Nós apresentamos um método para isolamento e cultura do duto de Wolff rato (WD). Também demonstramos um procedimento detalhado para toda a imunocoloração monte da cultura / WDs recentemente isolados com anticorpos marcados fluorescentes. Em conjunto, estas técnicas permitem o estudo do desenvolvimento WD, de enrolamento, e a diferenciação.
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Artigo de método
Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos
Neste artigo
Resumo
Resumo
morfogénese tubária é um requisito fundamental para o desenvolvimento da maioria dos órgãos de mamíferos, incluindo o sistema reprodutivo masculino. O epidídimo, parte integrante do sistema reprodutor masculino, é responsável pela estocagem de esperma, maturação e transporte. O epidídimo adulto é um tubo altamente enrolada que se desenvolve a partir de um precursor embrionária simples e direto conhecido como duto de Wolff (WD). enrolamento adequada do epidídimo é essencial para a fertilidade masculina, como o esperma no testículo são incapazes de fertilizar um óvulo. No entanto, o mecanismo responsável pelo desenvolvimento e epididimal de enrolamento permanece pouco clara, parcialmente devido à falta de métodos de cultura de órgãos e de imagem inteiros. Neste estudo, descrevemos um sistema de cultura in vitro e todo o protocolo de imunofluorescência de montagem para visualizar melhor o processo de enrolamento de WD e desenvolvimento, o que pode também ser aplicada ao estudo de outros órgãos tubulares.
Introdução
O sistema reprodutor masculino é composto principalmente de testículo, o local para o desenvolvimento de células germinativas e diferenciação, e um sistema ductal complexo que é necessário para a maturação, de transporte, de armazenamento e de esperma. Epidídimo é um órgão tubular que liga testículo com vasos deferentes e, principalmente, envolvidos no desenvolvimento pós-testicular e maturação das células germinativas 1. O epidídimo altamente enrolados do rato adulto desenvolve a partir de um tubo simples e direto precursor, duto de Wolff (WD) 1. A estrutura complexa e enrolada de epidídimo é essencial para o esperma para adquirir a capacidade ....
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Protocolo
cuidados com os animais e os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as orientações do Comitê de Cuidados e Ética Animal da Universidade de Newcastle e confirmou à Lei New South Wales animal Research, Nova Gales do Sul Regulamento Research Animal, eo código da Austrália para o cuidado e utilização de animais para fins científicos. Todos os procedimentos realizados em ratos foram aprovados pelo Comitê Cuidados e Ética Animal da Universidade de Newcastle.
1. Tempo Acasalamento
- Par 6 - 8 semanas de idade do sexo masculino e do sexo feminino ratos um pouco antes do final do ciclo de luz do dia.
- Verifica....
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Resultados
Durante o desenvolvimento, o WD sofre alterações significativas no qual um tubo simples e direto é transformado em um duto altamente complexo e enrolada. Utilizando os métodos descritos acima, o WDS sofrer uma transformação similar em condições de cultura. Aqui temos mostrado os resultados de WDs cultivadas durante 3 d (Figura 3). Para dissecar os mecanismos moleculares envolvidos na morfogénese WD, o meio de cultura pode ser suplementado com inibidores e activadores, dirigidos a diferentes vias de sina.......
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Discussão
O sistema de cultura de órgãos tem muitas vantagens sobre o sistema de cultura celular tradicional. Este sistema retém as relações estruturais originais e as interacções entre diferentes tipos de células. Ele imita em sistemas in vivo e dá informações mais precisas do que os estudos de cultura de células, onde o fator de nicho está ausente. A utilização de sistemas de cultura de órgãos mesmo tem vantagens sobre o uso de todo o animal. Estes incluem o custo mais elevado de utilização de todo o animal, f.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer aos membros do grupo de oncologia ginecológica para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho é em parte suportado pelo financiamento do National Health and Medical Research Council, o Conselho Australiano de Pesquisas, eo Cancer Institute NSW (PST). MK é um receptor da Universidade de Newcastle Postgraduate Research Fellowship.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de 24 poços | Corning, USA | 3524 | podem ser adquiridas de outros fornecedores |
| Hank' s Solução Salina Balanceada (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, EUA | SH30031.02 | pode ser comprada de outros fornecedores |
| Meio Eagle Modificado de Dulbecco: Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM/F12) | Sigma, EUA | D8437 | Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Interpath, Austrália | SH30034.02 | 10% FBS usado em meio |
| de cultura L-Glutamina | GE Healthcare Life Sciences, EUA | SH30034.01 | concentração de 1% usada |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibco, EUA | 15070-063 | concentração de 1% usada |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, EUA | 110409 | Membrana (0.8 µ m) |
| IWR1 | Sigma, EUA | 10161-5mg | 100 µ Concentração M usada |
| Paraformaldeído (PFA) | Electron Microscopy Sciences, EUA | 15710 | 16% de estoque, 4% em PBS para uso. TÓXICO - use luvas e não ser descartado na pia |
| Etanol | Thermo Scientific Fisher, EUA | 214-20L PL | Absolute, faça 25, 50 e 75% com água miliQ. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, EUA | 2509-500ml | Muito viscoso, cuidadoso ao dispensar |
| Triton X-100 | Sigma, EUA | T8787-50ml | Muito viscoso, cuidadoso ao dispensar |
| Hidrogenofosfato Dissódico | Thermo Scientific Fisher, EUA | 621-500mg | pode ser comprado de outros fornecedores |
| Di-hidrogenofosfato de Sódio | Ajax Finechem, EUA | 4745-500g | pode ser comprado de outros fornecedores Cloreto de |
| Sódio | Thermo Scientific Fisher, EUA | 465-500g | pode ser comprado de outros fornecedores |
| Cytokeratin8/Troma I | Estudos de Desenvolvimento Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 em tampão de bloqueio |
| ativo β catenina | Tecnologia de Sinalização Celular, EUA | D13A1 | 1:200 in tampão |
| de bloqueio fosfo-histona 3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in tampão de bloqueio |
| Alexa488 IgG anti-coelho de cabra Jackson | ImmunoResearchLabs, EUA | 111-545-047 | 1:250 in buffer de bloqueio |
| Alexa594 IgG anti-rato de cabra | Jackson ImmunoResearchLabs, EUA | 112-585-072 | 1:250 in tampão de bloqueio |
| Glicerol | Thermo Fisher Scientific, EUA | 242-500ml | pode ser comprado de outros fornecedores |
| n-Propil galato | Sigma, EUA | 2370-2 | |
| -(4-amidinofenil)-1H -indol-6-carboxamidina (DAPI) | Sigma, EUA | D9564-10mg | Use para manchar ácidos nucleicos (DNA) |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | |
| Lamínulas de Solvente (24 x 50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
Referências
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal develop....
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Reimpressões e permissões
