Open Source Análise alta Conteúdo Utilizando Automated microscopia de fluorescência Lifetime Imagiologia

Summary

Nós apresentamos uma análise (HCA) instrumento de alto conteúdo open source utilizando imagens de fluorescência vida automatizado (FLIM) para ensaiar interações proteína usando Förster transferência de energia de ressonância (FRET) leituras base. Aquisição de dados para este instrumento openFLIM-HCA é controlada por software escrito em μManager e análise de dados é realizado em FLIMfit.

Abstract

Apresentamos um instrumento de análise de alto conteúdo de código aberto utilizando imagens automatizadas de tempo de vida de fluorescência (FLIM) para testar interações de proteínas usando leituras baseadas em transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) de células fixas ou vivas em placas multipoços. Isso fornece um meio de rastrear processos de sinalização celular lidos usando biossensores FRET intramoleculares ou FRET intermoleculares de interações proteicas, como oligomerização ou heterodimerização, que podem ser usados para identificar parceiros de ligação. Descrevemos aqui a funcionalidade desta instrumentação FLIM automatizada de placas multipoços e apresentamos dados exemplares de nossos estudos de oligomerização da proteína HIV Gag e um curso de tempo de um biossensor FRET em células vivas. Uma descrição detalhada da implementação prática é fornecida com referência a uma lista de componentes de hardware e uma descrição do software de aquisição de dados de código aberto escrito no μManager. A aplicação do FLIMfit, um cliente baseado em MATLAB de código aberto para a plataforma OMERO, para analisar matrizes de dados FLIM de placas multipoços também é apresentada. Os protocolos para imagens de células fixas e vivas são delineados e uma demonstração de um experimento FLIM automatizado de placa multipoços usando células que expressam construções FRET baseadas em proteínas fluorescentes é apresentada. Isso é complementado por um passo a passo da análise de dados para este conjunto de dados FLIM FRET específico.

Introduction

O uso crescente de alta análise de conteúdo automatizado (HCA) na descoberta de medicamentos ¹ a bibliotecas de compostos de ensaio é complementada pela evolução das ciências da vida investigação de base no sentido de experimentos de imagem automáticos de estudos sistemáticos, por exemplo, para telas fenotípicas de bibliotecas de siRNA. HCA automatizada também está se tornando cada vez mais importante para os estudos de menor escala biológica que normalmente têm sido implementados com experimentos manuais com dezenas de pratos de células fotografada com microscópios convencionais. O poder estatístico conferido pela capacidade de testar e analisar centenas a milhares de campos de visão permite a média do ruído experimental (incluindo o "ruído biológico") e a automação de aquisição e análise de grandes conjuntos de amostras de dados de imagem pode ajudar a eliminar o preconceito de operador e, muitas vezes pode ser utilizada para detectar a ocorrência de erros sistemáticos, tais como uma alteração no perfil de IRF durante uma aquisição. ensaios de fluorescência baseadasão amplamente implementados em HCA, com mais comercialmente disponíveis instrumentação HCA caracteriza imagiologia de fluorescência de intensidade em um ou mais canais espectrais para mapear a distribuição relativa e de co-localização de proteínas marcadas. Modalidades de imagem de fluorescência mais sofisticadas, como imagens de fluorescência vida (FLIM), imagiologia anisotropia de polarização e imagens de fluorescência anisotropia resolvida no tempo, não são amplamente explorados em instrumentos HCA comerciais, embora eles oferecem poderosas leituras quantitativos, por exemplo, de interações proteína. Aqui apresentamos uma abordagem de fonte aberta para a implementação FLIM em um microscópio automatizado para HCA.

Fluorescência vida fornece uma leitura espectroscópica inerentemente raciométrica que podem ser usadas para distinguir as espécies moleculares diferentes ou para sondar o ambiente molecular local de um fluoróforo e é insensível à concentração de fluoróforo, a eficiência de excitação / detecção, e ao impacto de scatteanel e amostra de absorção ^2. Além disso, uma vez que as medições de fluorescência ao longo da vida pode ser feito num único canal espectral, são directamente comparáveis ​​entre os diferentes instrumentos e as amostras sem calibração. Eles podem ser aplicados a fluoróforos endógenos, incluindo alguns metabolitos celulares, lípidos e componentes da matriz extracelular, para fornecer leituras intrínsecas de processos biológicos e patologias. Assim FLIM livre rótulo pode mapear as alterações metabólicas em células de ^3,4 e foi aplicado para controlar a diferenciação de células estaminais ^5,6 e o crescimento de andaimes de colagénio ^7. Recentemente, demonstrou que FLIM HCA pode ser utilizado para ensaios livres de rótulo automatizados do metabolismo celular utilizando autofluorescência ^8. Mais comumente, no entanto, as medições de fluorescência ao longo da vida e FLIM são aplicadas a fluoróforos exógenos que rotulam biomoléculas específicas, muitas vezes implementado usando corantes que mancham compartimentos celulares, usando corantes acoplado a antibodies que alvejar proteínas específicas em células fixadas, ou fluoróforos usando expressão genética acoplados a proteínas específicas. tempo de vida de fluorescência pode ser utilizado para fornecer leituras quantitativas robustas de sondas fluorescentes detecção seu ambiente físico ou químico. Para exemplos, os corantes tenham sido implantado para detectar a fase lipídica local das membranas celulares ⁹ ou viscosidade da célula ¹⁰ e biossensores baseados em proteínas fluorescentes expressão genética têm sido desenvolvidos para relatar as concentrações de células moléculas de sinalização incluindo como IP3 ^11, PIP2 ¹² e calpaína ¹³ ou íons, como cálcio ^14,15, potássio e cloreto de ^{16 17.}

Muitos desses biossensores utilizar transferência ressonante de energia por fluorescência (FRET) ^18,19 para fornecer leituras de alterações na conformação biossensor. FRET entre "doadores" e fluoróforos "aceitador" ocorre através de um curto intervalo de interação dipolo-dipolo diretapara que os fluoróforos são tipicamente separados por menos de ~ 10 nm. Assim, a detecção de FRET indica a proximidade de proteínas devidamente rotulados e, portanto, fornece um meio para ler interações proteína-proteína ^20, tais como ligação ou oligomerização - como pontos finais em células fixas ou eventos como dinâmicas em medições de tempo de curso do vivo células. Ao classificar uma construção molecular apropriado com o dador e o aceitador fluoróforos, também é possível ler alterações conformacionais - ou clivagem - da construção através da mudança de FRET e esta é a base de muitos bio-sensores ^21. As medições da eficiência de TERF pode fornecer informações sobre a distância dador-aceitador e a fracção de população de dadores fluoróforos submetidos a FRET. Assim, as técnicas de imagiologia baseados em FRET pode ser utilizado para mapear e quantificar interacções moleculares no espaço e no tempo, por exemplo, para elucidar a sinalização celular processa ^22. Automáticoing essas técnicas de imagem poderia fornecer ensaios de alto rendimento com base em leituras de vias de sinalização ou redes.

Em HCA, a leitura de FRET mais comummente implementada é raciométrica imagiologia espectral, em que as alterações na razão entre a intensidade aceitador doador são mapeados. Enquanto esta abordagem é prontamente implementada - e está disponível em muitos leitores de placas com múltiplas cavidades disponíveis comercialmente - quantitativos medições FRET espectralmente resolvidos requerem calibração da resposta espectral do sistema ^23. Isto inclui a diafonia espectral resultantes de espectral a infiltração e excitação directa do aceitador, bem como as características de transmissão do instrumento e a amostra (efeito de filtro interno). Em princípio, isso implica a medição de amostras adicionais de "controle" que são rotulados com qualquer doador-only ou receptor-only.

A partir de tais medições espectrais raciométrica FRET, uma FRET eficazeficiência (o produto da eficiência real de FRET e fracção de moléculas dador / aceitador FRETing) pode ser obtido, juntamente com a proporção relativa das moléculas dadora e aceitadora ^24. FRET ratiometric Spectral é usado frequentemente com biossensores FRET unimolecular, onde a estequiometria doador / receptor podem ser assumidos para ser conhecido. Para determinar as fracções das populações de dador e aceitador FRETing, por exemplo, para obter uma curva de resposta à dose, o conhecimento da eficiência real de FRET é necessária. Isto pode ser obtido por medição de uma amostra de controlo positivo de FRET com propriedades conhecidas ou através da utilização de um método diferente para medir a eficiência de FRET, tal como aceitador de fotobranqueamento ou FLIM.

Usando leituras de fluorescência ao longo da vida, a FRET pode ser detectada e quantificada por meio de medições de emissão do dador sozinho - eliminando a necessidade de calibração espectral e outras amostras de controlo. Assim, leituras FLIM FRET pode ser comparado entre os instrumentose entre diferentes amostras - permitindo que os dados de endoscopia ou tomografia de modelos de doença em directo ²⁵ para ser aferido contra as medições de ensaios baseados em células. Ajustando perfis de decaimento doador de fluorescência a um modelo de decaimento multi-exponencial adequado correspondente ao FRETing e populações de dadores não-FRETing, FRET eficiências e frações da população pode, em princípio, ser obtidos diretamente sem as medições posteriores. Estas vantagens significativas, no entanto, vêm com o custo de FLIM exigindo fótons mais detectados por pixel de imagem intensidade espectralmente resolvido - geralmente centenas de fótons são necessários para atingir uma precisão na determinação do tempo de vida de 10%, quando apropriado para um único modelo de decaimento exponencial e quando perfis de fluorescência de decaimento de montagem para modelos complexos (degradação multiexponencial), o número de fótons detectados necessária aumenta para milhares de pessoas. Isto tem conduzido convencionalmente para tempos de aquisição longo (dezenas a centenas de segundos por campo de VIew) para FLIM, especialmente quando se utiliza o tempo correlacionados contagem de fóton único (TCSPC) implementado com a aquisição de pixel sequencial em microscópios de varredura a laser. As tentativas para aumentar a velocidade de imagem usando intensidades de excitação mais elevadas podem conduzir a fotodegradação e / ou fototoxicidade significativa. Juntamente com a falta de ferramentas de instrumentação e software disponíveis comercialmente apropriados, este tem dificultado FLIM de ser utilizado em HCA para a descoberta ou sistemas de drogas biologia, onde centenas de milhares de campos de visão estão a ser trabalhada. Varredura a laser TCSPC FLIM foi implementado em um microscópio placa com múltiplas cavidades automatizado ²⁶ para medições secundárias após a identificação de "hits" por steady-state resolvido-polarização imagens de fluorescência anisotropia ^27, que pode atingir velocidades de imagem semelhante à imagem raciométrica espectral ²⁸ com o qual compartilha muitas vantagens e desvantagens. imagiologia Anisotropia de fluorescência explora a diminuiçãoem anisotropia de fluorescência do aceitador na presença de FRET e também é sensível a conversa cruzada espectral (por exemplo, excitação directa do aceitador). Ele requer calibração para explicar conversas cruzadas polarização e não fornece uma medida direta da eficiência FRET.

Para perceber as vantagens de FLIM para HCA, temos trabalhado para resolver os problemas de velocidade de aquisição de imagem e maior acesso à tecnologia. Aqui, nós fornecemos uma lista completa de componentes de software de código e hardware abertos que podem ser utilizados para implementar o leitor FLIM rápida automatizada com vários poços placa que está descrito abaixo, juntamente com baseados em ensaios de FRET exemplar. Em nossa abordagem ^29, FLIM é realizado usando todo o campo de imagem fechado em tempo usando um fechado intensificador de imagem óptico (GOI), que é ilustrada na Figura 1, que pode fornecer taxas de imagem mais rápidas e menor fotodegradação do que de feixe único TCSPC digitalização devido à interr pixels paralelaogation. O nosso instrumento openFLIM-HCA pode fornecer FLIM sem supervisão, necessitando apenas de alguns segundos para adquirir dados de FLIM detectar alguns 100 fotões por pixel (dependendo do brilho da amostra). Combinado com o tempo necessário para mover a amostra do campo de vista anterior, para ajustar as configurações de aquisição e para manter a amostra no foco, isso normalmente resulta em tempos de aquisição placa de poços múltiplos de 10 ~ s por campo de visão ^25,28. Seccionamento óptica pode ser implementado usando um quasi-de campo amplo Nipkow ( "disco rotativo") do scanner ^30.

Para análise dos dados FLIM, desenvolvemos uma ferramenta de software de código aberto chamado FLIMfit ³¹ que é capaz de analisar rapidamente conjuntos de dados placa FLIM múltiplos poços em estações de trabalho de PC convencionais e é um plug-in para OMERO ^32. FLIMfit fornece capacidades de análise globais (discutido na Seção 1.2) que permitem dados FLIM a ser montados em modelos complexos com oomente alguns 100 fótons por pixel sob o pressuposto de que os componentes de fluorescência ao longo da vida são constantes ao longo de uma imagem ou região de interesse (ROI), reduzindo assim o número de fótons detectados necessário, a exposição à luz com o tempo de amostra e de aquisição de imagem. Correndo FLIMfit em um PC desktop padrão, requer apenas 10s de segundos de tempo computacional para analisar conjuntos de dados que compreendem centenas de FOVs. Assim, tanto a aquisição de dados FLIM e análise pode ser realizada em escalas de tempo que são práticas para HCA.

hardware openFLIM-HCA

Nossa implementação de HCA FLIM compreende seis componentes principais: (i) um quadro microscópio de fluorescência com autofocus óptico; (Ii) a (xyz) estágio do microscópio motorizado; (Iii) uma fonte de laser de excitação; (Iv) um sistema de FLIM fechado em tempo de campo amplo com intensificador fechado óptico (GOI), gerador de atraso e câmera; (V) um computador de aquisição de dados e análise e (vi) um scanner disco Nipkowunidade para geração de imagens opticamente seccionado para suprimir fora de foco de luz. Isso pode ser importante quando imagiologia sinais fracos, por exemplo, de biossensores FRET na membrana plasmática das células, que poderiam ser inundados por contribuições de fluorescência citoplasmática ou o fundo de lamelas ou meio de cultura. dados FLIM fechado em tempo é adquirido por iluminar a amostra com a radiação de excitação ultrashort pulsada, imagem da emissão de fluorescência para o fotocátodo do GI e aquisição de uma série de imagens CCD de fósforo do GI para uma variedade de configurações de tempo de atraso o portão intensificador óptica após a chegada dos impulsos de excitação. À medida que o atraso de porta de tempo seguinte de excitação é aumentado, o sinal de fluorescência é vista a diminuir e a série de imagens intensidade de fluorescência fechado em tempo adquiridos no CCD formar o conjunto de dados necessários para analisar os perfis de decaimento de todos os fluoróforos no campo de visão . A propagação do GI é sincronizada com os pulsos de excitaçãoe, para a série de aquisições CCD, o atraso da porta do tempo em relação aos impulsos de excitação é definida como um conjunto de valores a aumentar ao longo do intervalo desejado. Essa sincronização é conseguida usando o gerador de atraso que compreende uma "caixa rápido delay" (fornecimento de atrasos até 20 ns em passos de 1 PS) e uma "caixa de atraso grosso" que fornece atrasos com um passo mínimo de 25 ps.

Para FLIM, excitação pode ser fornecida por qualquer de laser ultra-rápida. Por conveniência, empregam tipicamente uma fonte de fibra supercontínuo bombeado por laser que fornece impulsos de picossegundo sintonizável em todo o espectro visível a partir da qual a radiação de excitação apropriada pode ser seleccionada para qualquer fluoróforo usando uma roda de filtro motorizado com diferentes filtros passa-banda. Normalmente, usamos uma potência média de ~ 100-200 mW na amostra com pulsos na taxa de repetição de 40 ou 60 MHz. Tais poderes de excitação também pode ser fornecida por fontes de laser ultra-rápidos baseados na duplicação da frequênciade modo bloqueado de titânio dopado com lasers de safira. Note-se que uma duração de pulso de excitação abaixo de 100 ~ ps é suficiente para a maioria das experiências. Uma segunda roda de filtro motorizado equipado com filtros de densidade neutra e é usado para regular a intensidade de excitação. Por razões de segurança e conveniência, a radiação de excitação pode ser entregue através de uma fibra óptica de modo simples. As configurações de FLIM de campo amplo e FLIM opticamente segmentado são apresentados nas Figuras 2 e 3, respectivamente. Para mais detalhes sobre os componentes usados precisas, visite o wiki openFLIM-HCA ^33. Uma cópia da lista de peças atual é dada no material suplementar.

Para FLIM de campo amplo, a radiação de excitação é necessária para iluminar todo o campo de vista tão uniformemente quanto possível. Para isso, dirigir o feixe de laser de excitação para um difusor holográfico "cartola" que é rodado a 10-50 Hz e a média de tempo de manchas de laser, com o plano da DIFfusor a ser trabalhada para o plano focal posterior da lente da objectiva de microscópio. A imagem de fluorescência a partir do porto do microscópio de saída é retransmitida para o fotocátodo do Governo da Índia e o fósforo de GOI (área ativa diagonal 18 mm) o é fotografada no sensor de CCD científica arrefecida (tamanho do chip 10,2 mm x 8,3 mm) câmera usando um par de lentes de câmeras que fornecem uma ampliação de 0,7. O sistema é controlado por um PC padrão que faz interface com a instrumentação usando protocolos RS232. Além disso, um microprocessador Arduino é utilizado para controlar um obturador no caminho da luz de excitação que é fechada, excepto quando a câmara CCD é a aquisição de dados FLIM e para gravar o sinal a partir de um fotodíodo que é usado para medir a potência média do supercontínuo espectralmente filtrada fonte de excitação. Para FLIM opticamente seccionado, a radiação laser de excitação é acoplado em uma fibra óptica monomodo polarização-manutenção que conecta diretamente para a unidade de digitalização disco de Nipkow, como shown na Figura 3. A imagem de fluorescência de saída a partir da unidade de digitalização Nipkow é retransmitida para o fotocátodo do GI e o resto do sistema é o mesmo como para FLIM de campo amplo.

software openFLIM-HCA

O software de aquisição de dados está escrito em μManager ^34. Ele oferece total HCA funcionalidade de aquisição de dados, incluindo opções para mudar a sequência em que os poços da placa são gravadas, para adquirir cursos de tempo para qualquer FOV, para manter automaticamente o foco durante as medições e controlar as rodas excitação e filtro de emissão e o trocador dicróicas para imagens de multicolor automatizado. É também possível executar uma aquisição "prédigitalização" de intensidade de fluorescência, a fim de identificar automaticamente e registar as posições dos FOVs adequados para uma aquisição de FLIM subsequente de acordo com critérios, por exemplo, com base na intensidade. dados HCA FLIM pode ser salvo como uma sériede arquivos TIFF, como uma série de arquivos OME-TIFF (ou seja, um por FOV) ou como um único arquivo OME-TIFF incorporando todos os dados a partir de uma placa com múltiplas cavidades. Mais informações e uma descrição detalhada do software μManager podem ser encontradas no wiki openFLIM-HCA ^33.

O software de análise de dados, FLIMfit ^31, um cliente de código aberto baseado em MATLAB para a imagem OMERO plataforma de gestão de dados ^32, é capaz de ler dados FLIM a partir de um servidor OMERO ou a partir do disco do computador, como indicado na Figura 4. Ele foi projetado para analisar dados de TCSPC ou instrumentos FLIM fechado em tempo de campo amplo e oferece muitos recursos para atender os dados de openFLIM-HCA incluindo a instalação de monoexponencial perfis de decaimento, e dobrar perfis de decaimento de complexidade exponencial e superiores, incluindo modelos como perfis de fluorescência de decaimento resolvido-polarização. Ele também pode ter em conta sinais de fundo fixos e variáveis ​​no tempo e pode UTIlize uma função medido espaço-temporal resposta do instrumento (IRF) ou pode caber usando um IRF idealizado que pode ser feita numa base de pixel-wise por um montante determinado a partir da medição IRF experimental completa deslocado no tempo. Uma diferença de tempo global (T ₀₎ entre o IRF e uma amostra fluorescente pode ser determinada a partir de uma medição de um padrão de fluorescência. As variações espaciais de sinais de fundo e de IRF também pode ser tida em conta. FLIMfit é capaz de ajustar os dados de FLIM em uma base de pixel-wise ou usando "binning global" ou "ajuste global" para facilitar o ajuste dos dados FLIM com modestos (centenas) fóton números para modelos de decaimento complexas.

Binning global implica agregar todos os fotões detectados a partir dos pixels dentro de uma ROI definida pelo utilizador em cada ponto de tempo para fornecer números de fótons suficientes para permitir a adaptação a modelos de decaimento complexas. O ROI pode ser todo o campo de visão (FOV), que pode ser manualmente defined pelo utilizador, ou pode ser determinada utilizando ferramentas de segmentação de imagem. O ROI também pode ser definida usando máscaras importados para FLIMfit de outro software de segmentação de imagens. Para aplicações de FRET, é comum o uso de binning mundial para atender a um modelo duplo decaimento exponencial para determinar os componentes de fluorescência de vida correspondentes a FRETing e dadores de fluor�oros não FRETing que são assumidos para ser espacialmente invariantes em todo o ROI e depois para recolocar em um base de pixel a gota com estes vales componentes Tempo de vida fixos, a fim de se obter a fracção da população FRETing doador em cada pixel.

Encaixe global implica encaixe simultaneamente os componentes da vida e frações da população FRETing doador de pixel-wise através de uma FOV- todo ou em um conjunto de dados FLIM que poderia incluir vários FOVs, por exemplo, a partir de um experimento placa com múltiplas cavidades ou uma série temporal de imagens de fluorescência ao longo da vida. montagem global é capaz de explorar o Variati espacialna de frações da população em toda a imagem que é perdido na abordagem binning global para fornecer restrições mais fortes sobre a estimativa de vida componente - e os resultados, portanto, mais confiável - embora à custa de muito mais computação ^35. FLIMfit pode rapidamente analisar conjuntos de dados placa FLIM múltiplos poços com encaixe mundial em estações de trabalho de PC convencionais com, por exemplo, um com vários poços conjunto de dados FLIM fechado em tempo, adquirida com cinco portais de tempo para cada um dos 394 FOV cada um compreendendo 672 x 512 pixels, exigindo apenas 32 segundo e 2 GB de memória para se ajustar a um modelo de decaimento exponencial dupla ^31. Isto foi conseguido através da utilização de um não-linear separável menos algoritmo de ajuste quadrado implementado usando algoritmos paralelos de vários segmentos para ativar a escala eficaz em processadores multicore e o código FLIMfit foi optimizado para minimizar o uso de memória. A Figura 5 mostra um instantâneo da interface gráfica do usuário de FLIMfite mais detalhes podem ser encontradas na página web dado em referência 36. Mais informações sobre a montagem global e binning global pode ser encontrado na referência 31.

O seguinte protocolo para HCA FLIM, usando o nosso instrumentação openFLIM-HCA e software pode ser adaptado para uma ampla gama de experimentos com imagens de células com leituras FLIM. Em geral, a placa com múltiplas cavidades FRET experiências deve ser concebido para incluir poços em replicado de controlos positivos e negativos biológicas para além das condições a ser estudada. Aqui, nós descrevemos a aplicação específica para executar FLIM opticamente seccionada (ver Figura 3) de células COS que exprimem a FRET construções que consiste da proteína fluorescente mTurquoise e proteína fluorescente Vénus unidos por um curto ligante peptídico. Aqui o mTq32V, mTq17V e mTq5V FRET construções (discutido na Seção Resultados representativos) proporcionará maior eficiência elevados FRET baixa, média e, juntamente com o não-FRETing mTq5A construir.Estas construções e outros materiais necessários para seguir este protocolo estão listados na Lista de Materiais.

Protocol

1. Preparação do Multiwell placa matriz

1. Prepara-se uma solução de 75 uM Cumarina 6 em etanol (t ~ 2,43 NS) para medições de referência para permitir a determinação de T _0.
2. Semente 150.000 células Cos em quatro poços de uma placa de 6 poços e deixa-se ligar durante a noite em meio de cultura (ver Lista de Materiais).
3. Transfectar uma bem cada uma com mTq5A, mTq5V, mTq17V e mTq32V usando um reagente de transfecção comercial de acordo com as instruções do fabricante e a cultura durante 24 h.
4. Retire células utilizando uma solução de tripsina / EDTA comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
5. Pipetar as células Cos 5.000 suspensos em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) que expressam mTq5A em cada um dos poços A1-G3 de uma placa de poços múltiplos 96 # 1.5 espessura com fundo de vidro, que tenha sido previamente tratada com poli-L-lisina. Repetir para mTq5V expressando células em poços A4-G6, em poços mTq17V A5-G9 e mTq32V em poços A10-G12.
6. Deixar bem H1 vazio (para medir de qualquer fundo estático da placa com múltiplas cavidades).
7. Pipetar 200 uL de HBSS única em H2 bem (para fornecer uma medição de qualquer sinal de fundo a partir do meio de cultura celular).
8. Pipeta 5.000 células não transf ectadas em HBSS em H3 bem (para fornecer uma medição de qualquer sinal de fundo a partir de autofluorescência celular).
9. Pipetar 200 mL da solução 75 uM de corante cumarina para bem H4 (para proporcionar um controlo sobre qualquer variação de t _0, durante a aquisição placa com múltiplas cavidades, por exemplo, devido a alterações na temperatura ambiente ou a flutuações em laser ou circuitos de temporização.

2. Aquisição de Dados openFLIM-HCA

NOTA: Informações detalhadas podem encontrado no wiki openFLIM-HCA ^33.

1. Iniciar μManager eo Plugin OpenFLIM-HCA
2. Selecione o arquivo de calibração para a combinação específica de unidade geradora de atraso etaxa de repetição do laser em "FLIM controle: Atraso arquivo de calibração caixa de: Arquivos de Calibração".
3. Definir a pasta onde os dados serão salvos em "Arquivo: Set Pasta Base".
4. Verificar o percurso do feixe de excitação para assegurar que o acoplamento na fibra óptica de entrega é estável e que a eficiência de acoplamento é maximizada através da medição de energia transmitida através da fibra de entrega utilizando um medidor de potência. As flutuações menores do que 5% são aceitáveis.
5. Verifique se o GOI disparo é estável, exibindo o sinal de saída do monitor do GOI em um osciloscópio desencadeada pelo sinal de disparo de entrada GOI.
6. Verifique a imagem do fósforo GOI para o sensor CCD, cobrindo o fotocátodo do GI, definindo o seu ganho para 750 V e concentrando-se a uma das lentes de retransmissão de tal forma que as imagens de eventos de fótons individuais esparsos (devido a luz de fundo vazamento embora a tampa GOI ) gravado no CCD são tão nítidas quanto possível.
7. Verifique se a amostracampo de visão é iluminada uniformemente por imagiologia de uma amostra fluorescente uniforme, tal como uma gota de solução de corante de referência sobre uma lamela, utilizando uma suficientemente baixa energia de excitação (<1 mW) para garantir que o GI não está saturado.
8. Selecione o arquivo de definição de placa adequado, ou seja, selecione a opção para placas de 96 poços ( "file: propriedades de carga da placa").
9. Usando o μManager GUI, assegurar que não há cubo separador de feixes dicróico no corpo do microscópio, seleccionando uma posição vazia.
10. selecionar manualmente uma largura de portão de 4 ns na GOI para todo o experimento.
11. Adquirir dados de imagem IRF:
    1. Usando o μManager GUI, garantir que não há nenhuma objetiva do microscópio no caminho do feixe, selecionando uma posição vazia. colocar manualmente um bloco feixe anodizado preto acima da torre da objetiva para evitar qualquer escape luz laser e ângulo para minimizar qualquer reflexão de volta para o corpo do microscópio.
    2. Usando o μManager GUI, configure os filtros na CSUX (Excitação, Dichroic, Emissão) de tal modo que a fração de luz de excitação dispersa a partir do disco de Nipkow fiação pode ser trabalhada, mas garantir a intensidade não é suficiente para saturar o sistema para um 200 MS CCD tempo de integração. Isso é para evitar a exposição da fotocatodo GOI a muita luz, o que poderia danificar o fotocátodo.
    3. Use a função Find MaxPoint em toda a gama dos atrasos abrangidos pela caixa de atraso rápido programável. Consulte o diagrama da saída exibida e, em seguida, ajustar a caixa atraso claro o manual pressionando o botão para a frente de modo que o perfil completo IRF está dentro da faixa de varredura da caixa de atraso o jejum.
    4. Ajustar os parâmetros de aquisição (densidade neutra, tempo de exposição, a acumulação frame) de modo que o CCD não está saturado na mais brilhante tempo portão e o tempo de integração eficaz é> 200 ms.
    5. Definir medidas de atraso de 25 ps sobre o atraso completo tocoue ( "controle de FLIM: Caixa de atraso rápida: Preencher atrasos").
    6. Adquirir imagem IRF pressionando "imagem snap FLIM".
    7. Adquirir uma imagem de fundo, bloqueando a laser ( "controle de caminho de luz: densidade neutra: bloqueado"), reduzindo o número de atrasos ( "controle de FLIM: Caixa de atraso rápida: definição de atraso actual (MA)"), deixe todas as outras propriedades inalterada e imprensa "snap imagem FLIM".
12. Adquirir dados corante de referência:
    1. Selecione bem H4 usando a μManager GUI ( "controle XYZ: Vá para o bem: H4").
    2. Usando o μManager GUI, selecione filtros (Excitação 434/17 nm, Dichroic, Emissão 482/25 nm) para geração de imagens mTqFP.
    3. Use a função Find MaxPoint em toda a gama de caixa de atraso do rápido e, em seguida, ajustar a caixa atraso grosso modo o perfil de decaimento completo está dentro do intervalo de atraso de caixa de atraso o jejum.
    4. Definir o atrasoao ponto de intensidade máxima, alterando o "controle FLIM: Caixa de atraso rápida: definição de atraso actual (MA)". Ajustar os parâmetros de aquisição (densidade neutra, tempo de exposição) para que o CCD não está saturado.
    5. Definir medidas de atraso de 25 ps acima da faixa de atraso total ( "controle FLIM: Caixa de atraso rápida: Preencher atrasos).
    6. Adquirir dados de corante de referência pressionando "imagem snap FLIM".
    7. Adquirir imagem da câmara CCD um segundo fundo, bloqueando a laser de excitação (ver 2.11.7)
13. Adquirir dados FLIM da amostra placa de poços múltiplos usando o software de aquisição de μManager:
    1. Defina quais poços devem ser trabalhada eo número de FOV a ser adquirido por poço ( "HCA Setup aquisição sequenciado: posições XYZ").
    2. seleccionar manualmente um FOV exemplar contendo a amostra a ser trabalhada. Utilize este FOV para determinar o filtro de densidade neutra ideal, largura portão no GI etempo de integração da câmara, de modo a chegar a 75% da gama dinâmica da câmara CCD.
    3. Definir a focagem automática ( "controle XYZ: Foco automático"): Aperte "única controle de foco Retorno", e depois focar manualmente as células ou estrutura de interesse. Defina "intervalo de pesquisa focagem automática" a 2000 mm e pressione "Enter". Pressione o botão "AF agora" para iniciar um processo de focagem automática. Um valor de deslocamento vai aparecer no campo "FocusOffset (focagem automática)".
    4. Digite o valor do deslocamento obtido em 2.13.3 para "AF offset" e repita o procedimento autofocus duas vezes ( "AF agora") para verificar se o valor do deslocamento agora é zero, indicando o correto funcionamento do sistema de focagem automática.
    5. Use a função "AutoGate" no software de aquisição OpenFLIM-HCA para escolher uma amostragem logarítmica dos pontos de atraso. Alternativamente, estes podem ser seleccionadas manualmente, ver referemrência 36 para mais detalhes.
    6. Defina "Acumular Frames" para um valor que os rendimentos desejado tempo total de aquisição de dados. Aumentando o número de quadros acumulados aumenta a relação sinal-ruído dos dados de FLIM à custa de também o aumento do tempo total de aquisição de dados de FLIM.
    7. Executar a aquisição de FLIM da placa com múltiplas cavidades, premindo o botão "Iniciar sequência HCA".
14. Aquisição de mais imagem da câmara CCD fundo, bloqueando a laser de excitação (ver 2.11.7) com configurações de aquisição idênticos tão utilizado para a aquisição de dados FLIM.

3. openFLIM-HCA Análise de Dados Usando FLIMfit

1. Verifique se os arquivos auxiliares necessários para análise de dados FLIM estão presentes (ou seja, IRF e medição corante de referência).
2. Carregar os dados a partir do poço vazio (H1), o meio de cultura contendo também (H2) e as cavidades que continham células não marcadas em meio de cultura (H3) em FLIMfit( "Ficheiro: FLIM dados de carga") para verificar se existem quaisquer contribuições de fundo maior do que 1% do sinal a partir das células que expressam "doador-apenas", ou seja, em poços A1-G3.
3. Prepare um arquivo de variável no tempo de fundo (TVB) carregando o médio, bem com a cultura em FLIMfit ( "File: dados FLIM Load"). Carregar os dados de fundo de câmara adquiridos na seção 2.14 ( "Background: Fundo Load") e usar as "Ferramentas: Criar TVB Mapa Intensidade" opção FLIMfit para gerar a TVB. Ver a referência 31 para mais detalhes sobre a TVB.
4. Prepare o espacialmente variável IRF Mapa Turno por carregar os dados IRF adquiridos na secção 2.11 e subtrair o branco câmera CCD adquirida na secção 2.11.7. Use a opção FLIMfit "Ferramentas: Criar IRF deslocação da carta" para calcular a espacialmente variável IRF deslocação da carta. Veja referência [31] para mais detalhes sobre o Mapa de Deslocamento IRF.
5. Caber um monoexponencial cárie aos dados de corante de referência adquiridas na seção 2.12. Dye carga de referência eo Mapa IRF espacialmente variável calculada no ponto 3.4, definidos parâmetros de ajuste ( "Lifetime: No. Exp: 1") com t ₀ conjunto como um parâmetro equipada ( "Lifetime: FIT IRF Turno: justo"). O valor de t ₀ obtido é então relatado na tabela mostrada na guia "Parâmetros".
6. Analisar os dados FLIM por carregar os dados FLIM experimentais adquiridos na seção 2.13, o espacialmente variável IRF Mapa calculada no ponto 3.4, o branco câmera adquirida na seção 2.14, o arquivo TVB preparado na seção 3.3 e digite o valor negativo de t ₀ obtido na secção 3.5 ( "IRF: IRF mudança: t _0"). Em seguida, ajustar os dados experimentais para o modelo de decaimento desejado usando FLIMfit ³⁶ de acordo com os requisitos do experimento.

Results

Para ilustrar as capacidades da instrumentação openFLIM-HCA, apresentamos três aplicações FRET exemplares. O primeiro diz respeito FRET construções que são adaptados a partir de construções modelo FRET desenvolvidos pelo laboratório de Stephen Vogel ^38. Eles compreendem uma série de construções fluorescentes geneticamente expressáveis ​​em que uma proteína fluorescente dadora (mTurquoise) está ligado a um fluoróforo aceitador (Vénus) por comprimentos curtos controladas de ácidos 5, 17 e 32 aminoácidos (mTq5V, mTq17V, mTq32V). Os diferentes comprimentos de vinculador entre doador e receptor fluoróforos resultar em diferentes eficiência FRET e, portanto, vidas diferentes doadores. Para proporcionar um controle negativo, o Vénus no linker curta ácido 5-amino é substituído por Amber - uma mutação não-fluorescente de YFP (mTq5A) que não pode actuar como um aceitador FRET ^38. Nós substituímos Cerulean nos vectores pCXV e pC5A originais por restrição digerir o vectRUP com as enzimas NheI e BglII e ligando fragmentos mTurquoise digerido utilizando as mesmas enzimas de o vector pmTurquoise-N1. A região ligante não modificado foi por essa substituição.

A Figura 6 apresenta um ensaio de FRET FLIM exemplar usando este sistema modelo expressa em células COS, em que uma placa de poços múltiplos é vestida com 3 colunas de cada culas transfectadas com o controlo negativo (colunas 1-3), o ligante de ácido 5-amino construir FRET (colunas 4-6), o ligante de ácido 17-amino construir FRET (colunas 7-9) e o ligante de 32 aminoácidos construir FRET (colunas 10-12). Row H contém poços de estimativa TVB. Figura 6 (a) mostra exemplos de imagens da vida de fluorescência adquiridos automaticamente de campos típicos de vista em cada poço. É evidente que o controlo negativo (colunas 1-3) apresentam os tempos de vida mais longos, e que o tempo de vida é mais baixo dador FRET para a construção com o ligante mais curto lenGTH (colunas 4-6). A Figura 6 (b) mostra como o tempo de vida médio em média, em todos os FOVs em cada cavidade varia ao longo da placa com múltiplas cavidades. As Figuras 6 (c) e (d) mostram mapas de vida exemplar doador de fluorescência de intensidade-mesclado para um FOV de mTq5A e mTq17V respectivamente. A Figura 6 (e) mostra o perfil de fluorescência de dador intensidade decaimento média sobre todas as células fotografadas no poço A1, em conjunto com o ajuste a um modelo de decaimento monoexponencial e o IRF (que é dominado pela largura portão GI). A Figura 6 (f) apresenta o tempo médio de vida de fluorescência para cada coluna da placa com múltiplas cavidades obtida a partir de um ajuste de pixel monoexponencial a gota. Uma tabela de tempo de vida médio e desvio padrão (DST) podem ser encontrados na Tabela 1 abaixo. A aquisição de dados para as imagens mostradas na Figura 6 levou aproximadamente 160 minutos para adquirir. A análise levou 92 s em um computador 2.6 GHz com 10 núcleos e 64 gB de memória RAM.

O segundo ensaio exemplar demonstra a aplicação de FLIM FRET para ler a oligomerização de Gag de HIV-1 durante a montagem de viriões de HIV-1 como um meio para testar inibidores deste processo ^25,42. Expressando Gag de HIV-1 em células hospedeiras adequadas proporciona um sistema modelo para esta fase do ciclo de vida do HIV-1, uma vez que conduz à formação de partículas virais (VLPs) que são semelhantes a imaturas HIV-1 virions. Para este ensaio, que expressa o HIV-1 de proteína Gag fundido com PCP em células HeLa e em relação à acção de diferentes inibidores através do seu impacto no sinal de FRET, que resultou da oligomerização Gag. Os detalhes dos inibidores utilizados são fornecidos na referência 42.

Os detalhes da preparação da amostra e medições experimentais são descritas exaustivamente na referência 25, onde se demonstrou que poderíamos utilizar FLIM para ler Both heteroFRET entre agregação de proteínas da mordaça rotulados estocasticamente com PCP e com YFP, e também homoFRET em células expressando apenas Gag marcado com PCP. Embora homoFRET não costuma apresentar uma mudança na vida do doador, que para o caso especial de PCP onde existe o fluoróforo em dois isômeros com diferentes tempos de vida de fluorescência média ^40,41. A PCP homo-FRET de leitura tem a vantagem de a preparação de amostras simplificado em comparação com PCP / YFP hetero-FRET e é mais eficiente do espectro, o que pode ser importante para leituras de FRET multiplexados.

O nosso trabalho anterior aplicada FLIM FRET para ensaiar a oligomerização da mordaça, na presença de uma N-myristoyltransferase (NMT) inibidor de ^42. Este inibidor perturba os enzimas endógenos responsáveis pela adição de ácido mirístico para gag, que permite que proteínas gag de se ligar à membrana de plasma e é um pré-requisito ⁴³ na formação de viriões de HIV ouVLP. Mostramos que ambas as leituras heteroFRET e homoFRET poderia alcançar Z "de> 0,6 em estudos de dose-resposta com um inibidor da NMT. Z 'é um parâmetro utilizado na indústria farmacêutica para indicar a qualidade de um ensaio e representa as diferenças entre os valores médios dos controlos positivos e negativos e seus spreads relativos para gerar uma única métrica valor de qualidade de ensaio - com Z'> 0,5 sendo considerado "excelente" para um ensaio farmacêutica ^44. Nota-se que este excelente performance foi obtida com amostras para as quais a alteração no tempo de vida médio dador era da ordem de 300 PS - demonstrando o poder estatístico de análise de dados FLIM para um grande número de células, o que permite leituras úteis para ser realizado usando muito menor alterações no tempo de vida de fluorescência do que é possível com os números típicos de células fotografadas em experimentos de microscopia manuais.

Aqui, apresentamos um FLIM placa com múltiplas cavidades FRET conjunto de dados comparando 4 compostos inibidores de HIV Gag oligomerização (designado ICL13, ICL14, ICL15 & ICL16). Para esta experiência, utilizamos a leitura homoFRET com células HeLa transitoriamente transfectadas com o plasmídeo Gag-PCP. Um total de nove doses diferentes de cada inibidor foram aplicados seguindo o protocolo padrão descrito em referência 32, permitindo que dois poços repetidos por condição. Como um controlo positivo, coluna 1 apresenta as células que expressam MYR-gag, uma proteína Gag mutado falta o radical de ácido mirístico, que não pode formar partículas VLP e assim simula inibição total. Um controlo negativo foi fornecida por células que expressam dosagem Gag-PCP só com apenas o veículo utilizado para entregar os inibidores nas outras colunas (coluna 11). Um total de oito FOV foram adquiridos por poço.

Dados foi equipado com um único modelo de decaimento exponencial numa base de pixel-a-pixel e o tempo de vida de fluorescência plate mapa que mostra o tempo de vida médio por poço (ao longo de todos os pixels acima do limiar de intensidade entre os oito campos de visão) é mostrado abaixo na Figura 7 (a). A Figura 7 (b) mostra o gráfico correspondente do tempo de vida de fluorescência como uma função da concentração de inibidor. Três dos inibidores mostram um efeito inibidor (ICL13, ICL15 & ICL16) quando incubado com células que expressam Gag-PCP. Um inibidor (ICL14) mostra nenhum efeito em qualquer dose testada. O Z 'calculado para esta placa foi de 0,51. Os valores obtidos para os controlos positivos e negativos são mostrados na Figura 7 (b), como pontos a preto a 100 pM e 0,1 nM.

As curvas de resposta à dose para ICL13, ICL15 e ICL16 mostrados na Figura 7 (b) foram em seguida ajustadas ao modelo de regressão não-linear logística de 4 parâmetros com o coeficiente de Hill fixo a um ⁴⁵ com o tempo de vida máximo e mínimo fixo aoOs valores obtidos a partir do positivo (coluna 1) e negativo (coluna 11) controla respectivamente. Os valores de _IC50 retornados para as três curvas foram em seguida: 38 nM, 24 nM e 116 nM para ICL13, ICL15 e ICL16 respectivamente. Para efeitos de comparação com valores de _IC50 obtidos através de FLIM intracelular FRET medições, foram determinados _{de IC50} para a inibição de actividade enzimática de NMT1 humana recombinante no nosso ensaio de enzima bioquímico anteriormente relatado ^42. Os três compostos encontrados para ser ativo por FLIM FRET são também os mais activos neste ensaio (valores IC ₅₀ de 17 nM, 51 nM e 39 nM para ICL13, ICL15 e ICL16, respectivamente), com ICL14, que não mostrou nenhuma resposta significativa no ensaio FLIM FRET, sendo ca. 100 vezes menos activo contra NMT1 _(IC50 de 1700 nM). Para os compostos activos, os valores _{de IC50} obtidos através destas modalidades de ensaio independentes são muito semelhantes, com pequenas variações provavelmente atribuíveis a dIFERENÇAS na absorção ou o metabolismo do composto nas células.

Este pequeno estudo destaca a capacidade do HCA FLIM para discriminar a potência dos diferentes compostos que actuam no mesmo alvo de interesse. Acreditamos que é a primeira demonstração de uma tela utilizando FLIM automatizado num contexto elevado teor de gerar múltiplas curvas de resposta à dose e ilustra o potencial de FLIM para ser aplicada à tela para e / ou caracterizar os compostos terapêuticos úteis.

O terceiro experimento FLIM FRET exemplar diz respeito a um biossensor de FRET expressão genética para a proteína activada por troca monofosfato cíclico de adenosina (AMPc (EPAC)), que é um factor de troca guanina Rap-1 que se liga especificamente ao AMPc. Este biossensor EPAC FRET (EPAC-S ^H188) utiliza a proteína fluorescente mTurquoise2 (mTq2FP) como o fluor�oro dador e incorpora dois Venus-FP para implementar um composite receptor ^46. cAMP um segundo mensageiro é ubíqua e está envolvida numa variedade de processos intracelulares ao longo de muitos organismos diferentes. É sintetizada pela adenilato ciclase a partir da conversão de ATP na membrana celular. Aqui demonstramos a capacidade de ler e quantificar a sua actividade em células HEK293T vivo na sequência da adição de forscolina, um activador da adenilato ciclase que regula positivamente a produção intracelular de cAMP e, portanto, aumenta a sua concentração citoplasmática. Este sensor EPAC sofre FRET no seu estado (não ligada) inactivado e a sua vida útil doadores aumenta com a concentração de cAMP como o cAMP conduz à abertura do biossensor. O perfil de decaimento mono-exponencial de mTq2FP torna este biossensor mais adequado para a análise quantitativa vida de biossensores baseados em PCP ^45. A Figura 8 mostra um exemplo de um curso de tempo registados utilizando a placa com múltiplas cavidades FLIM microscópio automatizado, onde temos representados graficamente a alteraçãona vida média e a mudança na fracção de população FRETing dador ao longo do tempo a seguir à adição de 100 uM de forscolina. Por questões de simplicidade, assume-se que o sinal total pode ser descrita por uma mistura de FRETing monoexponencial e dadores não-FRETing e a fracção de população do biossensor EPAC FRET activado foi obtido pela montagem de um perfil de decaimento exponencial duplo entre a série temporal.

Para a aquisição de dados de Camp (EPAC) cinco atrasos de porta, com uma largura de portão de 4.000 ps, ​​foram escolhidos com o tempo de atraso definido para 1.300 ps, ​​4.300 ps (pico de intensidade), 4.919 ps, 6.656 ps, 8035 ps, 1, 0391 ps e 16.000 ps. O tempo de integração da câmara para cada atraso foi de 250 ms. Em um bem, nós adquiriu um tempo de curso FLIM com imagens obtidas a cada 10 s, durante 10 min. Os pontos de dados adquiridos por vezes s 120 e 130 s foram removidas, porque a adição de forscolina causou uma pequena mudança na posição focal da amostra e os mesmose da intensidade de fluorescência registada durante as aquisições FLIM nestes pontos de tempo.

Para a análise de dados as imagens foram carregadas em FLIMfit e segmentado por célula. O tempo de vida de fluorescência dados foram ajustados a um modelo de decaimento exponencial duplo utilizando um IRF e um valor de t ₀ fixo obtido a partir de um corante de referência (75 uM Cumarina 6). A fluorescência do dador significa vida média sobre todas as células é mostrada na Figura 8 (a). A Figura 8 (b) mostra a variação da fracção de população ao longo do tempo FRETing calculados por adaptação dos mesmos dados FLIM para o mesmo modelo de decaimento exponencial duplo

onde β é a fracção doador FRETing. Assumimos uma mistura de FRETing e eleme não FRETingNTS para os pontos de tempo antes da adição de forscolina. Para obter estes tempos de vida, um ajuste exponencial dupla foi aplicado para os três primeiros pontos de tempo dando _um tempo de vida de τ = 3964 ± 21 PS para o dador não FRETing, e τ ₂ = 3022 ± 27 PS para o doador FRETing. Estes foram fixados para o ajuste subsequente de todo o conjunto de dados para obter os valores de p em cada ponto de tempo.

Em resumo, temos apresentado exemplares resultados HCA FLIM para três amostras experimentais. A primeira era uma placa de 96 cavidades dispostas com células COS que expressam de FRET construções compreendendo um doador mTqFP relacionado ou com um aceitador de Vénus FP ou um não-fluorescente âmbar construir por diferentes comprimentos de ligante peptídico. A alteração na TERF eficiência e, portanto, vida dador com um comprimento de ligante é claramente aparente e o desvio padrão do tempo de vida significativo para cada construção era inferior a 36 ps. O segundo exemplar assay era uma "tela" de quatro potenciais inibidores para miristoilação da proteína Gag do HIV para que a% de inibição foi calculada a partir da variação do tempo de vida médio de fluorescência de dador com a concentração de inibidor medido em células HeLa que expressam proteína Gag marcado com PCP. Essa leitura é baseada em homoFRET, que não costumam apresentar uma mudança na vida do doador, mas faz por PCP, porque isso existe em vários isômeros com diferentes tempos de vida fluorescentes. Isto pode ser útil em termos de eficiência de espectro, por exemplo, para multiplexação diferentes leituras FRET ^25. O terceiro ensaio exemplar foi um curso de tempo monitorando células HEK293T vivos que expressam o biossensor cAMP FRET, EPAC. Isso mostrou a resposta esperada após o tratamento com forscolina ea aplicação de FLIMfit usando um modelo de decaimento exponencial duplo com o número de fótons detectados sendo compatível com imagens de células vivas - como já anteriormente demonstrado com o biosen LIBRA FRETsor para IP3 ^47.

Figura 1. Esquema de largo-campo FLIM fechado em tempo usando um intensificador de imagem óptico fechado (GOI). lado esquerdo, mostra uma representação esquemática do sistema experimental. Superior direito, esquemática de pulso de excitação, a posição de imagens fechado em tempo e ajuste monoexponencial aos dados. canto inferior direito, desenhos animados mostrando o decaimento da fluorescência dos dois objetos mostrados no sistema experimental. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Representação esquemática de todo o campo openFLIM-HCA usando um intensificador de imagem óptico fechado (GOI). Ver o texto principal para uma descrição mais detalhada docomponentes do sistema. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Esquema de opticamente seccionado openFLIM-HCA usando um intensificador fechado óptico de imagem (GOI) com uma unidade de digitalização disco de Nipkow. Ver o texto principal para uma descrição mais detalhada dos componentes do sistema. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Esquema de imagem fluxo de dados do programa de aquisição Manager para Omero servidor ou disco do computador e em FLIMfit para análise. O fluxo de dados começa no topo l canto EFT onde os dados de imagem RAW é adquirido no programa de aquisição de μ-Manager. Os itens dentro da caixa a tracejado representam as fases da análise dos dados FLIM, enquanto aqueles que estão fora de correspondência com a aquisição e armazenamento de dados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Captura de tela da interface com o usuário FLIMfit. Superior esquerdo, a lista de campos de visão atualmente carregado e imagem intensidade de fluorescência do campo atualmente selecionado de vista. parte inferior esquerda, a seleção do modelo de montagem e condições de montagem. Superior direito, decaimento da fluorescência para a região atual de juros (círculos azuis), ajuste aos dados (linha vermelha), IRF (linha tracejada vermelha) com resíduos de ajuste abaixo (linha azul).g5large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Multiwell FLIM placa de modelo de FRET constrói mTq5V, mTq17V, mTq32V expresso em células COS. (A) as imagens de fluorescência ao longo da vida exemplo de FOV em cada poço para diferentes construções FRET expressa em células COS, como discutido no texto. (B) mapa de calor dos médios vidas de fluorescência Venus, calculados sobre todas as células em cada poço. (C) imagem de intensidade de mTurquoise Âmbar revestiu com o mapa da vida (barra de escala de 20 mm). (D) imagem intensidade da mTurquoise Venus (17 aminoácidos) sobreposto com o mapa da vida (barra de escala de 20 mm). (E) perfil medida de intensidade de decaimento (círculos azuis) de mTq5A construção (controle negativo) de fluorescência média sobre todas as células fotografada no poço A1, juntamente com o ajuste dos dados a um decaimento monoexponencial (linha azul sólida) e IRF (linha tracejada laranja). (F) o gráfico do tempo de vida significativo em média, em cada coluna do outro lado da placa com múltiplas cavidades, com as barras de erro mostram o desvio padrão no tempo de vida de fluorescência entre campos de visão. valores vitalícios para (ad) são representadas por meio de uma escala de cores falsas com os limites indicados em picossegundos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. Tela com vários poços Exemplar placa FLIM de inibidores da mordaça utilizando células HeLa expressando Gag-PCP. (A) mapa de calor de média de vida dos doadores de fluorescência por poço de placa com múltiplas cavidades vestida com coluna 1 células apresentadoras transfectadas com myr-Gag-PCP como um positiv e controlo para a inibição, da coluna 11, células transfectadas com Gag-PCP apresentando expostas a veículo somente, e os quadrados coloridos tracejadas indicam os poços que foram doseados com um dos quatro inibidores diferentes com concentrações que variam a partir da coluna de alta dose de 2 para baixo da coluna de dose 10 . a escala de cores falsas representa o tempo de vida de fluorescência média variando de 2.200 ps para 3.100 ps. (B) traça vida de fluorescência para cada inibidor com barras de erro que mostra o desvio padrão entre os poços de repetição. Pontos a preto em 2 e -4 no eixo horizontal são os pontos de controlo positivas e negativas, respectivamente, obtidas a partir de colunas 1 e 11, respectivamente. As linhas a cheio indicam um ajuste para os dados da curva de resposta à dose para os diferentes inibidores. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8. Uso Exemplar de FLIM para ler o biossensor EPAC FRET em uma medição de lapso de tempo usando células HEK293T. Mudar em (a) significa tempo de vida de fluorescência e (b) da fracção FRETing dador como uma função do tempo após adição de forscolina indicado pela barra verde. As barras de erro mostram o erro padrão por célula. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

	por poço	STD	ERRAR			por poço	STD	ERRAR
mT5A	4008	32	12		MT17V	3004	26	10
mT5V	2717	35	13		mT32V	3133	30	11

Tabela 1. vida média e desvio padrão (STD) das construções traste.

Discussion

Nós descrevemos um microscópio placa com múltiplas cavidades automatizado projetado para HCA usando FLIM fechado em tempo. Este instrumento é controlado através de software de código aberto escrito em μManager com a opção de salvar os dados para um servidor OMERO ea análise dos dados FLIM sendo realizado usando FLIMfit ^36, um programa de código aberto escrito em Matlab e disponível como um cliente OMERO ³² O instrumento μManager software de controle, openFLIM-HCA, está disponível on-line ³³ com uma lista dos componentes do sistema ⁴⁸ para permitir que pesquisadores acadêmicos para construir seus próprios instrumentos FLIM HCA.

A fim de adquirir dados FLIM robustos, é necessário para otimizar as configurações de aquisição de Governo indiano e CCD e para ter em conta as variações de t _0. Tal como descrito em 3.8.2, e o ajuste de ganho câmara CCD GI tempo de integração deverá ser ajustada para atingir ~ 75% da gama dinâmica do CCD. vocêcantar mais elevadas tensões GOI e várias acumulações de quadro CCD em cada atraso porta do tempo aumenta a relação sinal-ruído ^49, mas isso aumenta o tempo total de aquisição FLIM (já que menos fótons de fluorescência são adquiridos por quadro antes de os ácidos gordos saturados de câmera CCD e por isso o número de acumulações de quadro deve ser aumentada) e por isso este trade-off deve ser decidido para cada experimento. A calibração do gerador de atraso depende da taxa de repetição do laser e é, portanto, necessário para assegurar que o ficheiro de calibração correcta para a taxa de repetição utilizado é carregado para o software de aquisição. O procedimento para calibrar a caixa de atraso pode ser encontrado no wiki openFLIM-HCA ^33.

Se a autofluorescência celular é baixo quando comparado com o sinal de fluorescência, que utilizam o sinal a partir de um meio de cultura apenas uma das cavidades contendo a fornecer o fundo variável no tempo (TVB). Para minimizar a fluorescência de fundo do meio de cultura celular, evitamosmídia contendo vermelho de fenol. Se a autofluorescência celular é significativo, em seguida, o TVB podem ser derivadas a partir de medições das células não marcadas. No entanto, neste caso, deve ser tomado cuidado, já que esta assume que a autofluorescência fundo é a mesma para cada pixel na imagem. Esta suposição não será válida se a autofluorescência varia significativamente entre uma célula ou se o feixe de excitação ou sensibilidade de detecção não é uniforme ao longo do campo de visão.

A aquisição de uma imagem de IRF usando pulsos de luz de excitação espalhadas fornece o perfil de IRF temporal que é convolvido com o modelo de dados no processo de adaptação e também fornece um mapa da variação espacial da IRF em todo o campo de vista. O IRF pode ser medida por imagiologia de uma amostra de espalhamento, tais como uma suspensão coloidal, embora, no nosso instrumento, usando a luz de excitação espalhada a partir do disco de Nipkow fornece uma medição de líquido de limpeza do IRF. A determinação precisa do momento of IRF é importante porque os erros no tempo de atraso entre o tempo de excitação e-gating pode impactar significativamente o processo de adaptação, particularmente na altura da montagem de complexos modelos de decaimento exponencial. O IRF adquiridos utilizando luz de excitação dispersa não é exatamente o que é necessário para o processo de adaptação, porque ele é gravado no comprimento de onda de excitação ao invés de no comprimento de onda de emissão de fluorescência, o que pode afetar o seu calendário, embora a variação espacial da IRF deve ser o mesmo em ambos os comprimentos de onda. Além disso, o IRF dispersa pode ser deslocado em todo o mundo no tempo em relação à verdadeira IRF devido a um comprimento do percurso óptico diferindo do objecto dispersão, como é o caso para um IRF adquirida a partir do disco de Nipkow em FLIM opticamente seccionada. Esta correcção, t _0, que é o deslocamento temporais mundial necessário que deve ser aplicada ao IRF luz de excitação espalhada adquirida, é calculado a partir dos dados de referência monoexponencial corante tal como indicado na Protocetapa ol 4.4. Os seguintes corantes podem ser usados para diferentes comprimentos de onda de excitação: 75 uM um Cumarina 153 solução em metanol (τ ~ 4.3 NS ⁵⁰⁾ pode ser usado para a excitação na gama de 295-442 nm; uma solução de 75 uM Cumarina 6 em etanol (t ~ 2,43 NS ³⁷⁾ pode ser usado para a excitação na gama de 430-500 nm; e uma solução 75 | iM rodamina B em água (τ ~ 1.7 NS ³⁷⁾ pode ser usado para a excitação na gama de 488-575 nm. Fazemos notar que, embora seja possível, em FLIMfit usar um IRF diferente para cada pixel do sistema, geralmente, é razoável assumir que o IRF espacialmente variável tem o mesmo perfil temporal para cada pixel da imagem, mas apresenta uma gama de espacialmente variando deslocamentos temporais relativos ao global a T _0. Descrevemos deste como o mapa de IRF mudança, a qual é determinada a partir da luz dispersa IRF. Juntos, o perfil de IRF, t ₀ e o mapa deslocamento IRF são usados para PTCertifique-se de que cada pixel no campo de visão é equipado com um IRF apropriado. Importante, t ₀ pode variar lentamente ao longo do tempo por isso deve ser medido antes de qualquer aquisição de dados FLIM.

O usuário deve decidir como provar os perfis de decaimento de fluorescência e é necessário para definir a largura dos tempos portões e seus atrasos relativos após excitação. Em geral, é desejável usar grandes larguras de porta para maximizar o sinal detectado e normalmente usamos larguras de porta configurada para 4 ns para FLIM de células marcadas com proteínas de fluorescência. O número de atrasos de tempo de porta deve ser suficiente para provar o perfil de decaimento de fluorescência (incluindo um portão definido para medir o sinal imediatamente antes do pulso de excitação) dada a complexidade do modelo adequado que vai ser utilizado na análise. O valor óptimo pode depender de os tempos de vida e amplitudes relativas dos componentes de decaimento. Em geral, 4 portas são suficientes para monoexponencial montagem decai enquanto 7 ou mais portas podemser usado para mais modelos de decaimento complexas.

Notamos que FLIM pode ser implementado usando uma variedade de técnicas no domínio do tempo ou no domínio da frequência e HCA FLIM automatizada de arranjos de placas de múltiplos poços foi implementado pela primeira vez em um (não-corte) microscópio de campo amplo usando leituras ao longo da vida no domínio da frequência de FRET ^51. O primeiro leitor de placas de poços múltiplos óptico seccionamento FLIM automatizado para HCA utilizando todo o campo de imagem fechado em tempo ²⁸ foi então relatada. Subsequentemente, toda a área (não de corte) no domínio da frequência de FLIM HCA foi aplicado para o rastreio de translacionais pós (fosforilação de tirosina) ao longo de uma biblioteca de genes usando FRET ⁵² e HCA FLIM-gated tempo tem sido aplicada a FRET ensaios de HIV-1 Gag oligomerização ⁵³ e de SUMOilação de FOXM1 ⁵⁴ e de Raichu RhoA e Rac1 biossensores ^33. É também possível utilizar TCSPC FLIM para placa de poços múltiplos ^26, mas até à data não tenha sido um desafio para combinar tele taxa de transferência de técnicas que exploram a detecção de campo amplo. Uma abordagem emergente que poderia resolver este problema é o uso de matrizes de detectores de contagem de fótons individuais, tais como matrizes SPAD ^55.

Fazemos notar que quaisquer leituras de FRET utilizando proteínas fluorescentes devem ser tratados com precaução e que os valores absolutos dos parâmetros obtidos a partir FLIMfit ou qualquer outro software de análise de FLIM dependerá das hipóteses associadas com o modelo de ajustamento. Por exemplo, onde o dador de FRET tem uma componente significativa segundo decaimento, a utilização de um modelo biexponencial para ajustar os dados de FRET FLIM pode resultar na contribuição do componente mais rápida deterioração, tipicamente associados com a população FRETing aparecendo maior do que deveria. Por conseguinte, é desejável utilizar doadores com um tempo de vida de mono-exponencial, tais como mTq2FP. Mesmo então, os estudos recentes têm demonstrado que a análise de FRET pode ainda ser afectado por estados escuras de proteínas aceitador de fluorescência ou porheterogeneidade do factor de orientação κ ² devido a uma distribuição de conformações fluoróforo com uma variedade de ângulos e distâncias cromóforos ^56. No entanto, nós e outros mostraram que as leituras de fluorescência ao longo da vida de FRET produzem resultados úteis que se correlacionam com as medições bioquímicas e pode ser utilizado para pesquisar as interacções proteína ou para acompanhar a dinâmica de biossensores. Assim, esta plataforma openFLIM HCA pode ser aplicado a uma vasta gama de ensaios à base de tempo de vida de fluorescência utilizando FRET ou autofluorescência celular ^8, bem como proporcionando leituras quantitativas de sondas à base de corante ^25.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
moldura para microscópio	Olympus	IX81	http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
autofoco óptico	Olympus	ZDC	http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
motorizado (x-y-z) platina para microscópio	Marzhauser	00-24-565-0000	de controle Corvus
	Fianium	SC400-4	Laser supercontínuo http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/
intensificador óptico fechado	Kentech	High Rate Imager (HRI)
	Kentech	---	See gerador de atraso ágil e câmera geradora de atraso de precisão
	Nipkow Hamamatsu	ORCA-ER-II
	Yokogawa	CSU-X1	http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/
Difusor de cartola	Thorlabs	ED1-S20-MD	Difusores projetados
mTq5V	Oxford Genetics	P3850	mTurquesa Venus construct com 5 aminoácidos ligante
mTq17V	Oxford Genetics	P3847	mTurquoise Venus construct com 17 aminoácidos linker
mTq32V	Oxford Genetics	P3848	mTurquoise Venus construct com 32 aminoácidos linker
mTq5A	Oxford Genetics	P3849	mTurquoise Amber construct
HEK293T	---	---	tipo de célula usado
fenol sem vermelho HBSS	Sigma Aldrich	55021C-1000ML	meios
			DMEM + 10% FBS + 0,5% antibióticos
DMEM	Sigma Aldrich	D6046-500ML	para meios
de cultura FBS	Sigma Aldrich	12003C-500ML	para meios de cultura
xTremeGene9	Sigma Aldrich	6.37E+09	para transfecção, siga o protocolo online da solução de
tripsina / EDTA	Roche Thermo Fischer	R001100	para desprender células, siga o protocolo online da Thermo Fischer