ADSC folhas transplante para prevenir a estenose após estendido esofágico endoscópica submucosa Dissection

Resumo

Este estudo relata um método bem-sucedido de células adiposo endoscópica derivadas de tecido do estroma (ADSC) em folha transplante para a prevenção de estenose esofágica após uma dissecção endoscópica da submucosa estendida (ESD) em suínos.

Resumo

Nos últimos anos, a construção de folhas de células estimulou grande interesse na medicina regenerativa, especialmente para procedimentos de cirurgia reconstrutiva. O desenvolvimento de tecnologias diversificadas que combinam células estromais derivadas de tecido adiposo (ADSCs) com vários biomateriais levou à construção de vários tipos de substitutos de engenharia de tecidos, tais como osso, cartilagem e tecidos adiposos de roedor, de porcino, ou ADSCs humanos. esofágico dissecção submucosa endoscópica estendida (ESD) é responsável pela formação de estenose de esôfago. prevenção de estenose continua sendo um desafio, sem tratamentos eficazes disponíveis. Estudos anteriores relataram a eficácia do transplante de folhas de células da mucosa no modelo canino e em seres humanos. ADSCs são atribuídas propriedades anti-inflamatórias, efeitos de modulação imunes locais, indução neovascularização e habilidades diferenciação em mesenquimais e linhagens não-mesenquimais. Este estudo original descreve o tra endoscópicansplantation de uma construção da engenharia de tecidos ADSC para evitar estenose esofágica em um modelo suína. A construção ADSC foi composta de duas folhas adsc alogénicos em camadas umas sobre as outras em uma membrana de suporte de papel. As ADSCs foram marcadas com o fluororo PKH67 para permitir à base de sonda endomicroscopy de laser confocal de monitorização (pCLE). No dia do transplante, efectuou-se uma 5-cm e ESD hemi-circunferencial que se sabe induzir estenose esofágica. Os animais foram imediatamente endoscopicamente transplantado com 4 construções adsc. A completa adesão das construções adsc foi obtido após 10 min de aplicação suave. Os animais foram sacrificados no dia 28. Todos os animais foram transplantados com sucesso. O transplante foi confirmada no dia 3 com uma avaliação pCLE positivo. Em comparação com animais transplantados, animais de controle desenvolvido restrições graves, com maior desenvolvimento do tecido fibrótico, o problema alimentar mais frequente, e ganho de peso reduzido. No nosso modelo, o transplante de allogenic ADSCs, organizadas em folhas de células duplas, depois de ESD estendida foi bem sucedida e fortemente associada com uma taxa de estreitamento esofágico inferior.

Introdução

A gestão de tumores esofágicos superficial mudou com o desenvolvimento de novas técnicas endoscópicas. Hoje em dia, a ressecção endoscópica é o tratamento de primeira linha. Na verdade, ele é associado com menores taxas de morbidade e mortalidade do que uma cirurgia com a igualdade de resultados oncológicos ^{1, 2, 3.} ressecção endoscópica da mucosa (EMR) e ressecção endoscópica da submucosa (ESD) são as técnicas mais amplamente utilizados. No caso de um tumor superficial prolongado, ESD é preferido. Comparado ao EMR, ESD permite en ressecção bloco, independentemente do tamanho da lesão e moldar ^{4, 5, 6.} A principal complicação tardia de ESD é a formação de estenose de esôfago, o que geralmente ocorre entre uma e duas semanas após a ressecção. Estudos publicados recentes têm demonstrado que a formação de estenose está correlacionada com atamanho da ressecção. O japonês endoscópica Society recomenda evitar ESD tamanho superior a ¾ da circunferência do esôfago porque eles estão associados com o desenvolvimento de estenose em mais de 90% dos casos e são responsáveis ​​por problemas de alimentação graves e grande deterioração da qualidade de vida.

A prevenção da estenose de esôfago continua sendo um desafio. Mecanismos envolvidos na formação de estenose são apenas parcialmente conhecida. Estenose formações parece resultar da associação de dois mecanismos diferentes: (1) o recrutamento celular pró-inflamatórios e (2) o desenvolvimento de fibrose excessiva ^7. Vários tratamentos preventivos têm sido propostos. No entanto, os resultados não foram satisfatórios, com pouco benefício e efeitos colaterais graves ^{8, 9.} Recentemente, uma equipe japonesa, Ohki et al. , Proposto para transplantar uma folha de células de camada única de células da mucosa oral autólogas para o esophcicatriz ageal. O transplante foi realizado imediatamente após ESD ^{10, 11.} Eles demonstraram a eficácia desta abordagem inovadora, primeiro num modelo canino e, em seguida, em pacientes.

células estromais derivadas de tecido adiposo (ADSCs) são promissores na medicina regenerativa. A sua aplicação em vários campos tem mostrado resultados interessantes, especialmente no processo de cicatrização de feridas. Terapia ADSC oferece várias vantagens, porque as células são facilmente isoladas e estão associados com propriedades anti-inflamatórias, efeitos imunomoduladores locais, indução neovascularização, e habilidades de diferenciação em mesenquimais e linhagens não-mesenquimais ^{12, 13, 14.}

Em um estudo anterior, a nossa equipa demonstrou a eficácia do transplante endoscópica dupla ADSC folhas para prev estenose esofágicaenção após ESD estendida em um modelo suíno ^15. Neste artigo, os relatos de construção ADSC folhas e técnica de transplante endoscópico são apresentados.

Protocolo

Todos os animais foram tratados de acordo com a Comissão de Ética em Pesquisa Animal (orientações do Ministério da Agricultura francês). O protocolo recebeu a aprovação do comitê de ética local autorizado para experimentações com animais na Descartes Universidade Paris (número registrado MESR 2.035,02; Faculdade de Medicina de Paris Descartes, Paris, França).

1. ADSC Cultura e Etiquetagem

1. Obter ADSCs confirmados de uma instituição privada. Culturas ADSCs alogénicas a 37 ° C e 5% de CO ₂ com meio essencial mínimo alfa incluindo soro bovino fetal a 10% e 1% de antibióticos (penicilina e estreptomicina).
2. Obter cerca de 24 x 10 ⁶ ADSCs por animal usando procedimentos de expansão celular padrão (37 ° C e 5% CO _2). Colher as ADSCs usando uma solução de tripsina-padrão (10 mL para um prato T150). Realizar contagem de células com um hemocitómetro.
3. Execute célula rotular o dia antes do transplante usando o pr coloração PKH67ocedure descrito abaixo.
   NOTA: O objectivo do processo de coloração é a de permitir o rastreamento de células após o transplante.
   1. A fim de marcar 2 x 10 ⁶ ADSCs, preparar a solução A (2 X 10 ⁶ células com 100 uL de diluente de C) e solução B (4 uL de PKH67 com 1 ml de solvente C).
   2. Incubar as soluções A e B durante 2 min. Em seguida, adicionar 100 uL de soro fetal bovino durante 1 min.
   3. Lavar a solução com 300 uL de meio RPMI citrado (298,5 mL de RPMI e 1,5 mL de citrato) e centrifugar a 1500 xg durante 5 min. Repita esta operação 2 vezes. Manter as células marcadas e protegê-los da luz até que a construção folha.

2. Faça duplo ADSC folhas Construct

1. No dia antes do transplante, preparar um prato de cultura de células responsivas temperatura de 12 poços com 4 mL por poço de meio de cultura de células, descritos acima, antes de PKH-rotulagem. Semear o prato com 1,5 x 10 ⁶ PKH-Labeled células por poço e incubar durante 12 h (37 ° C e 5% de CO _2).
2. No dia do transplante, separar a camada de células confluentes por incubação do prato à temperatura ambiente durante 30 min.
3. Aspirar cuidadosamente uma folha ADSC com uma pipeta e mergulhá-la em um papel hidrofóbica (1,5 cm de diâmetro). Use este papel como uma membrana de suporte.
4. Compreender uma outra folha ADSC e depositá-lo suavemente no topo do outro para obter uma construção de camada dupla.
5. Repita estes procedimentos para obter o maior número de construções ADSC folhas, conforme necessário (4 por animal).

3. esofágico endoscópica submucosa Dissection (ESD)

1. No dia do transplante, pré-medicar os animais com 10 mg / kg de cetamina por via intramuscular e induzi-los com 8 mg / kg de propofol. Em seguida, execute a entubação endotraqueal e manter a anestesia com isoflurano inalação 2,5%.
2. Uma vez que o animal está sob anestesia geral, realizar a ESD com uma gastroscope, um videoscope, e uma unidade de eletrocirurgia.
   1. Use uma faca de endoscópica e coagulação macia para obter marcas dorsais hemi-circunferencial que variam de 40 cm a 45 cm da arcada dentária.
   2. Injectar uma solução de glicerol que contém corante indigo carmim na camada submucosa para a separação da camada de mucosa da túnica muscular.
   3. Use uma faca de endoscópica com o modo endocut I obter incisões circunferenciais.
   4. Use uma faca de endoscópica com o modo de coagulação forçado a realizar a dissecção submucosa, movendo-se a partir da incisão proximal da incisão distal.
3. No final do procedimento de ESD, a observar, cicatriz esofágica 5 cm de comprimento de hemi-circunferencial expor a camada muscular.

4. endoscópica Transplantation

1. Imediatamente após a ESD, por via endoscópica transplantar animais com 4 construções duplas ADSC folhas.
   1. Segure uma construção ADSC folhas com pinça endoscópica eprotegê-lo durante o transporte para o local da ferida por meio de um grande, tampão endoscópica transparente.
   2. Aplicar toda a superfície da construção ADSC folhas ao leito da ferida.
   3. Suavemente aplicar o construto ADSC folhas durante 10 minutos para se obter um enxerto completa e estável. Para aplicação, utilizar pinça endoscópica ou um tampão endoscópica e aplicar toda a superfície da ADSC construir sobre a camada da submucosa do esôfago.
2. Repetir este procedimento quatro vezes para cada animal, a fim de obter quatro constructos-camada de células transplantadas e aderentes duplos.
   NOTA: O objectivo é cobrir approximatively metade da área ferida.

5. pós-operatória Avaliação e Acompanhamento

1. Para cada animal, garantir pós-ESD analgesia com a injecção intramuscular de 0,2 mg / kg de morfina três vezes por dia para o primeiro dia e com 28 dias de tratamento anti-ácido de esomeprazol (40 mg / dia). Realize profilaxia antibiótica com amoxicillem (1 g / dia), durante 7 dias. Autorizar líquidos no dia 1 e sólidos no dia seguinte.
2. Seguir-se com os animais durante 28 dias. Obter avaliações clínicas diárias usando Mellow Pinkas pontuações disfagia ¹⁶ e medições de variação de peso.
3. avaliação de estenose Multimodal: sob anestesia geral, em dias programados 3, 14 e 28, realizar uma avaliação multimodal de ocorrência de estenose.
   1. Realizar uma avaliação endoscópica usando descrição cicatriz, medição de estenose, e detecção de membrana suporte de papel. Medir a estenose através do endoscópio para atravessar a estenose (o diâmetro do endoscópio é de 8 mm). Observe a cicatriz, prestando atenção ao aspecto inflamatório (eritema da mucosa, edema da mucosa, e de mucosa hemorragia espontânea) e ausência ou presença da membrana suporte de papel dentro da cicatriz.
   2. Aplicar sonda verde pCLE através do canal do operador gastroscópio diretamente para a cama cicatriz. Procurar por uma espontâneae organizado sinal verde compatível com construção enxerto ADSC folhas PKH67 marcado.
   3. Execute 2 incidências ortogonais de esofagografia barita com um aro radiológica (frente e incidências do lado esquerdo). Manter a incidência mais apertado para avaliação estenose (grau de estenose (%) = [1- (comprimento do eixo menor sob estenose / comprimento do eixo normal sob estenose) x 100)]) ^{17, 18.}
4. O sacrifício de animais.
   1. No 28 ° dia, no final do período de seguimento, realizar o sacrifício dos animais. Enquanto o animal está ainda sob anestesia geral, injectar 100 mg / kg de fenobarbital intravenosa. Certifique-se de morte do animal por exame clínico para a ausência de uma batida do coração e de circulação de respirar.
   2. Após uma exposição esternotomia e órgão, remover o esôfago de cada animal sacrificado (com 10% de fixação de formalina tamponada, inclusão em parafina e secções 4 mm de espessura). Manchar os slidescom Hematoxilina e Saffron ^15. Digitalizar os slides para análise computadorizada e comparar os grupos de animais ^15.

Resultados

A cultura de ADSCs e o procedimento para obter a folha de ADSC é mostrado na Figura 1. A Figura 2 mostra a construção do enxerto, composto por duas folhas adsc em camadas umas sobre as outras na sua membrana de suporte de papel. ADSCs foram previamente marcado com o fluoróforo PKH67 para permitir a entrada de monitorização do enxerto vivo com pCLE. A Figura 3 mostra as diferentes etapas de dissecção esofágica submucosa ...

Discussão

Neste modelo suíno, o transplante ADSC folhas foi tecnicamente bem sucedida, ea avaliação in vivo pCLE permitido para monitoramento enxerto de células. As avaliações clínicas, endoscópicos, radiológicos e histológicos demonstraram a eficácia da folha ADSC endoscópica na prevenção de estenose esofágica após ESD estendida.

O transplante endoscópica de uma solução ADSC glicerol contendo uma folha de carmim indigo é uma abordagem inovadora em medicina regenerativa. Ohki et ai. ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tampa endoscópica transparente compatível com Q180	Olympus Optical Co
GIF-Q180 gastroscópio	Olympus Optical Co
Exera II	Olympus Optical Co
18 G	Olympus Optical Co
ERBE ICC 350	Tecnologia
Indigo carmin 1%	Life
Faca híbrida endoscópica	Life
Minisonde Z pCLE sonda verde	Tecnologia Mauna Kea Você		deve aprender a usar a sonda. A manipulação pode ser difícil.
Soro fetal bovino	Sigma Aldrich	12105C
Tripsina	Sigma Aldrich	T146
Alfa mínimo essencial meio Thermo	Fisher	22561-021
Soluções salinas tampoadas com fosfato	Thermo Fisher	10010-023
PKH67 kit de corante	Sigma Aldrich	Mini67-KT
Célula responsiva à temperatura de 12 poços placa de cultura	Upcell Thermo Scientific	174900	Sinta o weel com 4 mL de cultura média padrão 30 min antes de semear células
Esomeprazol 40 mg	Biogaran
Moprhine Sulfato 50 mg/mL	Lavoisier
Amoxicilina 1 g	Biogaran
Cetamina 250 mg/5 mL	Panpharma
Propofol 10 mg/mL	Fresenius
Papel hidrofóbico	Carrefour

Sistema de Videoscópio Agulha de injeção Unidade de eletrocirurgia ERBE