Intracarotídeo injeção de células de cancer para produzir mouse modelos de metástases cerebrais

Resumo

Metástases cerebrais tornou-se uma necessidade médica não atendida urgente como a sua incidência tem aumentado enquanto as opções terapêuticas têm permanecido paliativos. Criando modelos animais experimentais de metástase cerebral através de injecção arterial intracarotídeo de células cancerosas facilita estudos sobre os mecanismos da biologia da doença e avaliação de novos regimes de intervenção.

Resumo

Metástase, a propagação e crescimento de células malignas em locais secundários dentro do corpo do paciente, representa> 90% da mortalidade relacionada ao câncer. Recentemente, avanços impressionantes em novas terapias têm prolongado significativamente a sobrevivência e melhor qualidade de vida para muitos pacientes com câncer. Infelizmente, a incidência de cérebro recorrências metastáticas está a aumentar rapidamente, e todas as terapias atuais são apenas paliativos. Assim, bons modelos animais experimentais são urgentemente necessárias para facilitar os estudos em profundidade da biologia da doença e avaliar novos regimes terapêuticos para a avaliação pré-clínica. No entanto, o padrão no ensaio de metástases in vivo por via de injecção na veia da cauda de células cancerosas produz predominantemente lesões metastáticas do pulmão; animais costumam sucumbir à carga tumoral pulmonar antes de qualquer crescimento significativo de metástases cerebrais. Intracardíaca injecção de células tumorais produz lesões metastáticas para locais múltiplos órgãos, incluindo o cérebro; No entanto, o variabidade do crescimento do tumor produzidos com este modelo é grande, amortecendo a sua utilidade na avaliação de eficácia terapêutica. Para gerar modelos animais fiáveis e consistentes para o estudo metástase cerebral, aqui descrevemos um procedimento para produzir metástase cerebral experimental na casa do rato (Mus musculus) através de injecção intracarotídeo de células tumorais. Esta abordagem permite que se produzem grande número de ratos metástase de sustentação do cérebro com características de crescimento e mortalidade semelhantes, facilitando assim os esforços de investigação para estudar mecanismos biológicos básicos e avaliar novos agentes terapêuticos.

Introdução

A metástase do cancro para o sistema nervoso central (SNC) é uma doença devastadora, e pode envolver o parênquima cerebral ou as leptomeninges ( "metástase cerebral" refere-se tanto neste artigo). É o tumor maligno intracraniana predominante, ultrapassando gliomas primários por> 10: 1 ^{1, 2.} O câncer de pulmão, câncer de mama e melanoma são as principais três principais doenças neoplásicas que produzem alta incidência de metástases cerebrais ^{3, 4.} Nos últimos anos, avanços impressionantes em novas terapias contra o câncer ter prolongado drasticamente a sobrevivência ea melhoria da qualidade de vida de muitos pacientes com câncer. No entanto, após recorrência, a incidência de metástase cerebral está a aumentar rapidamente. Por exemplo, o trastuzumab anticorpo anti-HER2 (Herceptin) demonstrou eficácia clínica significativa em pacientes com cancro da mama HER2 +; ainda uma tendência preocupante surgiunestes doentes: até 1/3 daqueles cuja doença sistêmica extracraniana inicialmente beneficiou de tratamento trastuzumab mais tarde desenvolver metástases cerebrais ^{5, 6, 7.} Infelizmente, os pacientes com metástases cerebrais são refratários a quase todos os tratamentos atuais, geralmente experimentando uma deterioração traumática da qualidade de vida, e sua sobrevivência de um ano após o diagnóstico é apenas ~ 20% ^8. As terapias atuais para metástases cerebrais (incluindo esteróides, radioterapia craniana e ressecção cirúrgica em pacientes selecionados) são meramente paliativas, não curativa ^9. Portanto, metástase cerebral está a emergir como o próximo desafio imponente nesta era de novas terapias contra o câncer. Para enfrentar o desafio não satisfeitas pacientes enfrentam todos os dias na clínica, precisamos urgentemente para entender melhor o mecanismo subjacente de metástase cerebral e usar esse conhecimento para desenvolver novas terapias.

colonização bem sucedida do cérebro por células de cancro metastáticas requer execução de uma série de funções mediadas pela interacção complexa de múltiplos jogadores biológicos, tais como o desvio da barreira hematoencefálica (BHE) e escapar a partir do cérebro do intrínseca mecanismos de defesa do sistema imunológico ^10, nenhum dos quais se condensa em um ex vivo ou in vitro sistema. Assim, adequada e fiel em modelos in vivo são fundamentais para estudos de metástase cerebral. Um ensaio in vivo convencional metástase introduz células cancerosas por via de injecção na veia da cauda, o que leva a maioria das células para se alojar no pulmão. Lesões metastáticas cerebrais raramente são produzidos nestes modelos animais antes da morte causada pela carga de tumor nos pulmões ^11. injecção intracerebral directa de células de cancro produz desenvolvimento de tumor consistente no SNC e é amplamente utilizada nos estudos de gliomas primárias. No entanto, such injecção compromete a certificação e provoca lesão traumática no local da injeção, ambos principais pontos de preocupação quanto à relevância fisiológica deste modelo. Outra via introdução de células de câncer freqüentemente usado, injeção intracardíaca, é fácil de administrar e não produz metástase experimental para o SNC. No entanto, as metástases simultâneas para outros do que o CNS sites de órgãos são sempre produzidos e pode causar a mortalidade de animais ^11; por conseguinte, o elevado grau de variabilidade deste modelo torna-o inadequado para a avaliação quantitativa dos mecanismos biológicos ou agentes terapêuticos, com um número limitado de animais.

Aqui nós descrevemos os procedimentos para produzir metástase cerebral experimental através da injeção de células cancerígenas na artéria carótida comum. Nós temos usado essa abordagem para dissecar as contribuições dos genes individuais para a cascata metastática de metástases cerebrais e para avaliar a eficácia da intervenção terapêuticas ^{12, 13.} As principais vantagens desta abordagem são o elevado grau de reprodutibilidade e de baixo grau de variabilidade; A maior desvantagem é a sofisticação e habilidade necessário para executar a microcirurgia.

Protocolo

declaração de ética: Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center.

1. Prepare células cancerosas para Injection

1. Semear as células cancerosas um ou dois dias antes da injecção. Use meio DMEM / F12 suplementado com 10% FBS, a menos que uma forma especializada é indicada na literatura para uma linha de células particular.
2. No dia da intervenção cirúrgica, as células da colheita quando atingem 70-80% de confluência, em primeiro lugar a lavagem com meio isento de soro, uma vez antes de tripsinização (0,25%) de 1 - 2 minutos a 37 ° C. Adicionar em células 10% FBS contendo DMEM media / F12 para saciar a tripsina 0,25%.
3. Centrifugar as células a 80 x g durante 3 min. Lave as células em meio isento de soro duas vezes para remover o soro residual, a contagem das células com um hemocitómetro e re-suspender em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) a 1 - 5 x 10 ⁶ células / ml, dependendo da linha celular. Manter em geloaté ao momento da injecção.
   NOTA: MDA-MB-231 de cancro da mama e células de melanoma K1735 foram utilizados neste estudo, e ambas as linhas de células foram usadas em 2 × 10 ⁶ células / ml de concentração. Manter a duração tripsinização tão curto quanto possível, como sobretratamento pode influenciar os resultados de ensaios de metástase.

2. Prepare Mice para Tumor injeção de células

1. Anestesiar ratos por injecção intraperitoneal (ip) de cetamina / xilazina cocktail (cetamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg).
2. Confirmar anestesia completa por beliscar os pés animais e observar falta de resposta.
3. Posicione o mouse sobre uma placa de vidro (usado para a fundição de géis de proteína), e prenda com elásticos.
4. Se necessário, remover os pêlos do pescoço raspando ou aplicar uma pequena quantidade de produto de depilação e limpando o cabelo fora com toalha de papel. NOTA: Se estiver usando ratinhos nus, ignore este passo como eles não têm pêlos do corpo.
5. Limpe a pele do pescoço, aplicandoiodopovidona e álcool a 70%.
6. Coloque o mouse no palco do microscópio de dissecação
7. Realizar uma incisão na pele ~ 1 cm de comprimento com um bisturi cirúrgico.
8. Bluntly dissecar o músculo com pinças dentadas para expor a artéria carótida por baixo.
9. Separar a artéria carótida do nervo vago adjacente com pinça cirúrgica.
10. Utilizando uma pinça cirúrgica, separe um pouco de algodão de uma bola de algodão, umedeça e moda em uma bola de algodão menor. Coloque esta bola de algodão hidratada-buffer debaixo da artéria carótida do local pretendido da injeção.
11. Coloque um distal sutura e proximal à bola de algodão e fazer nós soltos. Apertar o nó proximal para bloquear o fluxo sanguíneo para o local de injecção.
12. Prossiga para a injeção de células de câncer se a artéria carótida na bola de algodão parece totalmente pressurizada com sangue vermelha fresca.

Injeção celular 3. Cancer em Carótida

1. Vortex e desenhar 100 ul océlulas cancerosas f para a seringa.
2. Sob o microscópio de dissecação, lentamente inserir a agulha 31 G (com bisel para cima) para dentro do lúmen da artéria carótida senta-se sobre a bola de algodão.
3. Lentamente injectar as células a partir da seringa para dentro da artéria carótida. injecção bem sucedida pode ser observada sob o microscópio através da mudança de cor dos vasos sanguíneos mais próximos e musculatura quando células cancerosas tamponadas são empurrados para a circulação.
4. Quando a injecção de todo o volume é completa, levantar a artéria carótida distai suavemente para evitar a regurgitação.
5. Rapidamente apertar o nó distal para completar o processo de injecção.
6. Depois de completar a injecção, aperte as ligaduras e aparar o excesso de fio de seda com micro-tesoura sob o microscópio de dissecação. Mover para trás o músculo separadas para cobrir o local da ferida. Feche a pele com dois grampos.

4. A recuperação cirúrgica

1. Mova o animal operado em uma almofada de aquecimentopara recuperar. Pode demorar 30 - 60 min para os animais a recuperar a consciência. No entanto, administrar buprenorfina (0,05 mg / kg) via injecção subcutânea como analgesia pós-cirúrgica. Nota: Analgesia devem ser fornecidos de acordo com o seu IACUC local aprovou o protocolo.
2. Uma vez que os animais despertar e retomar o seu comportamento normal, retornar os ratos para o seu local de moradia. Fornecer os ratos com comida gel durante vários dias pós-cirurgia. Mantenha um registro cirúrgico e mantê-lo no quarto.

5. Non-invasive In vivo de imagens

1. Para as células marcadas com construções repórter de luciferase, medir a eficiência da injecção de células de cancro utilizando em sistema de imagem in vivo ^14.
   NOTA: A imagiologia não é realizada no dia da injecção para evitar tensões excessivas para animais de pesquisa.

Resultados

Existem dois pontos em que a qualidade da injecção podem ser avaliadas. A primeira chance é pela observação do operador de mudar as cores dos vasos sanguíneos durante a injeção. Vazamento de injeções pobres pode ser facilmente observado sob o microscópio de dissecação. A colocação firme e segura do corpo do ratinho (Figura 1A) e da sua artéria carótida (Figura 1B) sobre a bola de algodão de suporte são factores críticos para injecção suave e bem sucedida...

Discussão

Os passos mais críticos para injecção arterial da carótida bem sucedida de células de cancro são: 1) anestesia profunda de rato, em preparação para a operação cirúrgica; 2) colocação constante de artéria carótida em cima do suporte de algodão; 3) a ligação apertada da artéria carótida após a injecção bem sucedida.

anestesia profunda de ~ 30 min é normalmente necessário para o desempenho cirúrgico estável sob o microscópio de dissecação. Usamos cocktail de cetamina / xilazina comercialmente r...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de cloridrato de cetamina/cloridrato de xilazina	Sigma-Aldrich	K113
Leica M50	Leica	M50	O microscópio é modular e altamente configurável para atender a requisitos de espaço específicos.
Escapo cirúrgico descartável	Integra Miltex	4-410	para fazer incisões na pele
Fórceps de Tecido - 1 x 2 Dentes	Ferramentas Fine Science	11021-12	para dissecar sem rodeios os mucos
Dumont #5 - Fórceps com Acabamento Espelhado	Ferramentas Fine Science	11252-23	para separar e preparar a artéria carótida para injeção
Tesoura de Mola	Ferramentas Fine Science	15025-10	para cortar suturas
EZ Clip Kit	Stoelting	59020	para cloure de ferida
Seringa de insulina BD	Becton Dickinson	328438	para injeção de células
Sistema de imagem IVIS Spectrum In Vivo	PerkinElmer	124262

Estereomicroscópio de rotina