Summary
Vi præsenterer tre hidtil ukendte og mere effektive protokoller til differentiering menneskelige inducerede pluripotente stamceller til cardiomyocytter, endotelceller og glatte muskelceller og en leveringsmetode, der forbedrer indpodning af transplanterede celler ved at kombinere celle injektion med patch-medieret cytokin levering.
Abstract
Menneskelige induceret pluripotente stamceller (hiPSCs) skal være fuldt differentieret i bestemte celletyper før administration, men konventionelle protokoller for differentiering hiPSCs i cardiomyocytter (hiPSC-CMS), endotelceller (hiPSC-ECS), og glatte muskelceller (SMC'er) er ofte begrænset af lavt udbytte, renhed og / eller dårlig fænotypisk stabilitet. Her præsenteres nye protokoller for generering hiPSC-CMS -ECs og -SMCs som er betydelig mere effektiv end konventionelle metoder, samt en fremgangsmåde til at kombinere celle injektion med en cytokin-holdig plaster skabt over administrationsstedet. Plasteret forbedrer både tilbageholdelsen af de injicerede celler, ved forsegling nålen spor for at forhindre cellerne i at blive presset ud af myocardiet, og celleoverlevelse, ved at frigive insulin-lignende vækstfaktor (IGF) over en længere periode. I et svin model af myokardieiskæmi-reperfusionsskade, satsen for transplantation var mere end to gange større, nårceller blev administreret med cytokin-holdige plaster sammenligne til cellerne uden plaster, og behandling med både cellerne og plasteret, men ikke med alene cellerne, var forbundet med signifikante forbedringer i hjertefunktion og infarktstørrelse.
Introduction
Humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) er blandt de mest lovende midler til regenerativ celleterapi, fordi de kan opdeles i en potentielt ubegrænset udvalget og mængden af celler, der ikke er afvist af patientens immunsystem. Imidlertid kan deres evne til selv-replikation og differentiering også føre til tumordannelse og følgelig skal fuldt differentieret til specifikke celletyper, såsom cardiomyocytter (CMS), endotelceller (ECS), og glatte muskelceller hiPSCs (SMC'er ), før indgivelse. En af de enkleste og mest almindelige metoder til celle administration er direkte intramyocardial injektion, men antallet af transplanterede celler, der er inkorporeret ved det native myokardievæv er usædvanlig lav. Meget af denne nedslidning kan tilskrives den cytotoksiske miljø i iskæmisk væv; men når murine embryonale stamceller (EKSF) blev injiceret direkte i myokardium af ubeskadigede hjerter, oun ~ 40% af de 5 millioner celler leveret blev bibeholdt i 3-5 timer 1, hvilket tyder på, at en væsentlig del af de administrerede celler forladt indgiftsstedet, måske fordi de blev presset ud gennem nålen spor ved de høje tryk frembragt under myocardial kontraktion.
Her præsenteres hidtil ukendte og betydelig mere effektive metoder til generering hiPSC-afledte cardiomyocytter (hiPSC-CMS) 2, endotelceller (hiPSC-ECS) 3, og glatte muskelceller (SMC'er) 4. Især denne hiPSC-SMC protokol er den første til at efterligne den brede vifte af morfologiske og funktionelle karakteristika observeret i somatisk SMC'er 5 ved at dirigere cellerne mod en overvejende syntetiske eller kontraktile SMC fænotype. Vi giver også en fremgangsmåde til celle levering, der forbedrer engraftment rate af injicerede celler ved at skabe et cytokin-indeholdende fibrin patch over injektionsstedet. Plasteret synes at forbedre både celle fastholdelse, ved forsegling nålen spor for at forhindre cellerne i at forlade myocardium, og celleoverlevelse, ved at frigive insulin-lignende vækstfaktor (IGF) over en periode på mindst tre dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer udføres i overensstemmelse med Animal retningslinjer fra University of Alabama i Birmingham.
1. Differentiering hiPSCs i hiPSC-CM
- Coate brøndene i en plade med 6 brønde med forafkølet vækst-faktor-reducerede proteinblanding gelatinøse ved 4 ° C natten over. Aspirere den gelatinøse proteinblanding før brug. Pode hiPSCs onto præcoatede plader, og dyrke cellerne (1 x 10 5 celler per brønd) ved 5% CO2 og 37 ° C i mTeSR1 medium supplement med 10 pM ROCK inhibitor.
- Opdater mediet dagligt, indtil cellerne når 90% sammenløb; derefter tilsættes vækst-faktor-reducerede gelatinøse proteinblanding til medium (gelatinøse proteinblanding 0,5 mg pr 6-brønds plade, 2 ml medium per brønd) den, og dyrke cellerne i 5% CO2 og 37 ° C to dage mere.
- For at udskifte mediet, forsigtigt suge ud mediet fra petriskålen via vakuum medud røre cellerne og tilføje nye medie under anvendelse af en overførsel pipette.
- Initiere differentiering ved at erstatte mediet med RPMI1640-medium suppleret med vækst-faktor-reducerede gelatinøse proteinblanding, B27 uden insulin, og 100 ng / ml activin A; dyrke cellerne ved 5% CO2 og 37 ° C i 24 timer.
- Erstatte mediet med RPMI1640 medium, der er suppleret med B27 uden insulin, 10 ng / ml knoglemorfogent protein 4 (BMP-4) og 10 ng / ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF); dyrke cellerne ved 5% CO2 og 37 ° C i 96 timer.
- Erstatte mediet med RPMI1640-medium suppleret med B27 og fortsætte dyrke cellerne ved 5% CO2 og 37 ° C; opdatere medium hver 3. dag.
- Overhold klynger af ordregivende celler under mikroskop ~ 3 dage efter initiering differentiering. Saml de klynger ~ 7 dage efter første observation sammentrækninger og vaske dem i Hanks Balanced Salt Solution.
- Dissociere de grupperede-cellerne i pladen ved inkubering dem i Hanks puffer indeholdende 100 U / ml collagenase IV i 10 minutter ved 37 ºC under forsigtig omrystning; derefter tilsættes 0,25% trypsin i ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i 5 minutter.
- Neutraliser enzymopløsningen med 10% føtalt bovint serum i RPMI / B27 medium og derefter resuspenderes cellerne i RPMI / B27 medium.
- Tæl antallet af celler ved hæmocytometer. Kultur cellerne på 10 cm skåle ved 5% CO2 og 37 ° C i mindst 3 timer, som vil give ikke-cardiomyocyte celler til at klæbe til overfladen af dyrkningsskålen.
- Saml cellesuspensionen, som indeholder hiPSC-CMS og vedligeholde cellerne (ca. 1 x 10 6 celler pr 10 cm skål) ved dyrkning dem på en gelatinøs proteinblanding overtrukne overflade.
2. Differentiering hiPSCs i hiPSC-EC'er
- Dissociere hiPSC population i enkelte celler ved at inkubere them med chelateringsmiddel ved 5% CO2 og 37 ° C i 5 minutter. Overfør cellerne til et 15 ml centrifugerør indeholdende frisk mTeSR1 medium.
- Spin ned cellerne ved 200 x g i 5 min. Resuspender cellerne i mTeSR1 medium suppleret med 10 pM ROCK inhibitor. Bestem celledensiteten med et hæmocytometer.
- Tilsættes 250 pi af 20 NIH-enheder / ml thrombinopløsning til en brønd af en 24-brønds plade.
- Tilsæt 1 x 10 6 hiPSCs til 250 pi af en 12,5 mg / ml fibrinogen-opløsning. Og tilsæt 250 pi celleholdige fibrinogenopløsningen og thrombin-loaded godt. Overhold blandingen størkne for at danne en hiPSC indeholder fibrin stillads inden min.
- Overfør det størknede, celleholdige stilladser i brøndene på en plade med 6 brønde med dækglasset pincet, og initiere differentiering ved dyrkning af stilladser i 2 ml EBM2 medium suppleret med 2% B27 uden insulin, activin-A (50 ng / ml), og BMP-4 (25 ng / ml) i 24 timer ved 5% CO
- Erstat mediet ved forsigtigt at suge den gamle medium med vakuum uden at røre cellerne. Tilføj ny EBM2 medium suppleret med B27 uden insulin, vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF, 50 ng / ml), erythropoietin (EPO, 100 ng / ml), og transformerende vækstfaktor β1 (TGFp1, 10 ng / ml), og kultur stilladser ved 5% CO 2 og 37 ° C i 48 timer.
- Opdatere mediet og kultur stilladserne ved 5% CO2 og 37 ° C i yderligere 48 timer; derefter, frigiver cellerne fra stilladset ved tilsætning af 200 U collagenase IV (100 U / ml) til mediet.
- Spin ned cellerne efter de er frigivet. Erstatte mediet med 2 ml EGM2-MV-medium suppleret med 2% af B27, VEGF-A (50 ng / ml), og SB-431.542 (10 uM); opdatere mediet hver anden dag.
- Ca. 10 dage senere (dvs. på ~ Dag 14 efter differentiering blev indledt), dissociere cellerne med 100 U / ml collagenase IV, isolere hiPSC-EC'er fra populationen af differentierede celler via flow-cytometri analyser for ekspressionen af EF-specifikke markørproteiner (fx CD31, CD144) 3.
- Udvid isolerede hiPSC-EC'er via en etableret protokol 3.
3. Differentiering hiPSCs i hiPSC-SMC'er
- Pode hiPSCs på plader, der er blevet overtrukket med gelatinøse proteinblandingen og dyrke cellerne i mTeSR1 medium ved 5% CO2 og 37 ° C, med daglige udskiftning af medium, indtil sammenflydende (~ 2 dage).
- Initiere differentiering til mesodermal-afstamningsceller ved dyrkning af cellerne med CHIR99021 (5 uM) og BMP-4 (10 ng / ml) i RPMI1640-medium og 2% B27 plus insulin i 3 dage.
- At producere hiPSC-SMC'er med en overvejende syntetisk fænotype:
- Dyrke cellerne med VEGF-A (25 ng / ml), fibroblastvækstfaktor β (FGFβ, 5 ng / ml) i RPMI1640 mig dium, og 2% B27 minus insulin ved 5% CO2 og 37 ° C i 4 dage.
- Dyrke cellerne i VEGF-A (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) i RPMI1640-medium, og 2% B27 plus insulin ved 5% CO2 og 37 ° C i 2 dage.
- Dyrke cellerne i blodpladeafledte vækstfaktor β (PDGFβ, 10 ng / ml), TGFp (3 ng / ml) i RPMI1640, og 2% B27 plus insulin ved 5% CO2 og 37 ° C i 4 dage.
- At producere hiPSC-SMC'er med en overvejende kontraktil fænotype:
- Dyrke cellerne i 4 dage med VEGF-A (25 ng / ml) og FGFβ (5 ng / ml) i RPMI1640 og 2% B27 minus insulin.
- Dyrke cellerne i 7 dage med PDGFβ (5 ng / ml) og TGFp (2,5 ng / ml) i RPMI1640 og 2% B27 plus insulin.
- Oprens de endelige hiPSC-SMC populationer ved at dyrke cellerne i lactat (4 mM) indeholdende RPMI1640 metabolisk medium for ~ 6 dage.
- Opvarm olivenolie til 45 ° C i et vandbad.
- Heat 5 ml 10% gelatine-opløsning til 50 ° C.
- Tilsæt gelatine til olivenolie, der omrøres, og derefter hurtigt afkøles til 5 ° C ved tilsætning af is til vandbad.
- Tyve minutter senere tilsættes afkølet (4 ° C) acetone til olivenolien at inducere mikrosfære formation.
- Oprethold temperaturen på 5 ° C i 1 time; derefter, indsamle mikrokuglerne, vaske dem 5 gange med forafkølet acetone for at fjerne den olivenolie, og tillade dem at lufttørre ved 4 ° C.
- Resuspendere mikrosfærerne i en opløsning af 70% ethanol og 0,25% glutaraldehyd natten over ved 4 ° C for at inducere tværbinding, og derefter neutralisere blandingen med 100 mM glycin.
- Load IGF i mikrosfærerne ved at blande 5 mg mikrosfærer med 15 pi destilleret H2O indeholdende 5 ug IGF og 0,1% bovint serumalbumin i 30 minutter.
5. Oprettelse af Patch løbet skadestedet og injicere Cells
- Hæng hiPSC-afledte CMS (2 millioner), SMC'er (1 million), og ECS (1 million) sammen i 1 ml Minimum Essential Medium (MEM).
- Suspender 5 mg mikrosfærer i 1 ml fibrinogen-opløsning (25 mg / ml).
- Fyld en sprøjte med celleholdige opløsning, en anden sprøjte med fibrinogen / mikrokugle-opløsning, og et tredje sprøjte med 1 ml thrombinopløsning (80 NIH-enheder / ml, suppleret med 2 pi 400 mM CaCl2 og 200 mM ε-aminocapronsyre syre).
- Kirurgisk inducere myokardieinfarkt hos svin hjertet via ligering af venstre forreste nedadgående kranspulsåre som beskrevet før 2.
BEMÆRK: I korte træk kvindelige Yorkshire svin (~ 13 kg, 45 dage gamle) er sederet med intramuskulær injektion af telazol / xylazin (4,4 mg / kg), og intuberet under generel anæstesi med isofluran (0,5-5%). A 4 th intercOstal torakotomi og venstre forreste nedadgående koronararterie er blotlagt. Kranspulsåren okkluderes af en ligatur i 60 minutter og derefter ligaturen fjernes. Umiddelbar elektrisk defibrillering udføres i tilfælde af ventrikulær fibrillation. - Placer en steril plastik ring (~ 2,5 cm) på epikardiet af infarktområdet region svin hjerter, og derefter samtidigt injicere mikrokuglernes / fibrinogen og thrombin løsninger i ringen.
- Lad blandingen størkne (~ 30 sek), og derefter indsætte nålen i den celleholdige sprøjten gennem den størknede blanding i infarktområdet myocardium og injicere cellerne. Luk muskel lag, subkutant væv og brystvæggen med 3-0 eller 2-0 Monocryl sutur afhængig af dyrets størrelse. Buprenorphin 0,01-0,02 mg / kg intramuskulær injektion hver 8. time vil blive brugt til at kontrollere smerte i de første 3 dage efter operationen.
- Evaluere hjertefunktionen ved anvendelse af en hjerte- magnetisk resonans(MRI) før kirurgisk procedure, en uge og fire uger efter den kirurgiske procedure 2, 3, 4. Efter den endelige MRI undersøgelser, ofrer dyret og behandle deres hjerter til histologi og molekylær analyse 2, 3, 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering af differentieret hiPSC-CMS -ECs, og -SMCs
Den differentielle evne hiPSCs blev evalueret 2, 3, 4. Flowcytometri analyser af kardial troponin T (cTnT) ekspression antyder, at renheden af det endelige hiPSC-CM population kan overstige 90% (figur 1A, 1B, panel B1). Næsten alle de celler udtrykte langsom myosin tung kæde (figur 1B, panel A1), α-sarcomerisk actin (figur 1B, panel A2), mens ca. 25% udtrykte 2v isoformen af myosin let kæde (MLC2v) (figur 1B, panel B2), der fandtes kun i ventrikulær CM 4. Effektiviteten af hiPSC-EF-differentiering protokol (dvs. procentdelen af CD31 + celler) var substantially højere, når udført med hiPSCs fra grebene linje (45,6%, figur 1C, panel C2) end med PCBC16iPS celler (31,3%, figur 1C, panel D2); populationer af> 95% renhed blev opnået via selektion for CD31-ekspression, og> 90% af de udvalgte celler fortsatte med at udtrykke CD31 eller CD144 i op til 4 uger ved dyrkning i EGM2-MV-medium (uden FBS) suppleret med B27, VEGF, og SB431542 (figur 1D) 3. Mere end 94% af den oprensede hiPSC-SMC'er udtrykte glatmuskelactin (SMA), men syntetisk hiPSC-SMC'er var mere sandsynligt end kontraktil hiPSC-SMC'er at udtrykke collagen 1, connexin 43, eller vimentin (Fig 1E). Migrationen og spredning evne hiPSC-SMC'er blev evalueret 4. Syntetisk hiPSC-SMC'er var også mere vandrende og proliferativ end kontraktilt hiPSC-SMC'er (fig 1F, paneler i og ii), medens kontraktile SMC'er kontraheret stærkere in respons på carbachol behandling (figur 1F, paneler III, IV og V).
Vækst-faktor Frigivelse fra Gelatine mikrosfærer
ELISA-målinger af IGF-1-niveauer i mediet fra dyrkede, cellefrie plastre indikerede, at vækstfaktoren blev frigivet fra mikrosfærerne i løbet af en periode på mindst 3 dage (figur 2A) 2. Analyserne blev udført ved at fylde 5 mg IGF-holdige mikrokugler med 5 ug IGF-1. Et plaster blev dannet ved blanding af mikrosfærer med 1 ml fibrinogen-opløsning og 1 ml thrombin. Plastret blev dyrket i 2 ml MEM. En ml af mediet blev opsamlet og erstattet med 1 ml frisk MEM hver dag (figur 2B). Data blev præsenteret som gennemsnit ± SEM.
Observationer fra en IR-skade Model
2. I alt 6 millioner hiPSC-CMS -ECs, og -SMCs (2 millioner af hver celletype) blev injiceret direkte i det skadede myokardievæv. For dyr i cellen + Patch-gruppe, et plaster sammensat af fibrin og IGF-1-holdige mikrosfærer blev skabt over læsionsstedet før injektion, mens dyr i CELL gruppe blev behandlet med den samme celle dosis, men uden plasteret; begge behandlinger blev tilbageholdt fra dyr i MI-gruppen. Fire uger efter beskadigelse og behandling, blev 9% af cellerne er leveret til dyr i CELL + Patch gruppe opbevares og fortsatte med at overleve ved stedet for administration, sammenlignet med kun 4% af cellerne administreres til dyr i cellegruppe (figur 3A). Behandling med både celler og plasteret, men ikke med alene cellerne, var også associeredetet til betydelige forbedringer i undersøgelser af hjertefunktionen og infarktstørrelse (figur 3B).
Figur 1: Differentiering af hiPSCs i cardiomyocytter, endotelceller og glatte muskelceller. Cardiomyocyte differentiering og renheden af hiPSC-CM blev evalueret via flowcytometri (A) og histologi med forskellige hjertemarkører (B). Endotel differentiering af hiPSC blev bestemt med flowcytometri (C). Vedligeholdelsen af endothelial fænotype af hiPSC-EC'er blev vurderet via analysere ekspressionen af CD31 og CD144 på 2, 3, og 4 uger efter oprensning ved flowcytometri (D). Den glatte muskelceller differentiering af hiPSC blev målt ved forskellige markører (E). Og migrationen og proliferationen potentialesyntetiske glatmuskelceller vs. kontraktile glatte muskelceller afledt fra hiPSCs blev vurderet (F). Kerner blev modfarvet med DAPI i immunfluorescensfarvning. Scale bar = 100 um i (B) og 200 um (E og F). Migrationen og proliferationen evne af syntetisk hiPSC-SMC'er blev evalueret (F, panel i og ii). Og sammentrækning af kontraktile SMC'er som respons på carbachol behandling blev vurderet (F, panel iii-v). * P <0,05, syntetisk hiPSC-SMC'er vs. kontraktil hiPSC-SMC'er. A og B blev modificeret fra Ye L, et al. 2. C og D blev ændret fra Zhang S, et al. 3. E og F blev modificeret fra Yang L, et al. Fire. Data blev præsenteret som gennemsnit ± standardfejl af middelværdien (SEM). Sammenligning mellem to grupper blev evalueret via Students t-test, og sammenligning mellem flere grupper blev vurderet via envejs ANOVA. p <0,05 blev betragtet significant. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Frigivelse af vækstfaktorer fra mikrosfærer. IGF-holdige mikrosfærer blev syntetiseret (A). IGF-1 frigivelse fra mikrosfærer blev målt efter 1, 3, 5 og 7 dage efter de blev syntetiseret (B). Scale bar = 200 um. Panel A blev modificeret fra Ye L., et al. 2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Vurdering af effektiviteten af celleterapi med hiPSC-afledte trilineage cells. Den samlede indpodning sats for tre cellepopulation blev vurderet 4 uger efter celletransplantation (A). Hjertefunktion (som angivet ved uddrivningsfraktion) og infarkt størrelse blev evalueret via cardiac MRI efter 1 og 4 uger efter celletransplantation (B). * P <0,05 versus MI; #p <0,05 versus Patch. A og B blev modificeret fra Ye L., et al. 2. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SEM. Sammenligninger mellem grupper blev analyseret for signifikans med én-vejs ANOVA. p <0,05 blev betragtet som signifikant. Resultater udpeget som væsentlige via ANOVA blev analyseres igen med Tukey korrektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forbedret Udbytte / renhed hiPSC-CM
Konventionelle protokoller til differentiering humane stamceller ind i CMS ofte begrænset af lavt udbytte og renhed; for eksempel kun 35-66% af embryonale-CM opnået via Percoll separation og hjerte krop dannelse udtrykt langsom myosin tung kæde eller cTnT 6. Renheden af differentierede hiPSC-CM populationer kan øges væsentligt ved at vælge for ekspressionen af et reportergen, der er forbundet til promotoren af et CM-specifikt protein 7, 8, 9, men denne teknik nødvendigvis kræver anvendelse af genetisk modificerede celler, som er mindre ønskelig, især til klinisk afprøvning. Med den protokol, der præsenteres her, 68% af hiPSC-CM udtrykte cTnT, og renheden blev senere øget til> 90% via mikro-dissektion og preplating uden genmanipulation eller single-celle udvælgelse. Det totale udbytte var ~ 3 til 5.000.000 hiPSC-CMS per brønd.
Forbedret Udbytte / Stabilitet af hiPSC-EC'er
De to mest almindeligt anvendte hiPSC-EF differentiering protokoller er baseret på co-dyrkning med murine stromale celler 10, 11 og embryonale-krop dannelse 12, 13. Imidlertid kunne co-dyrkning metode føre til xenogen kontaminering med murint-afstamningsceller eller proteiner 10, og kun ~ 15% eller mindre af cellerne produceret via den embryoniske-body metode antager en EF fænotype 10, 12, 13. Den hiPSC-EF differentiering protokol præsenteres her eliminerer risikoen for xenogen kontaminering og kan være op til 3 gange mere effektive end de, som bruger embryonale organer (afhængigt af hvilken der anvendes hiPSC linje). Furthermmalm, efter rensning ved hjælp af selektion for CD31-ekspression, ~ 90% af hiPSC-EC'er fastholdt EF fænotype i mindst 4 uger in vitro, sammenlignet med blot to uger, når hiPSC-EC'er fremstilles via traditionelle differentierings- protokoller 12.
Fænotypisk Specifikation af hiPSC-SMC'er
Fænotypen af et SMC (eller en population af SMC'er) er måske bedst beskrives som en balance mellem overvejende kontraktile og syntetiske egenskaber, hvilket kan føre til væsentlige forskelle i morfologi, markør udtryk og aktivitet. Således kan anvendeligheden af hiPSC-SMC'er til en særlig anvendelse afhænger af, hvilken specifik fænotype genereres. De hiPSC-SMC differentiering og rensning protokoller præsenteres her er de første til at producere overvejende kontraktile eller syntetiske SMC befolkningsgrupper, der er ~ 95% ren på kun 2-3 uger, og risikoen for xenogen forurening er minimal, fordi procedurerne ikke require brugen af fødeceller.
Forbedret Anslag af transplantatet Sats for transplanterede celler
En af de primære hindringer for effektiv celleterapi menes at være den ekstremt lave antal indgivne celler, der er transplanteret med myocardiet 14, 15, 16, 17. Cytokiner, såsom IGF-1 kan forbedre indpodning ved at give cellerne bedre at modstå de giftige mikromiljø i iskæmiske væv 18, 19, 20, men de høje tryk fremkaldt under sammentrækning kan presse cellerne ud gennem nålen spor og ind i perifere kredsløb. Således betydeligt højere optagelse af cellerne ved at injicere celler gennem en IGF-1-holdige fibrin plaster, som var mere end 2 gange større end den, der iagttages, når same celle dosis blev administreret uden plasteret, kan sandsynligvis tilskrives både de cytobeskyttende virkninger af IGF-1 og til plasteret selv, som dannede en fysisk barriere, der forhindrede cellerne i at blive udstødt ind i epikardiale rum.
Kritiske trin
For at sikre pluripotens af hofterne celler, er det nødvendigt at kontrollere karyotype af hiPSC slangerne før differentiering, bestemme ekspressionen af pluripotens markører (Nanog, SSEA1, og Oct4, et al.), Og bekræfte deres evne teratom dannelse . Det foreslås at re-check deres pluripotens når hiPSC linjer er blevet passeret i mere end 10 generationer. Status for udifferentierede hiPSC er også afgørende for den korrekte differentiering. For at sikre status for hiPSC før initiering af differentiering, anbefales det at: 1) bruge frisk medium (mindre end to uger gamle), og opdatere mediet dagligt før initiering af hiPSC OBion; 2) at reducere den enzymatiske fordøjelse tid (mindre end 5 min), og forsigtigt pipetteres op og ned cellerne for at undgå unødvendig skade på celler; 3) replate cellerne ved en tæthed 1 x 10 5 celler pr brønd i 6-brønds plade; 4) altid holde cellerne i 37 ° C og 5% CO2-inkubator, og undgå at holde cellerne ud af inkubatoren i mere end 15 min.
Begrænsninger af teknikken
Den primære ulempe ved vores metode til kombination injiceret hiPSC-afledte hjerteceller og patch administration er kravet om åben bryst kirurgi; Således er denne fremgangsmåde ikke forventes at være direkte translaterbar til kliniske anvendelser undtagen som supplerende terapi til patienter, der gennemgår samtidig koronar revaskularisering kirurgi. Mere udbredt klinisk anvendelse vil kræve udvikling af en praktisk og minimalt invasiv levering metode, såsom en endoscope- og kateter tilgang, der kunne få adgang tilhjertet gennem maven og mellemgulv. Endvidere er en af de mest kritiske sikkerhedsproblemer forbundet med hjerte- celleterapi er udviklingen af arytmogene komplikationer, og når aber blev behandlet med intramyocardiale injektioner med 1 milliard hESC-afledte CMS, alle fire af dyrene udviklede spontane arytmier 21. Men observerede vi ingen tegn på arrytmogene komplikationer, når 10 millioner hiPSC-afledte CM blev injiceret ind i hjerterne på svin med IR skade 2, måske fordi cellen dosis var 100 gange mindre.
Fremtidige Programmer eller vejvisning
Immunafstødning sandsynligvis spiller en vigtig rolle for den lave engraftment rate. Den CRISPR / Cas gen redigering system kan gøre det muligt for forskerne at skabe en linje af "universal donor" hiPSCs af knock out (KO) hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I og klasse II. De hiPSC MHC KO-afledte celler og væv kan have væsentligt højere transplantation. Som teknikker forbedre, engraftment satser vil sandsynligvis stige. På vist punkt af stigningen implantatet størrelse, forventes den store graft at øge arrhythmogenicity modtagerens hjerte. Reduktionen af transplantater forbundet arrhythmogenicity kunne opnås ved anvendelse af celler med forøgelse af gap junction-proteiner ekspression af genet redigering teknologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol Section 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10 cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Protocol Section 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-β | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Protocol Section 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-β | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Protocol Section 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Protocol Section 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| ε-aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5 T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7 T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
- Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
- Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
- Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
- Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
- Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
- Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
- Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
- Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
- Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
- Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
- Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
