É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Pluripotentes Stem Cell Derivado células cardíacas para reparo do miocárdio

8.2K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/55142

⸱

3 de fevereiro de 2017

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham

Neste artigo

Resumo

Apresentamos três protocolos de novos e mais eficientes para a diferenciação de células estaminais pluripotentes humanas induzida em cardiomiócitos, células endoteliais, e células do músculo liso e um método de entrega que melhora o enxerto de células transplantadas através da combinação de injecção das células com citocinas entrega mediada por remendo.

Resumo

Humanos induzida células-tronco pluripotentes (hiPSCs) deve ser totalmente diferenciado em tipos específicos de células antes da administração, mas protocolos convencionais para diferenciar hiPSCs em cardiomiócitos (hiPSC-CMS), células endoteliais (hiPSC-ECs), e células musculares lisas (SMCs) são muitas vezes limitada pelo baixo rendimento, pureza e / ou pobre estabilidade fenotípica. Aqui, nós apresentamos novos protocolos para gerar hiPSC-CMs, -ECs, e -SMCs que são substancialmente mais eficiente do que os métodos convencionais, bem como um método para a combinação de injecção de células com um penso contendo citocina criado ao longo do local de administração. O remendo melhora tanto a retenção das células injectadas, por meio de selagem da faixa de agulha para impedir que as células de ser espremido para fora do miocárdio, e a sobrevivência de células, através da libertação do factor de crescimento semelhante a insulina (IGF), durante um período prolongado. Num modelo suíno de lesão de isquemia-reperfusão do miocárdio, a taxa de enxerto era mais do que duas vezes maior quando oAs células foram administrados com o remendo contendo citoquinas em comparação com as células, sem mancha, e o tratamento com ambos as células e o remendo, mas não apenas com as células, foi associada com melhorias significativas na função cardíaca e o tamanho do enfarte.

Introdução

As células estaminais pluripotentes humanas induzida (hiPSCs) estão entre os agentes mais promissores para a terapia celular regenerativo porque eles podem ser diferenciadas em uma gama potencialmente ilimitada e a quantidade de células que não são rejeitadas pelo sistema imunitário do paciente. No entanto, a sua capacidade de auto-replicação e diferenciação podem também levar à formação de tumor e, consequentemente, hiPSCs precisa ser totalmente diferenciadas em tipos de células específicos, tais como cardiomiócitos (CMS), células endoteliais (ECs), e células do músculo liso (SMCs ), antes da administração. Um dos métodos mais simples e mais comum de administração da célula é a injecção directa intramiocardial, mas o número de células transplantadas que são enxertados pelo tecido do miocárdio nativa é excepcionalmente baixa. Muito deste atrito pode ser atribuído ao ambiente citotóxica do tecido isquémico; No entanto, quando as células estaminais embrionárias de murídeo (CES) foram injectados directamente no miocárdio de corações não lesionados, óomente ~ 40% dos 5 milhões de células foram entregues retida durante 3-5 h 1, o que sugere que uma proporção substancial das células administradas saiu do local de administração, talvez por terem sido espremidos para fora através do percurso da agulha pelas altas pressões produzidas durante contração do miocárdio.

Aqui, apresentamos métodos novos e substancialmente mais eficientes para a geração de cardiomiócitos hiPSC derivados (hiPSC-CMS) 2, células endoteliais (hiPSC-ECs) 3, e células musculares lisas (SMCs) 4. Notavelmente, este protocolo hiPSC-SMC é o primeiro a imitar a vasta gama de características morfológicas e funcionais observadas em somática SMCs 5 direccionando as células para um fenótipo de SMC contráctil ou predominantemente sintética. Também fornecemos um método de entrega de células que melhora a taxa de enxerto de células injectadas através da criação de uma citocina de fibrina contendo Patch sobre o local da injecção. O remendo parece melhorar a retenção de células, por meio de selagem da faixa da agulha para evitar que as células se sair do miocárdio, e a sobrevivência de células, através da libertação do factor de crescimento semelhante a insulina (IGF) ao longo de um período de pelo menos três dias.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais são realizados de acordo com as Diretrizes Animal da Universidade de Alabama em Birmingham.

1. Diferenciando hiPSCs em hiPSC-CMs

  1. Revestir os poços de uma placa de 6 poços com mistura de proteína gelatinoso pré-arrefecido a-factor de crescimento reduzida, a 4 ° C durante a noite. Aspirar a mistura gelatinosa proteína antes da utilização. Semear o hiPSCs nas placas pré-revestidas, e as células de cultura (1 x 10 5 células por poço) em 5% de CO 2 e 37 ° C em meio suplementado com mTeSR1 ROCHA inibidor 10 uM.
  2. Recarregar a forma diária até as células atingirem confluência de 90%; em seguida, adicione a mistura de proteína gelatinosa-factor de crescimento das reduzida ao meio (0,5 mg mistura gelatinosa proteína por placa de 6 poços, 2 ml de meio por poço), e a cultura das células durante 5% de CO 2 e 37 ° C mais dois dias.
    1. Para substituir o meio, gentilmente sugar o meio da placa de petri por meio de vácuo compara tocar as células e adicionar novo meio com uma pipeta de transferência.
  3. Iniciar a diferenciação através da substituição do meio com meio RPMI1640 suplementado com factor de crescimento reduzida-mistura proteína gelatinosa, B27, sem insulina, e 100 ng / ml de Activina A; cultivar as células em 5% de CO 2 e 37 ° C durante 24 h.
  4. Substituir o meio com meio RPMI1640 que foi suplementado com B27, sem insulina, 10 ng / ml de proteína morfogénica do osso 4 (BMP-4), e factor de 10 ng / mL de crescimento de fibroblastos básico (bFGF); cultivar as células em 5% de CO 2 e 37 ° C durante 96 h.
  5. Substituir o meio com meio RPMI1640 suplementado com B27 e continuar a cultura das células em 5% de CO 2 e 37 ° C; refrescar o meio a cada 3 dias.
  6. Observe aglomerados de células contrair sob o microscópio ~ 3 dias após o início da diferenciação. Recolher os aglomerados ~ 7 dias após a primeira observação de contracções e lavá-los em solução salina equilibrada de Hanks.
    1. Dissociar as células aglomeradas na placa, incubando-as em tampão de Hanks contendo 100 U / ml de colagenase IV durante 10 min a 37 ° C com agitação suave; em seguida, adicionar 0,25% de tripsina em ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) durante 5 min.
    2. Neutraliza-se a solução de enzima com soro fetal bovino a 10% em meio RPMI / B27 e, em seguida, voltar a suspender as células em meio / B27 RPMI.
    3. Contar o número de células por hemocitômetro. Cultura das células em placas de 10 cm a 5% de CO 2 e 37 ° C durante pelo menos 3 horas, o que permitirá que as células não-cardiomiócitos para aderir à superfície da placa de cultura.
  7. Recolha a suspensão de células, que contém a hiPSC-CMS, e manter as células (cerca de 1 x 10 6 culas por prato de 10 cm), cultivando-as sobre uma superfície -Revestido mistura proteica gelatinosa.

2. Diferenciar hiPSCs em hiPSC-ECs

  1. Dissociar a população hiPSC em células individuais por incubação thos com agente quelante em 5% de CO 2 e 37 ° C durante 5 min. Transferir as células para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo meio de mTeSR1 fresco.
  2. Girar as células a 200 xg durante 5 min. Ressuspender as células em meio suplementado com mTeSR1 ROCHA inibidor 10 uM. Determinar a densidade de células com um hemocitómetro.
  3. Adicionar 250 ul de 20 unidades NIH solução de trombina / ml a uma cavidade de uma placa de 24 poços.
  4. Adicionar 1 x 10 6 hiPSCs para 250 ul de uma solução de fibrinogénio de 12,5 mg / ml. E adicionar os 250 jil de solução de fibrinogénio contendo as células para a trombina-carregado bem. Observe a mistura solidificar para formar um andaime de fibrina contendo hiPSC dentro min.
  5. Transferir os, suportes contendo as células solidificado em poços de uma placa de 6 poços com a pinça de cobertura de vidro, e iniciar a diferenciação por cultura dos andaimes em 2 ml de meio de EBM2 suplementado com 2% B27, sem insulina, activina-A (50 ng / ml), e BMP-4 (25 ng / ml) durante 24 h em 5% de CO 2 e 37 ° C.
    1. Substituir o meio delicadamente sugando o antigo médio através de vácuo, sem tocar nas células. Adicionar novo meio EBM2 suplementado com B27, sem insulina, factor de crescimento endotelial vascular (VEGF, 50 ng / mL), eritropoietina (EPO, 100 ng / ml), e transformando β1 do factor de crescimento (TGF-p1, 10 ng / ml), e a cultura andaimes em 5% de CO 2 e 37 ° C durante 48 h.
    2. Refrescar o meio de cultura e os andaimes em 5% de CO 2 e 37 ° C durante mais 48 horas; em seguida, libertar as células do andaime por adição de 200 U de colagenase IV (100 U / ml) ao meio.
    3. Girar as células depois que eles são liberados. Substituir o meio com 2 ml de meio EGM2-MV suplementado com 2% de B27, o VEGF-A (50 ng / ml), e SB-431,542 (10 uM); refrescar o meio de dois em dois dias.
    4. Aproximadamente 10 dias mais tarde (isto é, em ~ Dia 14 após a diferenciação foi iniciado), dissociar as células com 100 U / ml de colagenase IV, isolar hiPSC-CEs a partir da população de células diferenciadas por meio de citometria de fluxo para analisar a expressão de proteínas marcadoras específicas-CE (por exemplo, CD31, CD144) 3.
    5. Expanda o isolado hiPSC-ECs através de um protocolo estabelecido 3.

3. Diferenciação hiPSCs em hiPSC-SMCs

  1. Semear o hiPSCs em placas que foram revestidas com a mistura de proteína gelatinosa, e a cultura das células em meio mTeSR1 em 5% de CO 2 e 37 ° C, com mudanças de meio por dia, até à confluência (~ 2 dias).
  2. Iniciar a diferenciação em células da linhagem mesodérmica por cultura das células com CHIR99021 (5 uM) e BMP-4 (10 ng / ml) em meio RPMI 1640 e 2% B27 mais insulina durante 3 dias.
  3. Para produzir hiPSC-PMEs com um fenótipo predominantemente sintética:
    1. Cultura das células com VEGF-A (25 ng / ml), factor de crescimento de fibroblastos β (FGFβ, 5 ng / ml) em RPMI1640 me dio, e 2% B27 insulina de menos de 5% de CO 2 e 37 ° C durante 4 dias.
    2. Cultura das células em VEGF-A (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) em meio RPMI 1640, e 2% B27 mais insulina a 5% de CO 2 e 37 ° C durante 2 dias.
    3. Cultura das células em β factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGFβ, 10 ng / mL), TGF-p (3 ng / ml) em RPMI 1640, e 2% B27 mais insulina a 5% de CO 2 e 37 ° C durante 4 dias.
  4. Para produzir hiPSC-PMEs com um fenótipo predominantemente contrátil:
    1. Cultura das células durante 4 dias com VEGF-A (25 ng / ml) e FGFβ (5 ng / ml) em RPMI 1640 e 2% de insulina B27 menos.
    2. Cultura das células durante 7 dias com PDGFβ (5 ng / ml) e TGF-p (2,5 ng / ml) em RPMI 1640 e 2% B27 mais insulina.
  5. Purifica-se as populações finais hiPSC-SMC por cultura das células na concentração de lactato (4 mM) contendo RPMI1640 meio metabólico para ~ 6 dias.
jove_title "> 4. Criando As microesferas contendo IGF

  1. azeite de calor de óleo a 45 ° C num banho de água.
  2. Calor 5 ml de solução de gelatina a 10% a 50 ° C.
  3. Adicionar a gelatina para o óleo de oliva, de agitação, e depois arrefecer rapidamente a 5 ° C por adição de gelo ao banho de água.
  4. Vinte e cinco minutos depois, adicionar acetona refrigerada (4 ° C) para o óleo de oliva para induzir a formação de microsferas.
  5. Manter a temperatura a 5 ° C durante 1 h; em seguida, recolher as microesferas, lavá-los 5 vezes com acetona pré-arrefecida para remover o azeite, e permitir-lhes secar ao ar, a 4 ° C.
  6. Ressuspender as microesferas numa solução de 70% de etanol e 0,25% de glutaraldeído durante a noite a 4 ° C, para induzir a reticulação, e, em seguida, neutralizar a mistura com 100 mM de glicina.
  7. Carga IGF nas microesferas por mistura de 5 mg de microesferas com 15 ul de H2O destilada contendo 5 ug de IGF e 0,1% de albumina de soro de bovino durante 30 min.

5. Criando o patch sobre o local da lesão e injetando as células

  1. Suspenderá a CMs hiPSC derivado (2 milhões), SMC (1 milhão), e ECs (1 milhão) em conjunto em 1 ml de Meio Essencial Mínimo (MEM).
  2. Suspender 5 mg de microesferas em 1 ml de solução de fibrinogénio (25 mg / ml).
  3. Encher uma seringa com a solução contendo as células, uma outra seringa com a solução de fibrinogénio / microesfera, e uma terceira seringa com 1 ml de solução de trombina (80 unidades NIH / mL, suplementada com 2 ul de CaCl 400 mM de 2 e 200 mM de ε-aminocapróico ácido).
  4. Cirurgicamente induzir enfarte do miocárdio no coração suína através de ligadura da artéria descendente anterior coronária como descrito anteriormente 2.
    NOTA: Em resumo, fêmea suína Yorkshire (~ 13 kg, 45 dias de idade) são sedados com injecção intramuscular de Telazol / Xilazina (4,4 mg / kg), e entubados sob anestesia geral com isoflurano (0,5-5%). A 4 th interctoracotomia Ostal é realizada e deixou artéria coronária descendente anterior é exposto. A artéria coronária é tapada por uma ligadura durante 60 minutos e, em seguida, a ligadura é removida. desfibrilhação eléctrica imediata é realizada, no caso de fibrilação ventricular.
  5. Coloque um anel de plástico estéril (~ 2,5 cm) sobre o epicárdio da região infartada de corações de suínos, e depois injetar simultaneamente as soluções de microesferas / fibrinogênio e trombina para o ringue.
  6. Permitir que a mistura solidifique (~ 30 seg), e, em seguida, inserir a agulha da seringa contendo as células através da mistura solidificada no miocárdio enfartado e injectar as células. Feche as camadas musculares, tecido subcutâneo e da parede torácica com 3-0 ou 2-0 monocryl sutura dependendo do tamanho do animal. A buprenorfina 0,01-0,02 mg injecção intramuscular / kg cada 8 horas será usado para controlar a dor para os primeiros 3 dias após a cirurgia.
  7. Avaliar a função cardíaca usando uma ressonância magnética cardíaca(MRI) antes do procedimento cirúrgico, e uma semana, quatro semanas após o procedimento cirúrgico 2, 3, 4. Após os estudos finais de ressonância magnética, sacrificar o animal e processar seus corações para histologia e análise molecular de 2, 3, 4.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Caracterização de Diferenciada hiPSC-CMs, -ECs e -SMCs

A capacidade diferencial de hiPSCs foram avaliados 2, 3, 4. Análises de citometria de fluxo de expressão de troponina T (TnT) sugerem que a pureza da população final hiPSC-CM pode exceder 90% (Figura 1A, 1B, painel B1). Quase todas as células express...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Melhorou Rendimento / Pureza de hiPSC-CMs

protocolos convencionais para diferenciação de células-tronco humanas no CMS são muitas vezes limitadas pela baixa produtividade e pureza; por exemplo, apenas 35-66% das hESC-CMs obtido via separação Percoll e formação do corpo cardíaca expressa lento miosina de cadeia pesada ou cTnT 6. A pureza das populações hiPSC-CM diferenciadas pode ser substancialmente aumentada, seleccionando para a expressão de um gene repórter que foi li...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Serviço de Saúde Pública dos EUA concede NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120 e UO1 HL100407-project 4 (para JZ), um American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) e um Research Voucher Award da Universidade do Alabama em Birmingham Center for Clinical and Translational Science (para WZ).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Protocol Section 1
mTeSR1 mediumStem cell technologies5850
MatrigelCorning lifescience356231
Y-27632Stem cell technologies72304
Suplemento B27, sem soroFisher Scientific17504044
RPMI1640Fisher Scientific11875-119
Activin AR& D338-AC-010
BMP-4 R& D314-BP-010
bFGFR& D232-FA-025
Colagenase IVFisher ScientificNC0217889
Hanks (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anidro)Fisher Scientific14175079
Soro Fetal BovinoFisher Scientific10438018
Placa de 6 poçosCorning Lifescience356721
prato de 10 cmde células 354732Corning Lifescience
PanasonicMCO-18AC
strong>Protocolo Seção 2
VerseneFisher Scientific15040066
FibrinogenSigma-AldrichF8630-5g
TrombinaSigma-AldrichT7009-1KU
EMB2 médioLonzaCC-3156
VEGFProSpec-TanyCYT-241
EPOLife TechnologiesPHC9431
TGF-βPeprotech100-21C
EGM2-MV médioLonzaCC-4147
SB-431542SelleckchemS1067
CD31BD BioscienceBDB555445
CD144BD Bioscience560411
tubo de centrífuga de 15 mlFisher Scientific12565269
Eppendorff CentrifugeEppendorf5702R
Protocolo Seção 3
CHIR99021Tecnologias de células-tronco720542
PDGF-βProspecCYT-501-10ug
Protocolo Seção 4
Olive oilSigma-AldrichO1514
GelatinaSigma-AldrichG9391
AcetonaSigma-Aldrich179124
EtanolFisher ScientificBP2818100
GlutaraldeídoSigma-AldrichG5882
GlicinaSigma-AldrichG8898
IGFR& D291-G1-01M
Albumina de soro bovinoFisher Scientific15561020
placa de aquecimentoFisher ScientificSP88850200
banho-mariaFisher Scientific15-462-10Q
Protocolo Seção 5
CaCl2Sigma-Aldrich223506
ε-ácido aminocapróicoSigma-AldrichA0420000
meio MEMSeringa Fisher Scientific12561-056
Ventilador de anestesia
Ventilador de anestesiaOhio MedicalV5A
DesfibriladorPhysiol ControlLIFEPAK 15
1.5 T MRIGeneral ElectricSigna Horizon LX
7 T MRISiemens10018532
Meio de contraste de gadolínio (Magnevist)Berlex50419-188-02
2-0 sutura de sedaEthilon685H
3-0 sutura de sedaEthilon622H
sutura monofilamentar 3-0Ethilon627H
Solução salina balanceada Incubadora < 1482748 Fisher Scientific Datex-Ohmeda 47810

Referências

  1. Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
  2. Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
  3. Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
  4. Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155(2016).
  5. Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
  6. Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
  7. Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
  8. Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
  9. Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046(2009).
  10. Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
  11. Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
  12. Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
  13. Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
  14. Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
  15. Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
  16. Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
  17. Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  18. Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
  19. Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
  20. Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
  21. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Células Tronco PluripotentesDiferenciação em CardiomiócitosGeração de Células EndoteliaisProdução de Células Musculares LisasModelo de Reparo MiocárdicoPatch Contendo CitocinasTécnica de Injeção CelularAnálise por Citometria de FluxoTroponina T CardíacaModelo de Isquemia Suína
Pluripotentes Stem Cell Derivado células cardíacas para reparo do miocárdio
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.