Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos

Resumo

Nós apresentamos um método para isolamento e cultura do duto de Wolff rato (WD). Também demonstramos um procedimento detalhado para toda a imunocoloração monte da cultura / WDs recentemente isolados com anticorpos marcados fluorescentes. Em conjunto, estas técnicas permitem o estudo do desenvolvimento WD, de enrolamento, e a diferenciação.

Resumo

morfogénese tubária é um requisito fundamental para o desenvolvimento da maioria dos órgãos de mamíferos, incluindo o sistema reprodutivo masculino. O epidídimo, parte integrante do sistema reprodutor masculino, é responsável pela estocagem de esperma, maturação e transporte. O epidídimo adulto é um tubo altamente enrolada que se desenvolve a partir de um precursor embrionária simples e direto conhecido como duto de Wolff (WD). enrolamento adequada do epidídimo é essencial para a fertilidade masculina, como o esperma no testículo são incapazes de fertilizar um óvulo. No entanto, o mecanismo responsável pelo desenvolvimento e epididimal de enrolamento permanece pouco clara, parcialmente devido à falta de métodos de cultura de órgãos e de imagem inteiros. Neste estudo, descrevemos um sistema de cultura in vitro e todo o protocolo de imunofluorescência de montagem para visualizar melhor o processo de enrolamento de WD e desenvolvimento, o que pode também ser aplicada ao estudo de outros órgãos tubulares.

Introdução

O sistema reprodutor masculino é composto principalmente de testículo, o local para o desenvolvimento de células germinativas e diferenciação, e um sistema ductal complexo que é necessário para a maturação, de transporte, de armazenamento e de esperma. Epidídimo é um órgão tubular que liga testículo com vasos deferentes e, principalmente, envolvidos no desenvolvimento pós-testicular e maturação das células germinativas ^1. O epidídimo altamente enrolados do rato adulto desenvolve a partir de um tubo simples e direto precursor, duto de Wolff (WD) ^1. A estrutura complexa e enrolada de epidídimo é essencial para o esperma para adquirir a capacidade de fertilizar células germinativas femininas ^2. Como tal órgão essencial para a fertilidade masculina e desenvolve fica em forma não é bem compreendido. Várias vias de sinalização foram mostradas para ser envolvido no desenvolvimento de WD, tais como a via de sinalização Wnt ^3,4 e o androgénio via da ⁵ sinalização. Nosso trabalho recente estabeleceu a exigência de balANCED Wnt sinalização para WD enrolamento durante o desenvolvimento pré-natal ^4. No entanto, mais estudos são necessários para entender os mecanismos envolvidos no enrolamento pós-natal do epidídimo, diferenciação celular, e comunicação célula-célula dentro do epitélio do epidídimo e com células intersticiais.

Modelos de ratos geneticamente modificados têm sido provado ser uma poderosa ferramenta para a identificação / validação dos mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e doenças de diversos sistemas de órgãos ^6. Apesar de sua ampla utilização, existem limitações significativas de modelos de ratos geneticamente modificados, incluindo o fenótipo imprevisíveis de ratos mutantes alvo com relação à função do gene presumido, e nenhum fenótipo em mutantes nulos em alguns modelos, a influência de fatores genéticos e ambientais, trabalho intensivo e demorado processo de desenvolvimento de modelos de ratinho. Portanto, a interpretação do significado dos resultados apenas dos geneticamente modimodelos ficados rato nem sempre é simples ^6. Estas limitações podem ser superadas utilizando em sistema de cultura de órgãos in vitro que nos dá a flexibilidade de manipular múltiplas vias de sinalização em tempo real, em condições de cultura controladas. Sistema de cultura de órgãos é fundamental para a compreensão da fisiologia e patologia dos órgãos inteiros ^7. Além disso, a imagiologia de órgãos inteiros coradas com anticorpos etiquetados fluoróforo nos permite visualizar os marcadores de interesse num contexto tridimensional, tal como existe in vivo, proporcionando assim uma melhor compreensão da forma do órgão, estrutura, função e ^8.

Aqui, descrevemos os métodos para isolamento de rato cumes gonadal embrionárias, a cultura in vitro e toda imagem imunofluorescência monte da WDS, que podem ser aplicados para responder a uma variedade de questões relativas à morfogênese de órgãos tubulares, tais como WDS. Neste protocolo,isolado de rato embrionário pregas genitais de 15,5 dias post coitum (DPC) vacas prenhes e cultivaram-durante 3 d seguido de imunocoloração para um marcador das células epiteliais (citoqueratina 8, CK8), um marcador de proliferação celular (fosfo-Histona 3, PH3) e activa βcatenin.

Protocolo

cuidados com os animais e os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as orientações do Comitê de Cuidados e Ética Animal da Universidade de Newcastle e confirmou à Lei New South Wales animal Research, Nova Gales do Sul Regulamento Research Animal, eo código da Austrália para o cuidado e utilização de animais para fins científicos. Todos os procedimentos realizados em ratos foram aprovados pelo Comitê Cuidados e Ética Animal da Universidade de Newcastle.

1. Tempo Acasalamento

1. Par 6 - 8 semanas de idade do sexo masculino e do sexo feminino ratos um pouco antes do final do ciclo de luz do dia.
2. Verificar as fêmeas para a presença de tampões vaginais de manhã cedo (em ou antes de 08:00), todos os dias. Dia do plugue é considerado como 0,5 dpc.
3. Transferir a fêmea com plug vaginal em uma nova gaiola (sem masculino) e rotular a data da tomada.

2. Isolamento de rato embrionárias Gonadais Ridges

1. Isolar embryon ratoic cristas gonadais de 15,5 dpc fêmeas grávidas como descrito em ^9, com algumas modificações como descrito em baixo.
2. Realizar dissecção antes do meio-dia como o tempo de fêmeas grávidas são consideradas para entrar no dia seguinte da gravidez pela tarde.
3. Sacrifício 15,5 DPC fêmeas grávidas que usam deslocamento cervical (ou de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da institucional).
4. Mantenha o mouse sobre as suas costas em um papel absorvente absorvente e pulverizar o lado ventral do abdômen com etanol 70%.
5. Levante a pele abdominal inferior (lado ventral) com uma pinça e fazer uma incisão lateral usando uma tesoura cirúrgica, que se estende desde a abertura urogenital até o fim para caixa torácica. Puxar a pele para a cabeça do animal para expor o abdômen.
6. Corte os músculos abdominais com uma tesoura cirúrgica para expor a cavidade peritoneal. Pegue o útero grávido com uma pinça pouco acima do colo do útero e fazer um corte. Agora, levante o útero, segurando em to da bexiga urinária e cortar o ligamento largo do útero seguido por cortes nas junções uterotubal destacar útero do anexo peritoneal.
7. Transferir o útero para um tubo de 50 mL contendo HBSS gelada (Solução Salina Equilibrada de Hank). Lavar o útero grávido suavemente com HBSS arrefecido em gelo para remover o excesso de sangue.
8. Manter o útero de uma placa de Petri contendo HBSS arrefecido com gelo e manter em gelo. Corte a parede uterina e tirar os embriões. Manter os embriões numa placa de Petri fresca com HBSS em gelo.
9. Pegue um papel de seda estéril limpo e colocá-lo em uma nova placa de Petri. Spray de etanol a 70% sobre o papel de tecido. Mantenha embrião sobre este papel de tecido na face lateral e cortá-la de abdômen inferior utilizando uma lâmina estéril na direção mostrada pela linha pontilhada na Figura 1.
10. Corrigir o embrião em uma base de esponja esterilizada fixando a coluna vertebral.
11. Colocá-lo sob o microscópio estereoscópico de dissecação e cuidadosamente cortada ao longo da linha média ventral. Remover o fígado e intestinos. O sistema do mouse urogenital (rim, ureter, testículos, WD e canal deferente) deverão ser agora visíveis.
12. Recorte o testículo e WD, mantendo-os num prato fresco Petri com HBSS, em gelo. Para tirar o WD e testículos, cortar os canais deferentes perto de seu apego à uretra e cortar a ligação da porção inferior do WD de gubernaculum.
13. Reúnem-se os testículos e WDs a partir dos embriões do mesmo grupo (pode variar de acordo com o plano experimental).

3. Cultura de Embryonic gonadal Ridges (Figura 2)

1. Preparar o meio para a cultura das cristas gonadais embrionárias, completando DMEM / F12 com 10% de FBS (Soro Fetal Bovino), 1% de penicilina / estreptomicina e 1% de L-glutamina. Aquece-se a meios para 37 ° C num banho de água.
2. Adicionar 300 uL de meios de comunicação por poço de uma placa de cultura celular de 24 poços.
3. Pegue um prato Petri fresco e colocar uma pequena gota de HBSS estéril nele. Coloque uma membrana de policarbonato trilha etch (0,881; m) nesta gota de HBSS com a sua superfície brilhante virada para o HBSS.
4. Utilizando uma pinça limpa colocar dois WDs e gônadas na membrana (em sua superfície áspera, voltada para cima) e remova a quantidade máxima de HBSS usando lenços estéreis / papel absorvente. Não toque o tecido com papel absorvente; caso contrário, irá danificar o tecido.
5. Certifique-se de que nem os WDs nem as gónadas estão tocando um ao outro. Caso contrário, eles vão ficar juntos durante a incubação subsequente.
6. Transferir a membrana com os tecidos do poço de uma placa de 24 poços contendo meio de cultura de 300 mL e a cultura los na interface ar-meio. meio de cultura muito em membranas resulta em um crescimento cística do WDS.
7. Incubar a placa a 37 ° C incubadora, na presença de 5% de CO _2.
8. Alterar o meio de cultura todos os dias. Para alterar a forma, com a pipeta, retire a forma do poço primeiro e, em seguida, adicionam-se 300 uL do meio fresco pré-aquecido.
   Nota:Para estudar o efeito de diferentes vias de sinalização na morfogénese WD, activadores e / ou inibidores químicos às concentrações requeridas podem ser adicionados ao meio de cultura.
9. Cultura tecidos para 3 d. Dentro de 3 d, WDs desenroladas recolhidos a partir de um embrião dpc 15,5 transformar em tubos altamente complicadas (Figura 3B). A adição do inibidor de Wnt, IWR1, resulta em inibição da WD bobinamento (Figura 3C).
10. Para a colheita destes tecidos tomar uma placa de Petri com PBS gelado. Transferir a membrana com gônadas culta e WD na placa de Petri. A membrana irá flutuar no PBS. Pressione a membrana para afundá-lo em PBS e tirar a gônada e WD.
11. Fixar os tecidos com 4% de paraformaldeído (PFA) O / N a 4 ° C ou durante 1 h à TA. Se necessário, tomar as imagens de campo claro de WDS antes da fixação.

4. Imunofluorescência Monte Whole

1. Lava-se a tecidos fixados 3x com PBS-T (PBS + 1%Triton X-100) com agitação lenta, de 10 minutos cada, à temperatura ambiente.
2. Desidratar os tecidos numa série graduada de etanol (25%, 50%, 75% e 100%), 10 min cada, a 4 ° C, com balanço lento (~ 30 rpm). Neste passo, os tecidos podem ser armazenadas a 4 ° C em 75% de etanol.
   1. Para alterar o etanol, manter os tecidos não perturbadas por 2 min e deixe os tecidos se acalmar. Tome-se como muito sobrenadante quanto possível e, em seguida, adicione a maior concentração próxima de etanol. Para evitar qualquer dano aos tecidos, a ponteira não deve tocar os tecidos em qualquer fase.
3. Após desidratação, a re-hidratar os tecidos numa série graduada de etanol (100%, 75%, 50% e 25%), 10 min cada, a 4 ° C, com agitação lenta.
4. Lavar os tecidos com PBS-T (PBS + 0,1% de Triton X-100), 4x, 20 minutos cada, à RT, com agitação suave (~ 30 rpm).
5. Bloquear os tecidos durante 1 h à temperatura ambiente com tampão de bloqueio (PBS + BSA a 1% + 0,2% de leite seco sem gordura em pó + 0,3% de Triton X-100).
6. afteR bloqueio, transferir os tecidos a solução de anticorpo primário (diluído em tampão de bloqueio) e incubar O / N a 4 ° C com agitação suave (~ 30 rpm). As diluições dos anticorpos primários utilizados são descritos na Tabela Materiais.
7. No dia seguinte, lavar tecidos com PBS-MT (PBS + 2% de leite magro em pó seco + 0,5% de Tween-20), 4x, 30 minutos cada, à RT, com agitação suave (~ 30 rpm).
8. Após este passo de lavagem, adicionar o anticorpo secundário, a uma diluição de 1: 250 (Este passo necessita de optimização para anticorpos individuais) em tampão de bloqueio e incubar durante 1 h, à RT, com agitação suave.
9. De agora em diante, manter os tecidos cobertos com folha de alumínio para evitar a exposição à luz como anticorpos secundários são rotuladas com fluoróforos sensíveis à luz.
10. Lavar os tecidos 3x com PBS-T (PBS + 0,1% de Tween-20), 30 min cada, com agitação suave.
11. Preparar lâminas para a montagem dos tecidos manchados.
    1. Para isso, cortar as lamelas de vidroem tiras finas usando uma caneta de diamante e ficar duas tiras de um sobre o outro na lâmina de vidro usando esmalte de unhas. Adicione dois limites e tecidos lugar entre estes dois limites.
    2. Adicionar DAPI contendo meio de montagem e colocar uma lamela. Aplicar esmalte nos cantos da lâmina de cobertura para corrigi-lo ao slide.
       Nota: Os tecidos estão agora prontos para a imagem latente. Armazenar esses slides a -20 ° C.

Resultados

Durante o desenvolvimento, o WD sofre alterações significativas no qual um tubo simples e direto é transformado em um duto altamente complexo e enrolada. Utilizando os métodos descritos acima, o WDS sofrer uma transformação similar em condições de cultura. Aqui temos mostrado os resultados de WDs cultivadas durante 3 d (Figura 3). Para dissecar os mecanismos moleculares envolvidos na morfogénese WD, o meio de cultura pode ser suplementado com inibidores e activadores, dirigidos a diferentes vias de sina...

Discussão

O sistema de cultura de órgãos tem muitas vantagens sobre o sistema de cultura celular tradicional. Este sistema retém as relações estruturais originais e as interacções entre diferentes tipos de células. Ele imita em sistemas in vivo e dá informações mais precisas do que os estudos de cultura de células, onde o fator de nicho está ausente. A utilização de sistemas de cultura de órgãos mesmo tem vantagens sobre o uso de todo o animal. Estes incluem o custo mais elevado de utilização de todo o animal, f...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de 24 poços	Corning, USA	3524	podem ser adquiridas de outros fornecedores
Hank' s Solução Salina Balanceada (HBSS)	GE Healthcare Life Sciences, EUA	SH30031.02	pode ser comprada de outros fornecedores
Meio Eagle Modificado de Dulbecco: Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM/F12)	Sigma, EUA	D8437	Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
Soro Fetal Bovino (FBS)	Interpath,  Austrália	SH30034.02	10% FBS usado em meio
de cultura L-Glutamina	GE Healthcare Life Sciences, EUA	SH30034.01	concentração de 1% usada
Penicilina/Estreptomicina	Gibco, EUA	15070-063	concentração de 1% usada
Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch	Whatman, EUA	110409	Membrana (0.8 µ m)
IWR1	Sigma, EUA	10161-5mg	100 µ Concentração M usada
Paraformaldeído (PFA)	Electron Microscopy Sciences, EUA	15710	16% de estoque, 4% em PBS para uso. TÓXICO - use luvas e não ser descartado na pia
Etanol	Thermo Scientific Fisher, EUA	214-20L PL	Absolute, faça 25, 50 e 75% com água miliQ.
Tween-20	Thermo Scientific Fisher, EUA	2509-500ml	Muito viscoso, cuidadoso ao dispensar
Triton X-100	Sigma, EUA	T8787-50ml	Muito viscoso, cuidadoso ao dispensar
Hidrogenofosfato Dissódico	Thermo Scientific Fisher, EUA	621-500mg	pode ser comprado de outros fornecedores
Di-hidrogenofosfato de Sódio	Ajax Finechem, EUA	4745-500g	pode ser comprado de outros fornecedores Cloreto de
Sódio	Thermo Scientific Fisher, EUA	465-500g	pode ser comprado de outros fornecedores
Cytokeratin8/Troma I	Estudos de Desenvolvimento Hybridoma Bank, USA (DHSB)	TROMA-I	1:250 em tampão de bloqueio
ativo β catenina	Tecnologia de Sinalização Celular,  EUA	D13A1	1:200 in tampão
de bloqueio fosfo-histona 3	Millipore, MA, USA	06-570	1:200 in tampão de bloqueio
Alexa488 IgG anti-coelho de cabra Jackson	ImmunoResearchLabs,  EUA	111-545-047	1:250 in buffer de bloqueio
Alexa594 IgG anti-rato de cabra	Jackson ImmunoResearchLabs,  EUA	112-585-072	1:250 in tampão de bloqueio
Glicerol	Thermo Fisher Scientific, EUA	242-500ml	pode ser comprado de outros fornecedores
n-Propil galato	Sigma, EUA	2370-2
-(4-amidinofenil)-1H -indol-6-carboxamidina (DAPI)	Sigma, EUA	D9564-10mg	Use para manchar ácidos nucleicos (DNA)
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Thermo Fisher Scientific, USA	2225-500ml
Lamínulas de Solvente (24 x 50 mm)	Lomb Scientific	CS24501GP	-