Summary
우리는 심근 세포, 내피 세포, 평활근 세포 및 패치 - 매개 사이토 카인 배달 세포 주입을 조합함으로써 이식 된 세포의 생착을 향상 배송 방법으로 인간 유도 만능 줄기 세포를 구별하기위한 세 가지 신규하고보다 효율적인 프로토콜을 제안한다.
Abstract
인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)이 완전히 심근 (hiPSC-CMS), 내피 세포 (hiPSC-되는 EC), 및 평활근 세포 (SMCs)에 hiPSCs 차별화에 대한 관리 전에 특정 세포 유형,하지만 기존의 프로토콜로 분화해야합니다 자주 낮은 수율, 순도, 및 / 또는 가난한 표현형의 안정성에 의해 제한. 여기서는 신규 hiPSC-CM이, -ECs를 생성하기위한 프로토콜 및 -SMCs 실질적으로 종래의 방법보다 더 효율적이며, 물론 투여의 사이트를 통해 생성 된 사이토 카인 - 함유 패치 세포 주입을 조합하는 방법을 제시한다. 패치는 장기간 동안 인슐린 유사 성장 인자 (IGF)를 해제함으로써, 심근에서 압착되는 세포 않도록 바늘 트랙 및 세포 생존을 밀봉함으로써, 주입 된 세포의 보존을 모두 개선한다. 심근 허혈 재관류 손상의 돼지 모델에서 생착 속도가 클 때 두 배보다 더이었다세포는 세포 및 패치 모두 시토 킨 - 함유 패치없이 셀 비교 패치 및 치료 투여 아니라 단독 세포, 심장 기능 및 경색 크기에서 상당한 개선 연관되었다.
Introduction
들이 환자의 면역계에 의해 거부되지 않은 셀의 잠재적으로 무한 범위의 수로 구분 될 수 있기 때문에 유도 인간 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 재생 세포 치료에 가장 유망한 제제들이다. (SMCs을하지만, 자기 복제 및 분화 능력은 또한 종양 형성을 초래할 수 있으며, 결과적으로, hiPSCs 완전히 같은 심근 (CMS), 내피 세포 (EC에) 및 평활근 세포와 같은 특정 세포 유형으로 분화 될 필요 ), 투여 전. 세포 투여 간단하고 가장 일반적인 방법 중 하나는 직접 심근 내 주입이지만, 네이티브 심근 조직으로 이식 접목되는 세포의 수는 매우 낮다. 이 감소의 대부분은 허혈성 조직의 세포 독성 환경에 기인한다; 그러나, 생쥐 배아 줄기 세포 (는 ESC)가 있었을 때 손상되지 않은 마음의 심근에 직접 주입 O투여 된 세포의 상당한 비율이 그들이하는 동안 생성 된 높은 압력에 의해 바늘 트랙을 통해 압박했다 아마도 때문에 관리 사이트를 종료 제안 3-5 시간 1 일 동안 유지되었다 전달 된 5 백만 셀 할수 있답니다는 ~ 40 % 심근 수축.
여기, 우리는 hiPSC 유래 심근 세포 (hiPSC-CMS) 2, 내피 세포 (hiPSC-되는 EC) 3, 평활근 세포 (SMCs)을 4 생성 소설과 실질적으로 더 효율적인 방법을 제시한다. 특히,이 hiPSC-SMC 프로토콜은 주로 합성 또는 수축 SMC 표현형으로 세포를 연출하여 체세포 SMCs 5에서 관찰 형태 학적 및 기능적 특성의 넓은 범위를 모방 처음이다. 우리는 또한 사이토 카인 함유 피브린 (P)을 생성하여 주사 세포의 생착 속도를 향상 세포 전달 방법을 제공하는주사 부위를 통해 ATCH. 패치는 적어도 3 일에 걸쳐 인슐린 유사 성장 인자 (IGF)를 해제함으로써, 심근 종료로부터 세포를 방지 바늘 트랙 및 세포 생존을 밀봉함으로써, 두 세포 유지를 향상시키기 위해 나타난다.
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Protocol
모든 실험 절차는 버밍엄에서 알라바마 대학의 동물 가이드 라인에 따라 수행된다.
1. hiPSC-CM이에 hiPSCs 차별화
- 코트 밤새 4 ℃에서 사전 냉각 된 성장 인자 - 감소 된 젤라틴 단백질 혼합물로 6 웰 플레이트의 웰. 사용하기 전에 젤라틴 단백질 혼합물을 기음. 5 % CO 2, 10 μM의 ROCK 저해제와 37 ° C mTeSR1 중간 보충에있는 세포 (물론 당 1 × 10 5 세포를) 미리 코팅 된 플레이트 상에 hiPSCs 종자, 문화.
- 세포가 90 % 합류에 도달 할 때까지 매일 배지를 새로 고침; 다음, 5 % CO 2, 37 ° C 두 개 더 일 동안 매체 (0.5 mg을 젤라틴 단백질 6 웰 플레이트 당 혼합물, 잘 당 2 ㎖의 중간), 문화에 세포 성장 인자 감소 젤라틴 단백질 혼합물을 추가합니다.
- 매체를 교체하려면, 부드럽게 진공 통해 페트리 접시에서 매체를 빨아아웃 셀을 터치하고, 전송 피펫을 사용하여 새로운 매체를 추가합니다.
- 보충 된 RPMI1640 배지 배지로 대체하여 분화를 시작하지 않고 인슐린 젤라틴 단백질 혼합물 B27를 성장 인자 - 감소, 100 NG / ㎖ 티빈 a 및 문화 5 % CO 2, 24 시간 동안 37 ℃에서 세포.
- ; RPMI1640 인슐린없이 B27로 보충 된 배지 10 NG / ㎖ 뼈 형태 형성 단백질 4 (BMP-4), 10 ng의 / ㎖ 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)와 매체를 대체 문화 5 % CO 2, 96 시간 동안 37 ℃에서 세포.
- B27 보충 된 RPMI1640 배지로 배지를 교체하고, 5 % CO 2 및 37 ° C에서 배양 세포를 계속; 3 일마다 배지를 새로 고칩니다.
- 분화를 시작 후 3 일 ~ 현미경으로 세포를 수축의 클러스터를 관찰한다. ~ 칠일 최초의 수축을 관찰 한 후 클러스터를 수집하고 행크스 균형 소금 솔루션에 씻어.
- 부드러운 진동 37 ºC에서 10 분 동안 100 U는 / ㎖ 콜라게나 제 IV 포함 행크스 버퍼를 배양하여 접시에 클러스터 된 세포를 떼어 놓다; 이어서, 5 분 동안 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 0.25 % 트립신을 추가한다.
- RPMI / B27 배지에서 10 % 소 태아 혈청 효소 용액을 중화하고 RPMI / B27 배지에서 세포를 재현 탁.
- 혈구에 의해 세포 수를 계산. 문화 비 심근 세포가 배양 용기의 표면에 부착 할 수 있도록 5 % CO 2, 적어도 3 시간 동안 37 ℃에서 10cm 접시에 세포.
- hiPSC-CMS에 포함 된 세포 현탁액을 수집하고, 단백질 혼합물을 젤라틴 코팅 된 표면을 배양함으로써 (10cm 접시 당 1 × 106 세포 주위) 세포를 유지한다.
2. hiPSC-되는 EC에 hiPSCs 차별화
- 일을 배양하여 단일 세포로 hiPSC 인구 해리5 % CO 2, 5 분 동안 37 ° C에서 킬레이트 제와 엠. mTeSR1 신선한 배지를 함유하는 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포를 옮긴다.
- 5 분 동안 200 XG에서 세포를 스핀 다운. 10 μM의 ROCK 저해제로 보충 mTeSR1 매체에 세포를 재현 탁. 혈구와 셀 밀도를 결정합니다.
- 24 웰 플레이트 잘 하나에 20 NIH 단위 / ml의 트롬빈 용액 250 μl를 추가합니다.
- 12.5 ㎎ / ㎖ 피브리노겐 용액 250 ㎕를 1 × 10 6 hiPSCs를 추가합니다. 그리고 트롬빈로드 웰에 세포 함유 피브리노겐 용액 250 μl를 추가합니다. 혼합물 분 내에 hiPSC 함유 섬유소 발판을 형성하기 위해 응고 관찰한다.
- 커버 유리 집게로 6 웰 플레이트에 고화 셀 - 함유 지지체를 전송하고, 인슐린없이 2 % B27 보충 2ml의 EBM2 매체 골격을 배양하여 분화를 개시, 티빈-A (50 NG / ㎖) BMP-4 24 시간 동안 (25 NG / ㎖), 5 % CO에서
- 부드럽게 세포를 건드리지 않고 진공을 통해 기존의 매체를 흡입하여 매체를 교체합니다. 인슐린없이 B27 보충 된 새로운 EBM2 매체, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF, 50 NG / ㎖) 에리트로 포이 에틴 (EPO 100 NG / ㎖) 및 변형 성장 인자 β1 (TGFβ1 10 NG / ㎖)과 문화 추가 5 %에서 비계 CO 2, 48 시간 동안 37 ° C.
- 매체와 문화 5 % CO 2와 다른 48 시간 동안 37 ℃에서 공사장 공중 발판을 새로 고침; 다음에, 배지에 200 U의 콜라게나 제 IV (100 U / ㎖)을 첨가하여 지지체로부터 세포를 분리.
- 이 출시 된 후 세포를 스핀 다운. B27, VEGF-A (50 NG / ㎖) 및 SB-431542 (10 μM)의 2 % 용액이 보충-MV EGM2 배지로 배지를 교체; 매 2 일 매체를 새로 고칩니다.
- 100 U와 / ㎖ 콜라게나 제 IV를 세포를 떼어 놓다 약 10 일 후 (~ 분화가 시작된 후 하루 14 예), 시간을 분리유동 세포 계측법을 통한 분화 세포 집단에서 IPSC의 EC-EC는 특정 마커 단백질의 발현을 분석하여 (예를 들어, CD31, CD144) 3.
- 설립 프로토콜 (3)을 통해 고립 hiPSC-되는 EC를 확장합니다.
3. hiPSC-SMCs에 hiPSCs 차별화
- 젤라틴 단백질 혼합물로 코팅 된 플레이트 상에 hiPSCs 종자, 문화 mTeSR1 배지에서 세포를 5 % CO 2, 37 ℃에서 하루 중 변화와 합류 할 때까지 (~ 2 일간).
- 3 일간 RPMI1640 배지 및 2 % B27 플러스 인슐린에 CHIR99021 (5 μM) 및 BMP-4 (10 ng의 / ㎖) 세포를 배양하여 혈통 중배엽 세포로의 분화를 시작.
- 주로 합성 표현형과 hiPSC-SMCs을 생성하려면 :
- 문화 VEGF-A (25 NG / ㎖), RPMI1640 내에서 섬유 아세포 성장 인자 β (FGFβ 5 NG / ㎖)을 세포 dium, 2 %의 B27 마이너스 인슐린 5 % CO 2에서 4 일 동안 37 ° C.
- 문화 VEGF-A의 셀 (25 NG / ㎖) FGFβ 5 % CO 2 및 37 RPMI1640 배지 (5 NG / ㎖)에 2 % B27 플러스 인슐린 2 일 동안 C를 °.
- 문화 혈소판 유래 성장 인자 β (PDGFβ 10 NG / ㎖), TGFβ, 5 % CO 2 및 37 RPMI1640 (3 NG / ㎖), 2 % B27 플러스 인슐린 세포 4 일 동안 C를 °.
- 주로 수축 표현형과 hiPSC-SMCs을 생성하려면 :
- 문화 4 RPMI1640에서 VEGF-A와 일 (25 NG / ㎖) 및 FGFβ (5 NG / ㎖) 및 2 % B27 마이너스 인슐린에 대한 세포.
- RPMI1640 배양하고, 2 % B27 플러스 인슐린 PDGFβ (5 NG / mL) 및 TGFβ (2.5 NG / ㎖) 7 일 동안 세포.
- 6 ~ 일 대사 RPMI1640 배지를 함유하는 락트산 (4 mM)을 상기 세포를 배양하여 최종 hiPSC SMC-집단을 정제.
- 열 올리브 오일 수조에서 45 ° C까지.
- 열 50 ° C로 10 % 젤라틴 용액 5 ㎖.
- 올리브 오일, 볶음에 젤라틴을 추가하고 물을 욕조에 얼음을 추가하여 5 ° C에 다음 급속 냉각.
- 스물 다섯 분 후, 마이크로 스피어의 형성을 유도하기 위해 올리브 오일에 냉장 (4 ℃로) 아세톤을 추가합니다.
- 도 5에서의 온도를 유지 1 시간 동안 ° C; 다음 올리브 오일을 제거하기 위해 미리 냉각 아세톤으로 그들에게 5 번 세척, 미세을 수집하고, 4 ℃에서 자연 건조로 할 수 있습니다.
- 가교 결합을 유도 밤새 4 ℃에서 70 % 에탄올 및 0.25 %의 글루 타르 알데히드의 용액에 미소 구를 재현 탁하고 100mM의 글리신과 혼합하여 중화.
- H를 30 분 동안 5 μg의 IGF와 0.1 % 소 혈청 알부민을 함유하는 2 O 증류수 15 ㎕의 5 mg의 미세 구를 혼합하여 미립자로로드 IGF.
5. 세포를 손상의 사이트를 통해 패치를 작성 및 주입
- 1 ml의 최소 필수 중간 (MEM)에 함께 hiPSC 파생 SMCs (100 만)의 CM (200 만), 및되는 EC (1000000)를 일시 중단합니다.
- 1 ㎖의 피브리노겐 용액 (25 ㎎ / ㎖)에 5 ㎎ 미소 일시 중단.
- 셀 - 함유 용액, 피브리노겐 / 미세 용액과 다른 주사기 및 트롬빈 용액 1 ㎖와 함께 제 주사기 한 주사기를 채우기 (80 NIH 단위 / ㎖, 2 ㎕의 400 mM의 CaCl2를 200 mM의 ε 아미노 카프로 보충 산).
- 수술이 이전에 설명 된 바와 같이 관상 동맥을 내림차순 왼쪽 전방의 결찰을 통해 돼지 심장에서 심근 경색을 유도한다.
참고 : 간단한, 여성 요크셔 돼지에서 (~ 13kg이, 연령 45 일)을 Telazol / 크 실라 (4.4 ㎎ / ㎏)의 근육 내 주사로 진정되고, 이소 플루 란 (0.5 %)와 전신 마취하에 삽관. 4 번째 intercostal 개흉술을 수행하고 노출 관상 동맥을 내림차순 앞쪽에 남아 있습니다. 관상 동맥을 60 분간 결찰하여 가려 짐 후 봉합사를 제거한다. 직접 전기 세동은 심실 세동의 경우에서 수행된다. - 돼지 마음의 경색 영역의 심장 외막에 멸균 플라스틱 링 (~ 2.5 cm)을 배치하고 동시에 링에 미세 / 피브리노겐과 트롬빈 솔루션을 주입.
- 혼합물 (~ 30 초)을 고화하도록 한 다음 세포를 심근 경색으로 응고 된 혼합물을 통해 세포 함유 주사기의 바늘을 삽입하고 삽입. 3-0 또는 2-0 Monocryl 봉합이 동물의 크기에 따라와 근육 층, 피하 조직, 그리고 가슴 벽을 닫습니다. 부 프레 노르 핀 0.01-0.02 밀리그램 / kg 근육 내 주사는 8 시간마다 수술 후 처음 3 일 동안 통증을 제어하는 데 사용된다.
- 심장 자기 공명를 사용하여 심장 기능을 평가수술 한 주일 수술 2, 3, 4 이후 사주 전 영상 (MRI). 최종 MRI 연구 후에, 동물을 희생하고 조직 학적 및 분자 분석을 2, 3, 4의 마음을 처리한다.
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Representative Results
차별화 된 hiPSC-CM이, -ECs 및 -SMCs의 특성
hiPSCs의 차동 용량 4, 2 (3)을 평가했다. 세포 계측법 최종 hiPSC-CM 인구의 순도가 90 % (그림 1A, 1B, 패널 B1)를 초과 할 수 있음을 시사 심장 트로포 닌 T (cTnT를) 식의 분석 흐름. 거의 모든 셀 느린 미오신 중쇄 (도 1b 패널 A1)을 표현 α-sarcomeric 액틴 (도 1b 패널 A2), 약 25 %의 미오신 경쇄의 2V 이성체 (MLC2v)을 표현하는 동안 (도 1b, 패널 만 심실의 CM 4 년에 발견되었다 B2). hiPSC-EC 분화 프로토콜의 효율 (즉, CD31의 비율 + 세포) substantia이었다에서야 높은 PCBC16iPS 세포와 그립 라인에서 hiPSCs (45.6 %,도 1c, 패널 C2)보다 (31.3 %,도 1c, 패널 D2)로 수행 때를 > 95 % 순도의 인구 CD31 발현 선택을 통해 달성하고, 상기 선택된 셀의> 90 %가 4 주 동안 CD31 또는 CD144을 발현 계속 배양 한 경우, B27 보충 (FBS)없이 EGM2-MV 매체, VEGF, 및 SB431542 (그림 1D) 3. 정제 된 hiPSC-SMCs 이상 94 % 평활근 액틴 (SMA)을 표현하지만, 합성 hiPSC-SMCs 콜라겐 1, 넥신 (43), 또는 멘틴 (그림 1E)을 표현하는 수축 hiPSC-SMCs보다 더 많은 것으로 나타났다. hiPSC-SMCs의 이동과 증식 능력은 4를 평가 하였다. 합성 hiPSC-SMCs 또한 수축 hiPSC-SMCs보다 더 많은 철새와 증식 하였다 (그림 1 층, 패널 I 및 II), 수축 SMCs는 더 강하게 수축하면서 전N 카바 콜의 치료에 대한 반응 (그림 1 층, 패널 III, IV 및 v).
젤라틴 마이크로 스피어에서 성장 인자 출시
배양 세포 프리 패치로부터 배지 IGF-1 수준을 ELISA 측정은 성장 인자가 최소 3 일 (도 2A)이 걸쳐 미세 해제 된 것으로 나타났다. 분석은 5 μg의 IGF-1과 IGF-함유 미세 5mg을로드하여 수행 하였다. 패치는 1 ML의 피브리노겐 용액 1 ml의 트롬빈과 함께 미소를 혼합하여 생성되었습니다. 이 패치는 2 ML의 MEM에서 배양 하였다. 매체의 하나 ㎖를 수집하고 신선한 MEM 1 ml의 하루 (그림 2B)로 대체되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시 하였다.
적외선 부상 모델에서 관찰
(2)의 돼지 모델에서 조사되었다. 600 만 hiPSC-CM이, -ECs 및 -SMCs (각 세포 유형의 200 만)의 총은 손상된 심근 조직에 직접 주입 하였다. 셀 그룹의 동물들이 동일한 셀 용량으로하지만, 패치없이 취급하는 동안 셀 + 패치 그룹의 동물 용 패치는 피브린과 이루어지는 IGF-1을 포함하는 미소은 주입 전의 상처 부위 위에 작성된; 두 치료는 MI 그룹의 동물에서 보류되었다. 사주 부상 치료 후 CELL + 패치 그룹의 동물로 전달되는 셀의 9 %가 셀 그룹의 동물에게 투여되는 세포의 단지 4 %에 비하여, 유지 및 관리의 현장에서 살아남을 계속 하였다 (도 3A). 혼자 세포와 세포 패치,하지만 모두 치료했다 또한 associ심장 기능 및 경색 크기 (그림 3B)의 측정에 상당한 개선 ated.
도 1 : 심근 세포, 내피 세포, 평활근 세포로의 분화 hiPSCs. 심근 분화 hiPSC-CM의 순도가 다른 심장 마커 (B)와 유동 세포 계측법 (A) 및 조직학을 통해 평가 하였다. hiPSC의 내피 세포의 분화는 유동 세포 계측법 (C)를 결정 하였다. hiPSC-되는 EC의 내피 세포 표현형의 유지는 유동 세포 계측법 (D)에 의해 정제 한 후 2, 3 및 4 주째 CD31 및 CD144의 발현 분석을 통해 측정 하였다. hiPSC의 평활근 세포의 분화는 다양한 마커 (E)에 의해 측정 하였다. 그리고의 이동과 확산 가능성hiPSCs로부터 유도 수축 평활근 세포 대 합성 평활근 세포 (F) 평가 하였다. 핵은 면역 형광 염색법에 DAPI으로 대조 하였다. (B) 200 μm의 (E 및 F)에서 = 100 μm의 스케일 바. 합성 hiPSC-SMCs의 이동과 확산 기능 (F, 패널 I 및 II)을 평가 하였다. 그리고 카바 콜 처리에 응답하여 수축 SMCs의 수축 (F, 패널 III-V 족)을 평가 하였다. * P <0.05, 수축 hiPSC-SMCs 대 합성 hiPSC-SMCs. A와 B는 예 L, 등에서 수정되었습니다. 2. C와 D는 장 S, 등에서 수정되었습니다. 3. E와 F는 양 L, 등에서 수정되었습니다. 4. 데이터는 평균 (SEM)의 평균 ± 표준 오차로 표시 하였다. 두 그룹 간의 비교는 스튜던트 T 테스트로 평가하고, 복수의 그룹간에 비교를 일방향 ANOVA를 통해 평가 하였다. P <0.05 signifi 간주되었다캔트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 마이크로 스피어에서 성장 인자의 방출. IGF-함유 미립자를 합성 하였다 (A). 그들은 (B)을 합성 한 후, 마이크로 스피어에서 IGF-1 분리는 1, 3, 5, 7 일째에 측정 하였다. 스케일 바 = 200 μm의. 패널 A는 예 L., 등에서 수정되었습니다. 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : hiPSC 파생 trilineage의 CEL와 세포 치료의 효율성 평가LS. 세 개의 세포 집단의 전체 생착 레이트 사주 세포 이식 (A) 한 후에 평가 하였다. 심장 (박출계수로 나타낸 바와 같이) 함수 경색 크기가 세포 이식 (B) 한 후, 4 주 후에, 심장 MRI를 통해 평가 하였다. * MI 대 P <0.05; #p를 <패치 대 0.05. A와 B는 예 L., 등에서 수정되었습니다. 2. 데이터는 SEM ± 평균으로 제시 하였다. 군 간의 비교는 원 웨이 ANOVA와 유의성을 분석 하였다. P <0.05으로 유의하다고 하였다. ANOVA를 통해 같은 중요한 식별 결과는 Tukey에 보정으로 재분석 하였다.
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Discussion
hiPSC-CM이 향상된 수율 / 순도
의 CM으로 인간의 줄기 세포를 분화에 대한 기존의 프로토콜들은 종종 낮은 수율과 순도에 의해 제한된다 예를 들어, hESC의-CM이 단지 35-66% 느린 마이 오신 중쇄 또는 cTnT의 6 표현 퍼콜 분리 및 심장 몸 형성을 통해 획득했습니다. 분화 hiPSC-CM 인구의 순도는 대략의 프로모터에 결합되어 리포터 유전자의 발현을 위해 선택함으로써 증가 될 수있는 CM 특정 단백질 7, 8, 9, 그러나이 기술은 반드시 유전자 변형의 사용을 필요 특히 임상 연구에 대해 덜 바람직하다 세포. 여기에 제시된 프로토콜로, hiPSC-CM이 68 %가 cTnT를 표현하고, 순도는 이후 유전자 조작 또는 단일하지 않고 마이크로 해부 및 예비 도금을 통해에> 90 % 증가-cell보세요. 총 수율은 잘 당 ~ 3-5000000 hiPSC-CM이 있었다.
hiPSC-되는 EC의 향상된 수율 / 안정성
가장 일반적으로 사용되는 두 개의 hiPSC-EC 분화 프로토콜 뮤린 간질 세포 (10) (11) 및 배아 체 형성 (12, 13)와 함께 공동 배양에 기초한다. 그러나, 공동 배양법은 뮤린 혈통 세포 나 단백질을 10 만 ~ 15 % 또는 배아 체의 메소드 EC 표현형 10, 12, 13을 가정을 통해 생성 된 세포의 적은 이종 오염으로 이어질 수있다. 여기에 제시된 hiPSC-EC 분화 프로토콜 이종 오염의 위험을 제거하고 최대 수 (hiPSC 라인이 사용되는)에 따라 배아 체를 사용하는 방법보다 더 효율적 3 배로 할 수있다. Furtherm광석, CD31 발현에 대한 선택을 통해 정화 한 후, ~ 다 hiPSC-되는 EC의 90 %는 hiPSC-되는 EC는 기존의 분화 프로토콜 (12)을 통해 생성되는 2 주에 비해 체외에서 최소 4 주 동안 EC의 표현형을 유지했다.
hiPSC-SMCs의 표현형 사양
SMC를의 표현형 (또는 SMCs의 인구는) 아마도 가장 중요한 형태의 차이, 마커의 발현 및 활동으로 이어질 수 있습니다 주로 수축 및 합성 특성 사이의 균형으로 설명한다. 따라서, 특정 응용 프로그램에 대한 hiPSC-SMCs의 유틸리티가 생성됩니다 특정 된 표현형에 따라 달라질 수 있습니다. 여기에 제시된 hiPSC-SMC 차별화와 정화 프로토콜은 2-3 주 ~ 95 % 순수 주로 수축 또는 합성 SMC 인구를 생산하는 최초의, 그리고 절차 requ에 있지 않기 때문에 이종 오염의 위험은 최소화피더 세포의 사용을 반사성.
이식 세포의 생착 속도 향상
효과적인 세포 치료의 주요 장애물 중 하나는 심근 14, 15, 16, 17 접목 투여되는 세포의 수가 매우 낮은 것으로 생각된다. 이러한 IGF-1 시토 킨 더 허혈성 조직 (18, 19), (20)의 유해 미세 견딜 세포를 활성화하여 생착을 향상시킬 수 있지만, 수축시에 유도되는 고압 니들 트랙 통과하여 말초 순환 내로 세포를 짜낼 수있다. 따라서 생착의 상당히 높은 비율은 SAM 때 관찰 된 속도보다 2 배 더 이상이었던 IGF-1을 포함하는 피브린 패치를 통해 세포를 주입함으로써 달성즉 전지 용량은 패치없이 투여 가능성 외막 공간으로 배출되는 것을 방지 셀을 물리적 장벽을 형성 패치 자체 IGF-1의 세포 보호 효과와 모두에 기인 할 수있다.
중요한 단계
엉덩이 세포의 다 능성을 확보하기 위해서는, 종래의 분화에 hiPSC 라인의 핵형을 확인 능성 마커 (Nanog를, SSEA1 및 인 Oct4, 등.)의 표현을 결정하고, 기형 종 형성 그들의 능력을 확인할 필요가 . hiPSC 라인이 10 개 이상의 세대 계대되었을 때 자신의 다 능성을 다시 확인하는 것이 좋습니다. 미분화 hiPSC의 상태는 적절한 분화 중요하다. 분화를 개시하기 전에 hiPSC의 상태를 확인하기 위해,이 추천된다 : 1)) (이하 2 주 새로운 배지를 사용 hiPSC differentiat의 개시 전에 매일 배지를 새로이온; 2) 효소 소화 시간 (이하, 5 분)을 감소시키고, 부드럽게 피펫 셀 아래 셀에 불필요한 손상을 예방하기 위해; 3) 밀도로 6 웰 플레이트의 웰 당 1 × 105 세포를 세포 replate; 4) 항상 37 ℃ 및 5 % CO 2 인큐베이터에서 세포를 유지하고, 15 분 이상 동안 인큐베이터 중에서 세포를 유지 피한다.
기술의 한계
주입 hiPSC 유래 심장 세포 및 패치 관리를 결합하기위한 우리의 방법의 주요 단점은 오픈 가슴 수술에 대한 요구 사항입니다; 따라서, 이러한 접근법은 동시 관상 혈관 재생 수술을받은 환자로서는 부속 요법을 제외한 임상 적용에 직접적으로 병진하기 어렵다. 더 광범위한 임상 사용은 액세스 할 수있는 endoscope- 및 카테터 기반의 접근 방식으로 실용적이고 최소 침습적 전달 방법의 개발이 필요합니다복부와 조리개를 통해 마음입니다. 또한, 심장 세포 치료와 연관된 가장 중요한 안전성 문제 중 하나는 부정맥 합병증의 발전이며, 원숭이가 10 억 hESC의 유래의 CM 심근 내 주사로 처리되었을 때, 동물의 네 자발적 부정맥 (21)을 개발 하였다. 1000 만 hiPSC 유래의 CM이 셀 용량이 작은 100 배했다 아마도 때문에, IR 부상 2 돼지의 마음에 주입했다 때, 우리는 부정맥 합병증의 증거는 관찰되지.
미래 응용 프로그램 또는 방향
면역 거부 가능성이 낮은 생착 속도에 중요한 역할을한다. CRISPR / 카스 유전자 편집 시스템은 녹아웃 (KO) 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 및 클래스 II에 의해 "보편적 인 기증자"hiPSCs의 라인을 만드는 연구를 가능하게 할 수있다. hiPSC MHC KO 유래 세포와 조직 할 수있다 시간생착 실질적으로 높은 비율을 들이죠. 기술 향상으로 생착 속도는 증가 할 가능성이 있습니다. 증가 그래프트 크기의 특정 시점에서, 대형 그래프트가받는 심장 arrhythmogenicity 증가 할 것으로 예상된다. 이식 관련 arrhythmogenicity의 환원은 유전자 편집 기술로 갭 정션 단백질 발현의 증가와 세포를 이용함으로써 달성 될 수있다.
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Disclosures
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol Section 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10 cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Protocol Section 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-β | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Protocol Section 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-β | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Protocol Section 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Protocol Section 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| ε-aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5 T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7 T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
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