体+ CD8 + T細胞（I）における発現の細胞内評価のための細胞透過処理工程を含みます。ヒストグラムの斜線部は、アイソタイプ適合対照mAbで染色した四量体+ CD8 + T細胞に相当します。この染色に存在したBV 421 - 共役四量体+集団であるが、図には示されていない、同一のゲーティング戦略は、それを分析するために使用されるべきです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：01 /ネフRL10四量体：APC結合MAMU-B * 008の滴定の代表的な結果。 2 MAMU-B * 008からのPBMCは：01+アカゲザルは、この実験に使用した：1動物は、SIVはナイーブだった、他方がSIVに感染したとポジティブコントロールとして役立ったのに対し、負の対照としました。 MAMU-B * 008の量を決定するには、次の四量体+および四量体CD8 + T細胞の間の最良の分離をもたらす01 /ネフRL10四量体を、各動物からのPBMCをのpMHC-Iテトラマー試薬の指示量と共にインキュベートしました。これらの結果に基づいて、1.0μL/テストWA最適量として選択されるのは、将来のアッセイに使用されます。データを分析するために利用されるゲーティング戦略は、図1に記載されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：01テトラマー：MAMU-B * 017の蛍光強度上のPKI処理の影響。 PKI阻害剤は、TCR複合体の内在化を阻害し、それにより、蛍光色素標識のpMHC-Iは32四量体によりAg特異的CD8 + T細胞の検出を向上させます。 （A - B）2 MAMU-B * 017からのPBMC：01+アカゲザルは、この実験で使用した1匹のサルは、SIVはナイーブだった、他方がSIVに感染させ、務めていましたが、陰性コントロール（A）を務めていましたポジティブコントロール（B）。プロトコルセクションに記載したように、01 /ネフIW9四量体：両方の動物からのPBMCを、APC結合MAMU-B * 017で染色する前に30分間50 nMの濃度で、PKIの存在下、37℃でインキュベートしました。 。参考として、チューブの別のセットは、そのジメチルスルホキシド（DMSO）は、代わりにPKIを添加した以外は、同じインキュベーション及び染色条件に供しました。データを分析するために利用されるゲーティング戦略は、図1に記載されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| SIVタンパク質 | アミノ酸位置 | アミノ酸配列 | MHCクラスI分子（新命名法） | MHCクラスI分子（旧nomenclaturE） | エピトープ短縮名 |
| ギャグ | 181-189 | CTPYDINQM | MAMU-A1 * 001 | MAMU-A * 01 | ギャグCM9 |
| ギャグ | 254から262 | QNPIPVGNI | MAMU-A1 * 001 | MAMU-A * 01 | ギャグQI9 |
| ギャグ | 72から79 | GSENLKSLY | MAMU-A1 * 001 | MAMU-A * 01 | ギャグGY9 |
| ENV | 830から838 | FHEAVQAVW | MAMU-B * 017：01 | MAMU-B * 17 | envをFW9 |
| ENV | 233-241 | CAPPGYALL | MAMU-A1 * 001 | MAMU-A * 01 | envをCL9 |
| ENV | 620から628 | TVPWPNASL | MAMU-A1 * 001 | MAMU-A * 01 | envをTL9 |
| ENV | 788から795 | RTLLSRVY | MAMU01：-A1 * 002 | MAMU-A * 02 | envをRY8 |
| ENV | 296から304 | RTIISLNKY | 01：MAMU-A1 * 002 | MAMU-A * 02 | envをRY9 |
| Vif | 123-131 | RRAIRGEQL | MAMU-B * 008：01 | MAMU-B * 08 | VifがRL9 |
| Vif | 173-181 | RRDNRRGL | MAMU-B * 008：01 | MAMU-B * 08 | VifがRL8 |
| Vif | 66-73 | HLEVQGYW | MAMU-B * 017：01 | MAMU-B * 17 | VifがHW8 |
| Vif | 100から109 | VTPNYADILL | MAMU-A1 * 001 | MAMU-A * 01 | Vif VL10 |
| Vif | 97-104 | WTDVTPNY | 01：MAMU-A1 * 002 | MAMU-A * 02 | VifがWY8 |
| 回転 | 13-22 | KRLRLIHLL | MAMU-B * 008：01 | MAMU-B * 08 | 改訂KL9 |
| タット | 28-35 | STPESAML | MAMU-A1 * 001 | MAMU-A * 01 | タットSL8 |
| ネフ | 137-146 | RRHRILDIYL | MAMU-B * 008：01 | MAMU-B * 08 | ネフRL10 |
| ネフ | 246-254 | RRLTARGLL | MAMU-B * 008：01 | MAMU-B * 08 | ネフRL9b |
| ネフ | 8月16日 | RRSRPSGDL | MAMU-B * 008：01 | MAMU-B * 08 | ネフRL9a |
| ネフ | 165-173 | IRYPKTFGW | MAMU-B * 017：01 | MAMU-B * 17 | ネフIW9 |
| ネフ | 195-203 | MHPAQTSQW | MAMU-B * 017：01 | MAMU-B * 17 | ネフMW9 |
| ネフ | 159-167 | YTSGPGIRY | <01：TD> MAMU-A1 * 002MAMU-A * 02 | ネフYY9 |
表1：アカゲザルにSIV特異的CD8 + T細胞応答をモニターするために利用可能なのpMHC-I四量体のリスト。
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Discussion
この手順のメリットの議論におけるいくつかのステップは、彼らが最適な結果をもたらすために重要であるとして。生物試料の品質が任意のフローサイトメトリーアッセイ38の成功の強力な予測因子であるので、まず、すべてのケアは、細胞が染色手順の間に実行可能な及び懸濁液中であることを保証するために注意しなければなりません。凍結保存したサンプルで作業するとき、彼らは凝集しやすいであり、典型的に死んだ細胞のより高い数字を含むので、これは特に関連します。これらのケースでは、前のpMHC-I四量体標識操作に70μmのセルストレーナーを介して細胞懸濁液を渡すと、実質的な結果を改善する可能性があります。第二に、アッセイで使用される蛍光色素の適切な補償は、複数のパラメータが同じ実験で評価されている場合は特に、正確なデータ分析のために重要です。この点で、新鮮な単一色補正コントロールは、すべてののpMHC-I四量体のために準備することをお勧めしますアッセイをtaining。私たちは、その広い抗Ig反応性と、彼らは正と負の集団の明確な二峰性の分布を得ているという事実の補償ビーズの使用を好みます。これらのビーズは、MHC-I分子に結合しないので、抗体は、補償制御として使用されるべきであるのpMHC-I四量体（ 例えば 、APCおよびBV 421）と同じフルオロフォアにコンジュゲート。このような補償ビーズのいくつかは、複数のベンダーから入手可能であり、製造業者の使用説明書に従って使用する必要があります。ここで説明する表現型の戦略は、このような蛍光マイナス1（FMO）テストなどのコントロールを、ゲーティング、3つの分子（ すなわち、CD28、CCR7、およびGZM B）の段階的な発現に基づいて、CD8 + T細胞サブセットの描写を必要とするため、サードまたはアイソタイプ適合抗体は、分析のこのタイプを促進するために使用されるべきです。我々の実験では、関心aののpMHC-I四量体+ CD8 + T細胞集団を含む、例えば、別々のチューブ上記のガイドラインはのpMHC-I四量体染色の全体的な質の向上に役立つかもしれませんが再常に、重要なCD28、CCR7、およびGZM B.に対するmAbと同じ蛍光色素にコンジュゲートアイソタイプコントロールmAbで染色し、彼らはその変数だけではありませんこのアッセイの性能に影響を与えることができます。すべての実験室の設定の一意性を考慮すると、ここで説明するワークフロー全体練習と関連の調整を可能にするためにモックサンプルに少なくとも一回実行する必要があります。
不思議なことに、のpMHC-Iテトラマー陽性CD8 + T細胞は、時折SIVのナイーブ（未感染とワクチン未接種）アカゲザル由来のPBMC中で観察されています。これらの場合には、データの目視検査に基づいてバックグラウンド染色の結果であると思われません。むしろ、それらはのpMHC-I分子およびキラー免疫グロブリン様受容体（のKIR）との間の相互作用を反映する可能性があるアカゲザルNK及びCD8 + T細胞3の表面上に発現9,40。実際、MAMU-A1 * 002：ギャグGY9およびenv RY8エピトープに対応するペプチドで折り畳ま01四量体はMAMU-KIRDL05 39に結合することが示されました。これらの線に沿って、MAMU-A1 * 002：01 /ギャグGY9とMAMU-A1 * 002：01 / EnvのRY8前述したAg-独立したのpMHC-I四量体染色を示すことになりやすいです。この現象を考えると、感染またはワクチン接種後のSIV特異的CD8 + T細胞応答の長手方向の評価を含むサル実験において、このベースライン反応を制御することが重要です。これを達成するために、治療の第一日目に得られたサンプルについてのpMHC-I四量体染色を実行することが望ましいです。ベースラインサンプルは将来の実験に必要とされているとまた、ケースの比較でこれらの初期の時点でいくつかの小さなサイズのアリコートでPBMCを凍結する適切な場合があります。
pMHC-I四量体染色の1つの制限はされることが知られて特異性およびMHC-I制限酵素CのみのCD8 + T細胞このアプローチによって研究されます。これは彼らのMHC遺伝子座の複雑な組織与えられたアカゲザルに特に関連します。実際、単一のアカゲザルのハプロタイプは、MHC-I遺伝子の数十を持つことができ、すべてではないそれらの安定的細胞表面29上に発現している分子をコードします。その結果、与えられた動物によって発現される機能的なMHC-I分子のセットを決定することは困難です。 01、MAMU-B * 008：01、およびMamu-それにもかかわらず、この警告は、このようなMAMU-A1 * 001 * 002 MAMU-A1などの既知のMHC-I対立遺伝子に対して陽性であるサルを含み、実験を設計することによって克服することができますB * 017：01。
結論として、この原稿は、アカゲザルにおけるSIV特異的CD8 + T細胞の頻度および記憶表現型を決定するための最適化のpMHC-I四量体染色プロトコルを提供します。 pMHC-I四量体染色は、Ag特異的CD8の検出のためのIFN-γELISPOTおよびICSアッセイよりも高感度であるため+ T細胞とインビトロのAg刺激を必要とせず、ここで提示された方法は、免疫不全ウイルス感染の結果でCD8 + T細胞応答の影響を研究するために特に有用です。この技術をマスターから取得した実用的な知見は、機能的研究の一部として、Ag特異的CD8 + T細胞を濃縮すると、種々の疾患の設定6でCD8 + T細胞応答をモニターするために有用であるかもしれません。
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Acknowledgments
私たちは、本発明の方法論の最適化を可能にした実験を支援するためのデビッド・ワトキンスに感謝したいと思います。この刊行物で報告された研究は、受賞数P30AI073961の下で国立衛生研究所のエイズ研究のためのマイアミセンターが提供するパイロット助成金によって部分的にサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20 °C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5 ml Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μl of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5 ml screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
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