Summary
Apresentamos três protocolos de novos e mais eficientes para a diferenciação de células estaminais pluripotentes humanas induzida em cardiomiócitos, células endoteliais, e células do músculo liso e um método de entrega que melhora o enxerto de células transplantadas através da combinação de injecção das células com citocinas entrega mediada por remendo.
Abstract
Humanos induzida células-tronco pluripotentes (hiPSCs) deve ser totalmente diferenciado em tipos específicos de células antes da administração, mas protocolos convencionais para diferenciar hiPSCs em cardiomiócitos (hiPSC-CMS), células endoteliais (hiPSC-ECs), e células musculares lisas (SMCs) são muitas vezes limitada pelo baixo rendimento, pureza e / ou pobre estabilidade fenotípica. Aqui, nós apresentamos novos protocolos para gerar hiPSC-CMs, -ECs, e -SMCs que são substancialmente mais eficiente do que os métodos convencionais, bem como um método para a combinação de injecção de células com um penso contendo citocina criado ao longo do local de administração. O remendo melhora tanto a retenção das células injectadas, por meio de selagem da faixa de agulha para impedir que as células de ser espremido para fora do miocárdio, e a sobrevivência de células, através da libertação do factor de crescimento semelhante a insulina (IGF), durante um período prolongado. Num modelo suíno de lesão de isquemia-reperfusão do miocárdio, a taxa de enxerto era mais do que duas vezes maior quando oAs células foram administrados com o remendo contendo citoquinas em comparação com as células, sem mancha, e o tratamento com ambos as células e o remendo, mas não apenas com as células, foi associada com melhorias significativas na função cardíaca e o tamanho do enfarte.
Introduction
As células estaminais pluripotentes humanas induzida (hiPSCs) estão entre os agentes mais promissores para a terapia celular regenerativo porque eles podem ser diferenciadas em uma gama potencialmente ilimitada e a quantidade de células que não são rejeitadas pelo sistema imunitário do paciente. No entanto, a sua capacidade de auto-replicação e diferenciação podem também levar à formação de tumor e, consequentemente, hiPSCs precisa ser totalmente diferenciadas em tipos de células específicos, tais como cardiomiócitos (CMS), células endoteliais (ECs), e células do músculo liso (SMCs ), antes da administração. Um dos métodos mais simples e mais comum de administração da célula é a injecção directa intramiocardial, mas o número de células transplantadas que são enxertados pelo tecido do miocárdio nativa é excepcionalmente baixa. Muito deste atrito pode ser atribuído ao ambiente citotóxica do tecido isquémico; No entanto, quando as células estaminais embrionárias de murídeo (CES) foram injectados directamente no miocárdio de corações não lesionados, óomente ~ 40% dos 5 milhões de células foram entregues retida durante 3-5 h 1, o que sugere que uma proporção substancial das células administradas saiu do local de administração, talvez por terem sido espremidos para fora através do percurso da agulha pelas altas pressões produzidas durante contração do miocárdio.
Aqui, apresentamos métodos novos e substancialmente mais eficientes para a geração de cardiomiócitos hiPSC derivados (hiPSC-CMS) 2, células endoteliais (hiPSC-ECs) 3, e células musculares lisas (SMCs) 4. Notavelmente, este protocolo hiPSC-SMC é o primeiro a imitar a vasta gama de características morfológicas e funcionais observadas em somática SMCs 5 direccionando as células para um fenótipo de SMC contráctil ou predominantemente sintética. Também fornecemos um método de entrega de células que melhora a taxa de enxerto de células injectadas através da criação de uma citocina de fibrina contendo Patch sobre o local da injecção. O remendo parece melhorar a retenção de células, por meio de selagem da faixa da agulha para evitar que as células se sair do miocárdio, e a sobrevivência de células, através da libertação do factor de crescimento semelhante a insulina (IGF) ao longo de um período de pelo menos três dias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos experimentais são realizados de acordo com as Diretrizes Animal da Universidade de Alabama em Birmingham.
1. Diferenciando hiPSCs em hiPSC-CMs
- Revestir os poços de uma placa de 6 poços com mistura de proteína gelatinoso pré-arrefecido a-factor de crescimento reduzida, a 4 ° C durante a noite. Aspirar a mistura gelatinosa proteína antes da utilização. Semear o hiPSCs nas placas pré-revestidas, e as células de cultura (1 x 10 5 células por poço) em 5% de CO 2 e 37 ° C em meio suplementado com mTeSR1 ROCHA inibidor 10 uM.
- Recarregar a forma diária até as células atingirem confluência de 90%; em seguida, adicione a mistura de proteína gelatinosa-factor de crescimento das reduzida ao meio (0,5 mg mistura gelatinosa proteína por placa de 6 poços, 2 ml de meio por poço), e a cultura das células durante 5% de CO 2 e 37 ° C mais dois dias.
- Para substituir o meio, gentilmente sugar o meio da placa de petri por meio de vácuo compara tocar as células e adicionar novo meio com uma pipeta de transferência.
- Iniciar a diferenciação através da substituição do meio com meio RPMI1640 suplementado com factor de crescimento reduzida-mistura proteína gelatinosa, B27, sem insulina, e 100 ng / ml de Activina A; cultivar as células em 5% de CO 2 e 37 ° C durante 24 h.
- Substituir o meio com meio RPMI1640 que foi suplementado com B27, sem insulina, 10 ng / ml de proteína morfogénica do osso 4 (BMP-4), e factor de 10 ng / mL de crescimento de fibroblastos básico (bFGF); cultivar as células em 5% de CO 2 e 37 ° C durante 96 h.
- Substituir o meio com meio RPMI1640 suplementado com B27 e continuar a cultura das células em 5% de CO 2 e 37 ° C; refrescar o meio a cada 3 dias.
- Observe aglomerados de células contrair sob o microscópio ~ 3 dias após o início da diferenciação. Recolher os aglomerados ~ 7 dias após a primeira observação de contracções e lavá-los em solução salina equilibrada de Hanks.
- Dissociar as células aglomeradas na placa, incubando-as em tampão de Hanks contendo 100 U / ml de colagenase IV durante 10 min a 37 ° C com agitação suave; em seguida, adicionar 0,25% de tripsina em ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) durante 5 min.
- Neutraliza-se a solução de enzima com soro fetal bovino a 10% em meio RPMI / B27 e, em seguida, voltar a suspender as células em meio / B27 RPMI.
- Contar o número de células por hemocitômetro. Cultura das células em placas de 10 cm a 5% de CO 2 e 37 ° C durante pelo menos 3 horas, o que permitirá que as células não-cardiomiócitos para aderir à superfície da placa de cultura.
- Recolha a suspensão de células, que contém a hiPSC-CMS, e manter as células (cerca de 1 x 10 6 culas por prato de 10 cm), cultivando-as sobre uma superfície -Revestido mistura proteica gelatinosa.
2. Diferenciar hiPSCs em hiPSC-ECs
- Dissociar a população hiPSC em células individuais por incubação thos com agente quelante em 5% de CO 2 e 37 ° C durante 5 min. Transferir as células para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo meio de mTeSR1 fresco.
- Girar as células a 200 xg durante 5 min. Ressuspender as células em meio suplementado com mTeSR1 ROCHA inibidor 10 uM. Determinar a densidade de células com um hemocitómetro.
- Adicionar 250 ul de 20 unidades NIH solução de trombina / ml a uma cavidade de uma placa de 24 poços.
- Adicionar 1 x 10 6 hiPSCs para 250 ul de uma solução de fibrinogénio de 12,5 mg / ml. E adicionar os 250 jil de solução de fibrinogénio contendo as células para a trombina-carregado bem. Observe a mistura solidificar para formar um andaime de fibrina contendo hiPSC dentro min.
- Transferir os, suportes contendo as células solidificado em poços de uma placa de 6 poços com a pinça de cobertura de vidro, e iniciar a diferenciação por cultura dos andaimes em 2 ml de meio de EBM2 suplementado com 2% B27, sem insulina, activina-A (50 ng / ml), e BMP-4 (25 ng / ml) durante 24 h em 5% de CO
- Substituir o meio delicadamente sugando o antigo médio através de vácuo, sem tocar nas células. Adicionar novo meio EBM2 suplementado com B27, sem insulina, factor de crescimento endotelial vascular (VEGF, 50 ng / mL), eritropoietina (EPO, 100 ng / ml), e transformando β1 do factor de crescimento (TGF-p1, 10 ng / ml), e a cultura andaimes em 5% de CO 2 e 37 ° C durante 48 h.
- Refrescar o meio de cultura e os andaimes em 5% de CO 2 e 37 ° C durante mais 48 horas; em seguida, libertar as células do andaime por adição de 200 U de colagenase IV (100 U / ml) ao meio.
- Girar as células depois que eles são liberados. Substituir o meio com 2 ml de meio EGM2-MV suplementado com 2% de B27, o VEGF-A (50 ng / ml), e SB-431,542 (10 uM); refrescar o meio de dois em dois dias.
- Aproximadamente 10 dias mais tarde (isto é, em ~ Dia 14 após a diferenciação foi iniciado), dissociar as células com 100 U / ml de colagenase IV, isolar hiPSC-CEs a partir da população de células diferenciadas por meio de citometria de fluxo para analisar a expressão de proteínas marcadoras específicas-CE (por exemplo, CD31, CD144) 3.
- Expanda o isolado hiPSC-ECs através de um protocolo estabelecido 3.
3. Diferenciação hiPSCs em hiPSC-SMCs
- Semear o hiPSCs em placas que foram revestidas com a mistura de proteína gelatinosa, e a cultura das células em meio mTeSR1 em 5% de CO 2 e 37 ° C, com mudanças de meio por dia, até à confluência (~ 2 dias).
- Iniciar a diferenciação em células da linhagem mesodérmica por cultura das células com CHIR99021 (5 uM) e BMP-4 (10 ng / ml) em meio RPMI 1640 e 2% B27 mais insulina durante 3 dias.
- Para produzir hiPSC-PMEs com um fenótipo predominantemente sintética:
- Cultura das células com VEGF-A (25 ng / ml), factor de crescimento de fibroblastos β (FGFβ, 5 ng / ml) em RPMI1640 me dio, e 2% B27 insulina de menos de 5% de CO 2 e 37 ° C durante 4 dias.
- Cultura das células em VEGF-A (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) em meio RPMI 1640, e 2% B27 mais insulina a 5% de CO 2 e 37 ° C durante 2 dias.
- Cultura das células em β factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGFβ, 10 ng / mL), TGF-p (3 ng / ml) em RPMI 1640, e 2% B27 mais insulina a 5% de CO 2 e 37 ° C durante 4 dias.
- Para produzir hiPSC-PMEs com um fenótipo predominantemente contrátil:
- Cultura das células durante 4 dias com VEGF-A (25 ng / ml) e FGFβ (5 ng / ml) em RPMI 1640 e 2% de insulina B27 menos.
- Cultura das células durante 7 dias com PDGFβ (5 ng / ml) e TGF-p (2,5 ng / ml) em RPMI 1640 e 2% B27 mais insulina.
- Purifica-se as populações finais hiPSC-SMC por cultura das células na concentração de lactato (4 mM) contendo RPMI1640 meio metabólico para ~ 6 dias.
- azeite de calor de óleo a 45 ° C num banho de água.
- Calor 5 ml de solução de gelatina a 10% a 50 ° C.
- Adicionar a gelatina para o óleo de oliva, de agitação, e depois arrefecer rapidamente a 5 ° C por adição de gelo ao banho de água.
- Vinte e cinco minutos depois, adicionar acetona refrigerada (4 ° C) para o óleo de oliva para induzir a formação de microsferas.
- Manter a temperatura a 5 ° C durante 1 h; em seguida, recolher as microesferas, lavá-los 5 vezes com acetona pré-arrefecida para remover o azeite, e permitir-lhes secar ao ar, a 4 ° C.
- Ressuspender as microesferas numa solução de 70% de etanol e 0,25% de glutaraldeído durante a noite a 4 ° C, para induzir a reticulação, e, em seguida, neutralizar a mistura com 100 mM de glicina.
- Carga IGF nas microesferas por mistura de 5 mg de microesferas com 15 ul de H2O destilada contendo 5 ug de IGF e 0,1% de albumina de soro de bovino durante 30 min.
5. Criando o patch sobre o local da lesão e injetando as células
- Suspenderá a CMs hiPSC derivado (2 milhões), SMC (1 milhão), e ECs (1 milhão) em conjunto em 1 ml de Meio Essencial Mínimo (MEM).
- Suspender 5 mg de microesferas em 1 ml de solução de fibrinogénio (25 mg / ml).
- Encher uma seringa com a solução contendo as células, uma outra seringa com a solução de fibrinogénio / microesfera, e uma terceira seringa com 1 ml de solução de trombina (80 unidades NIH / mL, suplementada com 2 ul de CaCl 400 mM de 2 e 200 mM de ε-aminocapróico ácido).
- Cirurgicamente induzir enfarte do miocárdio no coração suína através de ligadura da artéria descendente anterior coronária como descrito anteriormente 2.
NOTA: Em resumo, fêmea suína Yorkshire (~ 13 kg, 45 dias de idade) são sedados com injecção intramuscular de Telazol / Xilazina (4,4 mg / kg), e entubados sob anestesia geral com isoflurano (0,5-5%). A 4 th interctoracotomia Ostal é realizada e deixou artéria coronária descendente anterior é exposto. A artéria coronária é tapada por uma ligadura durante 60 minutos e, em seguida, a ligadura é removida. desfibrilhação eléctrica imediata é realizada, no caso de fibrilação ventricular. - Coloque um anel de plástico estéril (~ 2,5 cm) sobre o epicárdio da região infartada de corações de suínos, e depois injetar simultaneamente as soluções de microesferas / fibrinogênio e trombina para o ringue.
- Permitir que a mistura solidifique (~ 30 seg), e, em seguida, inserir a agulha da seringa contendo as células através da mistura solidificada no miocárdio enfartado e injectar as células. Feche as camadas musculares, tecido subcutâneo e da parede torácica com 3-0 ou 2-0 monocryl sutura dependendo do tamanho do animal. A buprenorfina 0,01-0,02 mg injecção intramuscular / kg cada 8 horas será usado para controlar a dor para os primeiros 3 dias após a cirurgia.
- Avaliar a função cardíaca usando uma ressonância magnética cardíaca(MRI) antes do procedimento cirúrgico, e uma semana, quatro semanas após o procedimento cirúrgico 2, 3, 4. Após os estudos finais de ressonância magnética, sacrificar o animal e processar seus corações para histologia e análise molecular de 2, 3, 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Caracterização de Diferenciada hiPSC-CMs, -ECs e -SMCs
A capacidade diferencial de hiPSCs foram avaliados 2, 3, 4. Análises de citometria de fluxo de expressão de troponina T (TnT) sugerem que a pureza da população final hiPSC-CM pode exceder 90% (Figura 1A, 1B, painel B1). Quase todas as células expressaram lenta miosina de cadeia pesada (Figura 1B, o painel A1), α-sarcomérica actina (Figura 1B, o painel A2), enquanto que cerca de 25%, expresso da isoforma 2v da cadeia leve da miosina (MLC2v) (Figura 1B, o painel B2), que foi encontrado apenas em ventricular CMs 4. A eficiência do protocolo de diferenciação hiPSC-CE (isto é, a percentagem de CD31 + células) foi substantially maior quando realizada com hiPSCs da linha de apertos (45,6%, Figura 1C, painel C2) do que com células PCBC16iPS (31,3%, Figura 1C, D2 painel); populações de> 95% de pureza foram obtidos através de selecção para a expressão de CD31, e> 90% das células seleccionadas continuou a expressar CD31 ou CD144 de até 4 semanas quando cultivadas em meio EGM2-MV (sem FBS) suplementado com B27, o VEGF, e SB431542 (Figura 1D) 3. Mais de 94% do purificado hiPSC-PMEs expressaram actina de músculo liso (SMA), mas sintético hiPSC-PMEs eram mais prováveis que contrátil hiPSC-SMCs para expressar colágeno 1, conexina 43, ou vimentina (Figura 1E). A capacidade de migração e proliferação de hiPSC-CML foram avaliados 4. Sintético hiPSC-CML, também foram mais migratório e proliferativo do que contráctil hiPSC-SMC (Figura 1F, painéis I e II), enquanto que as SMC contráctil contraído mais fortemente in resposta ao tratamento com carbacol (Figura 1F, painéis III, IV e V).
Do fator de crescimento de lançamento a partir de gelatina Microesferas
Medições de ELISA de IGF-1 na forma de remendos de cultura, isentas de células indicou que o factor de crescimento foi libertado das microesferas ao longo de um período de pelo menos 3 dias (Figura 2A) 2. As análises foram realizadas por carregamento de 5 mg de microsferas contendo IGF com 5 ug de IGF-1. Um emplastro foi gerado por mistura das microsferas com 1 ml de solução de fibrinogénio e 1 ml de trombina. O patch foi cultivada em 2 ml MEM. Um ml de meio foi colhido e substituído por 1 ml de MEM fresco todos os dias (Figura 2B). Os dados foram apresentados como média ± SEM.
Observações de um modelo IR-lesão
2. Um total de 6.000.000 hiPSC-CMs, -ECs, e -SMCs (2 milhões de cada tipo de célula) foram injectados directamente no tecido do miocárdio lesionado. Para os animais do grupo de Células + Patch, um adesivo composto por fibrina e de IGF-1 contendo microesferas foi criado sobre o local do ferimento, antes da injecção, enquanto que os animais no grupo de células, foram tratados com a mesma dose de células, mas sem a aplicação do adesivo; ambos os tratamentos foram retidos de animais no grupo MI. Quatro semanas após a lesão e tratamento, 9% das células entregues aos animais no grupo de células + remendo foram retidos e continuaram a sobreviver no local de administração, em comparação com apenas 4% das células administradas aos animais no grupo de células (Figura 3A). O tratamento com ambas as células e o patch, mas não apenas com as células, também foi associado a melhorias significativas nas medidas de função cardíaca e tamanho do infarto (Figura 3B).
Figura 1: diferenciação de hiPSCs em cardiomiócitos, células endoteliais e células musculares lisas. Diferenciação de cardiomiócitos e a pureza de hiPSC-CMs foram avaliados por meio de citometria de fluxo (A) e histologia com diferentes marcadores cardíacos (B). A diferenciação endotelial de hiPSC foi determinada com a citometria de fluxo (C). A manutenção do fenótipo endotelial de hiPSC-CEs foi avaliada através da análise da expressão de CD31 e CD144 em 2, 3, e 4 semanas após a purificação por citometria de fluxo (D). A diferenciação das células do músculo liso da hiPSC foi medida por vários marcadores (E). E a migração e proliferação de potencialAs células musculares lisas sintéticos comparada contrácteis células musculares lisas derivadas de hiPSCs foi avaliada (F). Os núcleos foram contrastadas com DAPI na coloração por imunofluorescência. Barra de escala = 100 pm em (B) e 200 um (E e F). A capacidade de migração e proliferação de SMC-hiPSC sintética foram avaliadas (F, painel I e II). E contracção de SMC contráctil em resposta ao tratamento com carbacol foi avaliada (F, painel iii-v). * P <0,05, sintética hiPSC-SMCs vs. contrátil hiPSC-CML. A e B foram modificados a partir de L Ye, et ai. 2. C e D foram modificados a partir de Zhang S, et al. 3. E e F foram modificados a partir de Yang L, et ai. 4. Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). Comparação entre dois grupos foi avaliada pelo teste t de Student, ea comparação entre vários grupos foi avaliada através de one-way ANOVA. p <0,05 foi considerado signifiCant. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Liberação de fatores de crescimento de microesferas. Foi sintetizado contendo IGF-microesferas (A). IGF-1 a partir de microsferas de libertação foi medida a 1, 3, 5 e 7 dias depois de terem sido sintetizados (B). Barra de escala = 200 pm. O painel A foi modificado a partir de L. Ye, et ai. 2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação da eficiência da terapia celular com cel das três linhagens hiPSC derivadasls. A taxa de enxertamento geral para a população de três células foi avaliado 4 semanas após o transplante de células (A). A função cardíaca (como indicado pela fracção de ejecção) e o tamanho do enfarte foi avaliada por meio de ressonância magnética cardíaca em 1 e 4 semanas após o transplante de células (B). * P <0,05 em relação MI; #p <0,05 em relação Patch. A e B foram modificados a partir de L. Ye, et ai. 2. Os dados foram apresentados como média ± SEM. As comparações entre grupos foram analisadas para significância com ANOVA de uma via. P <0,05 foi considerado significativo. Os resultados identificados como significativos através de ANOVA foram reanalisados com a correção de Tukey.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Melhorou Rendimento / Pureza de hiPSC-CMs
protocolos convencionais para diferenciação de células-tronco humanas no CMS são muitas vezes limitadas pela baixa produtividade e pureza; por exemplo, apenas 35-66% das hESC-CMs obtido via separação Percoll e formação do corpo cardíaca expressa lento miosina de cadeia pesada ou cTnT 6. A pureza das populações hiPSC-CM diferenciadas pode ser substancialmente aumentada, seleccionando para a expressão de um gene repórter que foi ligada ao promotor de um-CM específico proteína 7, 8, 9, mas esta técnica exige necessariamente a utilização de microrganismos geneticamente modificados As células, que são menos desejáveis, particularmente para investigações clínicas. Com o protocolo aqui apresentado, 68% do hiPSC-CMs expressa cTnT e a pureza foi posteriormente aumentado para> 90% por meio de micro-dissecção e preplating sem manipulação genética ou únicaselecção -cell. O rendimento total foi de ~ 3-5000000 hiPSC-CMS por poço.
Melhorou Rendimento / Estabilidade da hiPSC-ECs
Os dois protocolos de diferenciação hiPSC-CE mais comumente usados são baseados em co-cultura com células murinas do estroma 10, 11 e formação embrionária-body 12, 13. No entanto, o método de co-cultura poderiam levar à contaminação xenogénica com células de murino da linhagem ou proteínas de 10, e apenas ~ 15% ou menos das células produzidas através do método embrionário-corpo assumir um fenótipo CE 10, 12, 13. O protocolo de diferenciação hiPSC-CE aqui apresentada elimina o risco de contaminação xenogénica e pode ser até três vezes mais eficiente do que os métodos que utilizam corpos embrióides (dependendo de qual linha é utilizado hiPSC). Furthermminério, após purificação por meio de selecção para a expressão de CD31, ~ 90% do hiPSC-CEs mantido o fenótipo CE durante pelo menos 4 semanas in vitro, em comparação com apenas duas semanas quando hiPSC-ECS são produzidos por meio de protocolos convencionais de diferenciação 12.
Fenotípica Especificação de hiPSC-SMCs
O fenótipo de um SMC (ou uma população de SMC) é talvez melhor descrito como um equilíbrio entre as características predominantemente contráteis e sintéticas, o que pode levar a diferenças substanciais na morfologia, expressão do marcador e atividade. Assim, a utilidade de hiPSC-SMCs para uma aplicação particular pode depender de qual fenótipo específico é gerado. A diferenciação e purificação protocolos hiPSC-SMC aqui apresentados são os primeiros a produzir populações predominantemente contrácteis ou sintéticos que são SMC ~ 95% de pureza em apenas 2-3 semanas, e o risco de contaminação xenogénica é mínimo, pois os procedimentos não require o uso de células alimentadoras.
Melhorou Enxerto Taxa de células transplantadas
Um dos principais obstáculos para a terapia celular eficaz se acredita ser o número extremamente baixo de células administradas que são enxertadas pelo miocárdio 14, 15, 16, 17. As citoquinas, tais como o IGF-1 pode melhorar o enxerto, permitindo que as células a suportar melhor o microambiente tóxicos em tecidos isquémicos 18, 19, 20, mas as altas pressões induzidas durante a contracção pode espremer as células para fora através do percurso da agulha e para dentro da circulação periférica. Assim, a taxa consideravelmente mais elevada de enxerto obtida, injectando as células por meio de um adesivo de fibrina contendo o IGF-1-, que era mais de duas vezes maior do que a taxa observada quando o samdosagem de células e foi administrado sem o adesivo, pode provavelmente ser atribuída tanto para os efeitos citoprotectores de IGF-1 e para o próprio remendo, que se formou uma barreira física que impediu as células de ser ejectado para dentro do espaço epicárdico.
Passos críticos
Para garantir a pluripotência das células quadris, é necessário verificar o cariótipo da linha hiPSC antes da diferenciação, determinar a expressão de marcadores de pluripotência (Nanog, SSEA1 e Oct4, et al.), E confirmar a sua capacidade de formação de teratoma . Sugere-se para re-verificar a sua pluripotência quando as linhas hiPSC foram passadas por mais de 10 gerações. O estado de hiPSC indiferenciado é também crucial para a diferenciação correcta. Para garantir o estado da hiPSC antes do início da diferenciação, recomenda-se a: 1) usar meio fresco (menos de duas semanas de idade), e actualizar a média diária antes do início do hiPSC Diferenciadíon; 2) reduzir o tempo de digestão enzimática (inferior a 5 min), e gentilmente pipeta cima e para baixo as células para evitar o deteriorar as células; 3) replate as células a uma densidade de 1 x 10 5 células por poço da placa de 6 poços; 4) sempre manter as células em 37 ° C e 5% de CO2, e evitar manter as células fora da incubadora durante mais de 15 min.
Limitações da técnica
A principal desvantagem do nosso método para combinar células cardíacas derivadas de hiPSC injetados e administração de patches é a exigência de uma cirurgia de peito aberto; Assim, esta abordagem é pouco provável que seja directamente transponível para aplicações clínicas, exceto como terapia adjuvante para os pacientes que são submetidos à cirurgia de revascularização coronária concomitante. uso clínico mais difundido exigirá o desenvolvimento de um método de entrega prático e minimamente invasiva, como uma abordagem endoscope- e cateter com base em que podem acessaro coração através do abdômen e diafragma. Além disso, uma das preocupações mais críticas de segurança associados com a terapia de célula cardíaca é o desenvolvimento de complicações arritmogênicas, e quando os macacos foram tratados com injeções intramiocárdicos de 1 bilhão de CMs derivadas de células estaminais embrionárias humanas, todos os quatro animais desenvolveram arritmias espontâneas 21. No entanto, observamos nenhuma evidência de complicações arritmogênicas quando 10 milhões de CMs derivados de hiPSC foram injetados nos corações de suínos com lesão IR 2, talvez porque a dose de células era 100 vezes menor.
Aplicações futuras ou Directions
rejeição imunitária desempenha provavelmente um papel importante para a taxa de enxertamento baixo. O sistema de edição gene CRISPR / Cas pode permitir aos investigadores criar uma linha de hiPSCs "doador universal" por nocaute (KO) complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I e classe II. As células hiPSC MHC-KO derivados e tecidos podem have taxas substancialmente mais elevados de enxerto. Como técnicas de melhorar, as taxas de enxerto são susceptíveis de aumentar. Em determinado ponto do aumento do tamanho do enxerto, o grande enxerto é esperado um aumento da arrhythmogenicity do coração destinatário. A redução de enxertos associados arrhythmogenicity poderia ser conseguido através da utilização de células com o aumento da diferença de expressão de proteínas de junção pela tecnologia de edição de gene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol Section 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10 cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Protocol Section 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-β | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Protocol Section 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-β | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Protocol Section 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Protocol Section 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| ε-aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5 T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7 T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
- Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
- Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
- Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
- Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
- Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
- Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
- Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
- Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
- Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
- Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
- Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
