Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הקמת תאי tetraploid Proliferative מ Nontransformed אדם פיברובלסטים

Published: January 8, 2017 doi: 10.3791/55028
Automatic Translation
1, 2
1Division of Morphological Science, Biomedical Research Center, Saitama Medical University, 2Department of Pathology, International Medical Center, Saitama Medical University

Introduction

Polyploidy נצפתה לא רק ברקמות מקצועיות של מינים יונקים אלא גם במגוון של מצבים פתולוגיים, כגון סרטן ומחלות ניווניות. תאים polyploid (בעיקר tetraploid) הם נצפו לעתים קרובות בנגעים preneoplastic של רקמות אנושיות, כגון נגעים intraepithelial 1,2 או קשקש ושט בארט של 3,4 צוואר הרחם, ואת כבר נחשב כמקור לתאי aneuploid ממאיר ברקמות אלו 5 , 6. למרות זאת הוא הציע מרה של tetraploid לתאי aneuploid יכולה להיות אירוע מכריע בשלבים המוקדמים של tumorigenesis, המנגנונים המעורבים בתהליך זה אינם מובנים במלואם. זה גם בגלל שאין מודל במבחנה כבר זמין שבו תאים אנושיים polyploid nontransformed יכול להפיץ.

ישנם חוקרי מושרה tetraploidy בתאי אפיתל אדם nontransformed באמצעות דור של תאי binucleated ידי Inhibiting cytokinesis 7-9. בשיטה זו, לעומת זאת, תאים דיפלואידי מיותר חייבים להתבטל על ידי מיון תא מופעל פלואורסצנטי (FACS) 7,8 או שיבוט על ידי הגבלת דילול 9. בגלל הליכים אלה הם מייגע ולא קלים לביצוע, שיטות פשוטות יותר להקים תאי tetraploid nontransformed הם רצויים עבור מחקר בתחום זה.

בדו"ח הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול להקים תאי tetraploid שגשוג מן fibroblasts אדם נורמלי או פיברובלסטים אדם הנציח טלומרז ידי נהלים פשוטים יחסית. הנהלים להשתמש demecolcine רעל כישור (DC) לעצור תאי דיפלואידי ב מיטוזה, ותאי mitotic שנאספו על ידי מנערים מטופלים נוספים עם DC. תאי mitotic דיפלואידי שטופלו DC עבור זמן ממושך להמיר תאי G1 tetraploid, ותאים אלה להתרבות תאי tetraploid כמו לאחר מעצרו צמיחה במשך כמה ימים לאחר הסרת תרופה. פרוטוקול זה מספקשיטה יעילה ליצירת מודל שימושי כדי לחקור את הקשר בין אי יציבות כרומוזום והפוטנציאל בשעור של תאים אנושיים polyploid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבית תאים

  1. להשיג את התאים כדי לגרום tetraploidy. נכון להיום זה כבר אישר כי טכניקה זו יכולה להיות מיושם על שורות תאים פיברובלסטים האדם TIG-1, ב"ג, IMR-90 ו טלומרז-הנציח TIG-1 (TIG-HT).
  2. לגדל תאים בינוניים מינימום הכרחי עם שינוי α או בכל מדיום תרבית תאים אחר מתאים לסוג התא להיחקר בתוספת 10% (v / v) בסרום שור עובר חום מומת (FBS) על ידי דוגרי 5% (v / v) CO 2 אווירה על 37 מעלות צלזיוס. תאים מעבר כל 3 או 4 ימים לא יעלו על צפיפות subconfluent.
    הערה: רמת הכפלת אוכלוסייה (PDL) יש לחשב כל פעם passaging להעריך צמיחת תאים וגיל התא. PDL ניתן לחשב את מספר הסלולרי זורעים לתוך צלחת (N1) ואת מספר הסלולרי שנקטפו על passaging הבא (N2) באמצעות הנוסחה הבאה (X הוא PDL הראשוני). PDL = X + (יומן N1 - יומן N2) / log 2

2. אינדוקציה אסטהblishment של תאים tetraploid מ דיפלואידי פיברובלסטים

  1. להשרות tetraploidy ללא פעמי לרעוד.
    הערה: זני תא מסוימים (למשל ב TIG-1) יכולה להיות כמעט לחלוטין tetraploid ידי טיפול רציף עם demecolcine (DC) כדלקמן.
    1. תאי המעבר לתוך צלחות 100 מ"מ אחד או שניים ביום לפני הטיפול כדי לגרום tetraploidy. בדרך כלל, להכין 5 x 10 5 כדי 1 x 10 6 תאים לכל צלחת לזירוז של תאים tetraploid.
    2. פנק את התאים גדלו באופן אקספוננציאלי עם מדיום המכיל 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר DC במשך 4 ימים.
    3. החלף DC-המכיל בינוני עם בינוני נקי מסמים דגירה תאים באווירה 5% (v / v) CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. תאים בדרך כלל לחדש התפשטות בתוך 1 בשבוע.
  2. להשרות tetraploidy עם פעמי לרעוד.
    הערה: רוב התאים להיות תערובת של אוכלוסיות דיפלואידי ו tetraploid כתוצאה של טיפול פשוט עם DC שתוארו לעיל (2.1). לכן, כמה שינויים של procedure לחסל אוכלוסייה דיפלואידי נחוצה כדלקמן (איור 1).
    1. תאי מעבר לכמה T75 צלוחיות יום לפני הטיפול כדי לגרום tetraploidy. בדרך כלל, להכין לפחות 5 x 10 6 תאים (1 x 10 6 תאים לכל בקבוק) לזירוז של תאים tetraploid.
    2. פנק את התאים גדלו באופן אקספוננציאלי עם מדיום המכיל 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר DC עבור 16 - 18 שעות כדי לעצור תאי מיטוזה. כמה הזמן נדרש לעצור תאי מיטוזה יכול להיות תלוי בתאי יעד צריך להיקבע על ידי ניסויים ראשוניים להשיג כמה שיותר תאי mitotic ככל האפשר. לדוגמא, תאים גדלו לאט ומחייבים DC במשך זמן ארוך יותר מאשר תאים גדלו מהר.
      הערה: אם תאי מטופלים במשך זמן רב מדי בשלב זה, הם עלולים לעבור חלקת mitotic ו לדבוק פני הצלחת, כך שלא ניתן לאסוף תאי mitotic בשל רעידה פעמית בשלב הבא.
    3. איסוף תאים mitotic נעצר DC בשיטת שייק פעמי, ב ש"שich רופף דבקה התאים mitotic נאספים על ידי רעד עדין של צלוחיות ושטיפה עם המדיום ואחריו צנטריפוגה (300 XG, 5 דק '). ספירת מספר סלולארי על ידי שיטה מתאימה בשלב זה.
    4. Reseed התאים mitotic שנאספו לתוך הכלים תרבות 60 מ"מ לטפל בתאים עם 0.1 מיקרוגרם / מ"ל ​​DC עבור 3 ימים נוספים. זרעים יותר מ 1 x 10 6 תאים mitotic לכל צלחת, כי פחות מ -10% של התאים יכולים לשרוד את הטיפול הזה.
    5. חלף DC-המכיל בינוני עם בינוני נקי מסמים ולחכות תאים לחדש התפשטות, אשר מתרחשת בדרך כלל בתוך 1 בשבוע.
  3. תאי מעבר דומה לתאי דיפלואידי מקוריים.

בחינת 3. DNA ploidy

הערה: זהו הליך ומבוסס מדריך טכני יש להפנות עבור נהלים מפורטים ועצות טכניות.

  1. קציר תאים (5 x 10 5 - 1 x 10 6) על ידי תאים דוגרים עם קון פתרון0.05% taining טריפסין 0.02% EDTA במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולנטרל טריפסין על ידי בינוני המכיל 10% FBS.
  2. צנטריפוגה התאים בינוני לשטוף אותם על ידי resuspending ב 5 מ"ל של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS) ואחריו צנטריפוגה (300 XG, 5 דק ').
  3. כן תאים לניתוח ה- DNA על ידי אחד משתי השיטות הבאות
    1. שיטה לניתוח תאים מבולבלים 10
      הערה: שיטה זו יכולה להתבצע באמצעות ערכה זמינה מסחרי עבור ניתוח מחזור התא. דוגמאות שהוכנו בשיטה זו יש לנתח מיד, כי התאים אינם קבועים בהליך ומוכתמת גרעינים חשוף לנזק לאורך זמן.
      1. שטפו תאים עם חיץ ציטראט 40 מ"מ המכיל סוכרוז 250 מ"מ. בהמשך לטיפול בתאים עם 250 μL של 0.1% (v / v) P40 Nonidet ו -30 מיקרוגרם / מ"ל ​​טריפסין ב 200 μL של חיץ ציטראט 40 מ"מ המכיל 250 סוכרוז מ"מ במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      2. הוספת 200 μL של 0.5 מיקרוגרם / Inh טריפסין מ"לibitor ו -0.1 מיקרוגרם / מ"ל ​​RNase א '40 מ"מ חיץ ציטראט המכילים סוכרוז 250 מ"מ, ו דגירה התאים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      3. הוספת 200 μL של 0.4 מ"ג / מ"ל ​​יודיד propidium (PI) במאגר ציטראט 40mm המכיל סוכרוז 250 מ"מ, ו דגירה התאים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להכתים גרעין התא.
    2. שיטה לניתוח תאים קבועים
      1. תקן תאים עם 80% אתנול על ידי השעיית התאים 1 מ"ל של PBS, הוספת 4 מ"ל של dropwise 100% EtOH תוך ערבוב ההשעיה תא ולהשאיר אותו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. תאים מקבעים זה יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות.
      2. שטפו תאים על ידי resuspending אותם 5 מ"ל של PBS ואחריו צנטריפוגה (300 XG, 5 דק '). פנקו את התאים עם 0.5 מ"ג / מ"ל ​​RNase A ו- להכתים אותם עם 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​יודיד propidium (PI) (475 μL של 0.5 מ"ג / מ"ל ​​RNase A ו- 25 μL של 1 מ"ג / מ"ל ​​PI) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. לנתח את תוכן ה- DNA של tהוא התאים באמצעות cytometer זרימה עם לייזר 488 ננומטר מסנן פליטה במסלול האדום (ארוכה לעבור> 610 ננומטר). לנתח מדגם התייחסות מוכן מתאי דיפלואידי אמיתי בעת ובעונה אחת כדי להעריך ploidy של התאים היעד.
    1. לחלופין, להוסיף חרוזים תקן הקרינה להעריך את יחס עוצמת הקרינה של תאים דיפלואידי מול חרוזים. השתמש 'גובה הדופק לעומת רוחב דופק' אפשרות של זרימת cytometer להפלות בין תאים tetraploid יחיד גושים של תאים דיפלואידי 11.

בחינת 4. רוזני כרומוזום וניתוח קריוטיפ

הערה: כל אלה הם הליכים ומבוססים מדריך טכני או הפרוטוקולים של היצרן יש להפנות עבור נהלים מפורטים ועצות טכניות.

  1. פנקו את התאים גדל באופן אקספוננציאלי עם 0.1 מיקרוגרם / מ"ל ​​DC עבור 4 שעות לעצור תאים metaphase.
  2. כן שקופיות כרומוזום.
      5 תאים) על ידי trypsinization ו להשעות במדיום המכיל FBS.
    1. צנטריפוגה תאים במדיום (300 XG, 5 דק ') ולטפל עם פתרון hypotonic (5 מ"ל של 0.075 KCl M) על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. תיקון ו להשעות תאים המקבעים של Carnoy (מתנול: חומצה אצטית = 3: 1).
    3. מורחים תאים על גבי זכוכית נושאת על ידי הטלת בנפח קטן (25 - 35 μL) של ההשעיה תא. צעדים נוספים כמו חשיפת אדים חמים עשויים להיות נחוצים כדי לשפר את כרומוזום מתפשטים.
  3. כתם תאים עבור ספירת כרומוזום או ניתוח קריוטיפ או קרינת ססגוניות הכלאה באתרו (mFISH).
    1. ספירת כרומוזום.
      1. הכתם התאים עם 5% Giemsa פתרון (או 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​לצרכן המכיל 0.5 מ"ג / A מ"ל RNase עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי) במשך 15 - 20 דקות.
      2. דיגיטלי לצלם לפחות 50 תאי metaphase.
      3. ספירת מספר כרומוזום לכל תא באמצעות Softwa ניתוח תמונהמחדש לאחר הפרדה ידנית של נגיעת חופפים הכרומוזומים באמצעות תוכנה לעריכת תמונות. למרות מספר כרומוזום יכול להיות בקיע באופן ידני, בקיע ממוחשב מומלץ.
    2. ניתוח קריוטיפ
      הערה: ניתוח זה צריך להתבצע על ידי טכנאי מיומן או חברה מקצועית.
      1. תאים כתמים על פי טכניקת G-banding תקן 12.
      2. לנתח הכרומוזומים לעשות karyograms תקן 12.
    3. mFISH
      הערה: שלב זה הוא אופציונלי צריך להתבצע במידת הצורך.
      1. תאי כתם באמצעות בדיקות FISH ססגוניות עבור כרומוזומים אנושיים על פי הפרוטוקול של היצרן 13.
      2. לנתח הכרומוזומים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסננים מתאימים תוכנה לניתוח mFISH 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מניסיוננו, תאים TIG-1 יכול להתבצע כמעט tetraploid לחלוטין על ידי טיפול רציף פשוט עם 0.1 מיקרוגרם / מ"ל DC במשך 4 ימים (איור 2 א). לעומת זאת, זנים פיברובלסטים אחרים, כגון ב"ג או IMR-90, ותאי TIG-HT, הפכו תערובת של דיפלואידי ואוכלוסיות tetraploid הבאים אותו הטיפול, ובידוד של תאי mitotic בשיטה שייק פעמי יש צורך במהלך טיפול DC (בדרך כלל 16 - 18 שעות לאחר תחילת הטיפול) (2B הדמוי, C). לאחר טיפול נוסף עם DC במשך 3 ימים, תאים שעברו דום צמיחה והציגו גדול, שטוח מורפולוגיה במשך כמה ימים. בתוך שבוע בכלל, תאי מתרבים קטנים הופיעו בין התאים הגדולים והשטוחים (איור 3). תאים הפכו כמעט לחלוטין tetraploid ב 2 - 3 שבועות לאחר טיפול DC. מספר כרומוזום מודאלית בתאי tetraploid הוקמו היה 92 ברוב המקרים, except שאחד שורות תאי tetraploid הוקמו מתאי TIG-HT היה 91 כרומוזומים ברוב המכריע של תאים (איור 4). תאי tetraploid הוקמו גדלו כמעט באותו הקצב כמו תאי דיפלואידי (איור 5). שורות תאי tetraploid הוקמו מתאים הלא הנציחו הראה אורך חיים בשכפול הדנ"א שווה בערך כמו חזקת תאי דיפלואידי המקורי, בעוד אלה מתאי הנציח נראה גם אלמוות (איור 5). תאי tetraploid הוקמו מתאי TIG-1 הלא הנציחו הראו קריוטיפ נורמלי פרט שיש מספר כרומוזום tetraploid (איור 6 פנל עליון), בעוד שאלו מן TIG-1 הנציח (TIG-HT) הראו תאים דווקא סטיות המשובטים מסובכות (איור 6 באמצע לוחות תחתונים). תדירויות סטיות המשובטים בתאים האחרונים (TIG-HT-4n) עלו מ 2.5 סטיות לכל תא ב 255 רמות הכפלת אוכלוסייה (PDLs) ל -5.2 סטיות לכל תא ב -450 PDLעם תת חזר.

איור 1
איור 1: איור סכמטי של פרוטוקול האינדוקציה של Tetraploidy. כדי להשיג תאים tetraploid עם זיהום מינימלי של תאי דיפלואידי, שילוב של שייק פעמי mitotic וטיפול DC הכרחי זנים סלולריים ביותר (איור נמוך), ואילו זנים תא מסוים (למשל ב TIG-1) יכול להיות כמעט tetraploid לחלוטין על ידי טיפול רציף עם demecolcine (איור העליון). 1) פנק תאי צלוחיות T75 (לפחות 5 x 10 6) עם 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר DC עבור 16 - 18 שעות (הפעם צריך להיקבע על ידי ניסויים ראשוניים) לעצור תאי מיטוזה. 2) איסוף תאי mitotic בשיטה ניעורה לסרוגין reseed לתוך 60 מנות מ"מ תרבות. 3) לטפל בתאים עם 0.1 מיקרוגרם / מ"ל ​​DC עבור 3 ימים נוספים. 4) דגירת תאים בינוניים נקיים מסמים (בדרך כלל תאים לחדש proliferation בתוך 1 בשבוע). ברי סולם מייצגים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: DNA היסטוגרמות של פיברובלסטים לפני ואחרי טיפולים לזירוז של Tetraploidy. (א) תאים TIG-1. זן תא זה הופך tetraploid ידי טיפול רציף פשוט עם 0.1 מיקרוגרם / מ"ל ​​DC במשך 4 ימים. (ב) בתאים ב"ג. בגלל המתח בתא הזה הופך תערובת של אוכלוסיות דיפלואידי ו tetraploid לאחר טיפול פשוט עם DC (פאנלים משמאל), בידוד של תאים mitotic ידי מנערים יש צורך במהלך הטיפול DC להקים תאים tetraploid (לוחות מימין). (C) TIG-HT (טלומרז-הנציח TIG-1) תאים. תאים אלה צריכים גם להיות מוכנים על ידי מסרק ination טיפול DC ולנער פעמיים עבור הקמת תאי tetraploid. ספרות ב היסטוגרמות מייצגת את הזמן (ימים) לאחר הסרת תרופה. Abscissa מייצג תוכן DNA (C, שלם). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 3: Photomicrographs נציג של ב"ג תאים שטופלו DC. (א) ב"ג בתאים שטופלו 0.1 מיקרוגרם / מ"ל DC עבור 16 שעות. תאים רבים נעצרו מיטוזה ניתן לראות. (ב) בתום הטיפול DC. כמעט כל התאים-נעצרו צמיחה. (ג) 7 ימים לאחר טיפול DC. ניתן לראות תאים מתרבים קטנים בין תאים גדולים ושטוחים. (D) 14 ימים לאחר טיפול DC. תאים הם ומתרחבים. e.com/files/ftp_upload/55028/55028fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 4: Photomicrographs נציג של כרומוזומים היסטוגרמות של מספר כרומוזום עבור תאי tetraploid הוקמו מכל זני Cell. למעלה, לוחות ביניים ותחתונים מייצגים תאי tetraploid הוקמו מתוך TIG-1 (2 שבועות לאחר טיפול DC), BJ (2 שבועות לאחר טיפול DC) ו TIG-HT (7 שבועות לאחר טיפול DC) תאי בהתאמה. כרומוזומים דורגו ב לפחות 50 metaphases. הספרות ב היסטוגרמות הן מספר כרומוזום מודאלית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ftp_upload / 55,028 / 55028fig5.jpg "/>
איור 5: פרופילי צמיחת נציג של פיברובלסטים אדם (תאי דיפלואידי) ותאי tetraploid הוקמו מכל זני Cell. שמאל, מרכז לוחות מימין להראות פרופילי צמיחה של המקורי TIG-1, ב"ג ו TIG-HT תאים (סמנים פתוחים) לבין אלה של תאי tetraploid הוקמו מתוך כל זן תא (סגורי סמנים). התאים היו passaged פעמיים בשבוע PDLs חושבו מתוך מספרים סלולריים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: נציג Karyograms ידי G-banding ו mFISH. פנל עליון מראה karyogram ידי G-banding של תאי tetraploid הוקמו מתוך TIG-1 (2 שבועות לאחר טיפול DC). לוחות תיכונים ותחתונים להראותkaryograms ידי mFISH עבור תאי tetraploid הוקמו מתאי TIG-HT (15 ו -41 שבועות לאחר טיפול DC). קריוטיפ התבססו על 10 תאים (TIG-1) או 20 תאים (TIG-HT). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אחת הבעיות העיקריות אינדוקציה של tetraploidy מתאי דיפלואידי ידי חומרים כימיים, בין אם על ידי מעכבי cytokinesis או על ידי מעכבי ציר, הוא שתאי הופכים לרוב תערובת של אוכלוסיות דיפלואידי ו tetraploid, ותאי tetraploid יש להפריד בין תאי דיפלואידי. רוב הגישות הנפוצות לבידוד תרמי של אוכלוסייה tetraploid ללא תאים דיפלואידי להשתמש FACS או שיבוט על ידי הגבלת דילול. עם זאת, נהלים אלה הם מייגע ולא קלים לביצוע. בדו"ח זה, אנו מציגים פרוטוקול חדש להקים תאים tetraploid שגשוג ללא אוכלוסייה דיפלואידי מן fibroblasts אדם נורמלי. הפרוטוקול משתמש DC רעל ציר מעצר תאי דיפלואידי ב מיטוזה, ועוצר תאי mitotic מופרדים על ידי רועדת פעמית מתאי ביניים דיפלואידי, אשר מודבקים על משטח הצלחת. תאים שנאספו מטופלים עם DC עבור 3 ימים נוספים, ותאי mitotic דיפלואידי להמיר תאי G1 tetraploid ידי טיפול DC ממושך זו ככל הנראה בהסתגלות מחסום y (המכונה גם זליגה mitotic). תאים אלה מחדש צמיחת תאים כמו תאי tetraploid לאחר מעצרו הצמיחה במשך כמה ימים של הסרת התרופה.

היתרון של שיטה זו הוא כי הנהלים הם פשוט יחסית ריאלי בהשוואה לאלו העסקת FACS או שיבוט לבודד תאים tetraploid. מגבלות השיטה הן כדלקמן. תחולה על סוגי תאים אחרים מאשר פיברובלסטים, כגון תאי אפיתל, אינה ידועה כרגע. זה חייב להיות מאושר במחקרים עתידיים. אוכלוסיית דיפלואידי קטנה עשויה להישאר בחלק ממקרים. עם זאת, תאים אלה נוטים להצטמצם עם passaging סדר. אם אוכלוסיה דיפלואידי משמעותי נמשכת לאחר טיפול DC, ריכוז גבוה של DC (1.2 - 1.5 מיקרוגרם / מ"ל) או טיפול ארוך יותר עם DC אחרי שייק פעמי (4 ימים במקום 3 ימים) עשוי לשפר את התוצאה.

השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם כדלקמן. ראשית, זמן טיפול עם DC עבורrresting התאים מיטוזה לפני פעמי שייק הוא קריטי. למרות זמן טיפול זה צריך להיות מספיק זמן כדי לאסוף כמה שיותר תאי mitotic ככל האפשר, בטיפול במשך זמן רב מדי עלול לגרום חלקת mitotic הידבקות אל פני שטח הצלחת, כך שלא ניתן לאסוף את תאי mitotic ידי מנערים. בגלל זמן מתאים עבור ההתאוששות מקסימלית של תאי mitotic יכול להיות תלוי בתאי המטרה, זה צריך להיקבע על ידי ניסויים ראשוניים. שנית, הצעד מנערים להפריד תאים mitotic מן שלבי תאים הוא גם קריטי. בשלב זה, התאים mitotic דיפלואידי, אשר הם דבקו באופן רופף על משטח צלחת, נאספים על ידי רעד עדין של צלוחיות ואחריו צנטריפוגה. שייק פעמי mitotic זה מפריד תאים mitotic נעצר על ידי DC מתאי הביניים דבק שעשוי להיות המקור של זיהום על ידי האוכלוסייה דיפלואידי מאוחר יותר. טלטול אלים עלול לגרום מבעבע של המדיום, אשר עלול לגרום נזק לתאים, וגם ניתוק של תאים שלבי הביניים, resulting לזיהום של תאי דיפלואידי. גורם נוסף שעשוי להשפיע על ההצלחה של שיטה זו הוא המדיום לתרבות. בגלל גירוי צמיחה איתן נראה הכרחי להתאוששות של התפשטות לאחר טיפול DC, בינוני עשיר מזין כגון MEM-α צריך לשמש כדי לתמוך תרבות תאי tetraploid. הגדלת ריכוז FBS ל -20% על השלב האחרון של אינדוקציה של תאי tetraploid (2.2.5) עשויה גם להגדיל את ההצלחה של שיטה זו.

שימוש בפרוטוקול זה, יש לנו עד כה פיק תאי tetraploid מן הזנים פיברובלסטים אדם TIG-1, ב"ג, IMR-90 ו טלומרז-הנציח TIG-1 עד עכשיו 14-16. בין זני תאים אלה, TIG-1 הוא חריג למדי בגלל המתח בתא הזה הופך כמעט tetraploid לחלוטין כאשר טופלו באופן רציף עם DC, ללא רעידות-off, במשך 4 ימים. הסיבה יחידת תאי TIG-1 להיות tetraploid כליל כתוצאה של טיפול פשוט עם DC אינה ידועה כיום. expla האפשריתמדינות יכולות להיות כי חלק ניכר של תאי מעצרי סוגים אחרים בשלב דיפלואידי G1 כאשר טופלו DC ומחדשת התפשטות לאחר טיפול, ואילו (1) התאים TIG-1 לא עוצרים ב G1 עם אותו הטיפול, או (2) אוכלוסיית תאים TIG-1 עוצר באופן בלתי הפיך ב G1 תחת אותו טיפול ואינו לחדש התפשטות לאחריו. בכל מקרה, רגישויות שונות של מחסום G1 ל DC עשויות להיות אחראיות על ההתנהגויות השונות של התאים לאחר טיפול רציף עם DC.

כאשר חוקרים את המשמעות אטיולוגי של tetraploidy ב tumorigenesis, חוקרים רבים יש חששות גדולים לגבי מעמדם של גן p53 בתאי tetraploid, כי זה הוצע כי tetraploidy גורם מעצר צמיחה תלוי p53 של תאים, אשר נקרא "מחסום tetraploidy" 17-20. אם השערה זו נכונה, p53 איתות מתרבים התאים tetraploid צריך להיות מובטל. למרות זאת,תאי tetraploid הוקמו על ידי הפרוטוקול שלנו נראים שיש p53 התפקודית למרות גדל כמעט באותו הקצב כמו תאי דיפלואידי 15,16. הסיבה לפער זה אינו ידוע כיום, והמשמעות של איון p53 ב התפשטות של תאים tetraploid יש לבחון בדיוק במחקרים עתידיים. למעשה, הנוכחות של מחסום tetraploidy שמתפקד באמצעות p53 נשאר 21-23 במחלוקת.

למרות שתאי polyploid nontransformed שיכול להפיץ במבחנה חיוניים ניתוח מפורט של חוסר יציבות כרומוזומלית והפוטנציאל בשעור של תאים polyploid, תאים כאלה עד כה כמעט ולא היו בנמצא. הפרוטוקול שלנו מספק שיטה פשוטה ריאלית להקים תאי tetraploid שגשוג מן fibroblasts אדם נורמלי, אשר יכולה להיות דוגמנית שימושית לחקר המנגנונים המובילים לטרנספורמציה של תאים אנושיים polyploid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MEM-α Sigma-Aldrich M8042-500ML
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4174
FBS Sigma-Aldrich 172012-500ML
Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) Sigma-Aldrich D1925-10ML
BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits BD Biosciences #340242 For examination of DNA ploidy by flow cytometry
Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte MetaSystems #D-0125-060-DI Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary
Isis imaging system with mFISH  software  MetaSystems Specialized probe kit is necessary

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
  2. Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67 (2007).
  3. Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
  4. Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
  5. Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
  6. Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
  7. Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
  8. Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
  9. Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
  10. Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
  11. Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5 (2001).
  12. Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
  13. Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
  14. Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
  15. Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198 (2013).
  16. Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
  17. Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
  18. Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
  19. Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
  20. Aylon, Y., Oren, M. p53: Guardian of ploidy. Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).
  21. Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint". J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
  22. Ganem, N., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131, 437-440 (2007).
  23. Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 119 polyploidy tetraploidy פיברובלסטים תאים אנושיים מחזור התא חוסר יציבות כרומוזומלית
הקמת תאי tetraploid Proliferative מ Nontransformed אדם פיברובלסטים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohshima, S., Seyama, A.… More

Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts. J. Vis. Exp. (119), e55028, doi:10.3791/55028 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter