Determinação do genoma de sincronismo Replication Mammalian por DNA Medição conteúdo

Resumo

Descrevemos aqui uma abordagem relativamente rápida e simples para mapear o tempo de replicação de mamíferos em todo o genoma, desde o isolamento celular até a análise básica dos resultados do sequenciamento. Um mapa genômico de um programa de replicação representativo será fornecido seguindo o protocolo.

Resumo

A replicação do genoma ocorre durante a fase S do ciclo celular em um processo altamente regulado que assegura a fidelidade de duplicação de ADN. Cada região genómico é replicada em um momento diferente durante a fase S através da activação simultânea de múltiplas origens de replicação. Tempo de replicação (ToR) correlaciona-se com muitas características genômicas e epigenéticos e está ligada a taxas de mutação e câncer. Compreender o ponto de vista genômica completa do programa de replicação, na saúde e na doença é uma importante meta para o futuro e desafio.

Este artigo descreve em detalhes o "Número Taxa de cópia de S / G1 para mapear Tempo genômico de replicação" método (aqui chamado: CNR-ToR), uma abordagem simples para mapear o genoma ampla ToR de células de mamíferos. O método baseia-se nas diferenças no número de cópias entre as células em fase S e células em fase G1. O método CNR-TdR é realizado em 6 passos: 1. Preparação de células e a coloração com iodeto de propídio (PI); 2. SorTing G1 e células em fase S utilizando células activadas por fluorescência (FACS); 3. purificação de ADN; 4. sonicação; 5. preparação e sequenciamento da biblioteca; e 6. A análise bioinformática. O método CNR-Tor é uma abordagem fácil e rápido que resulta em mapas de replicação detalhadas.

Introdução

replicação de ADN de mamífero é estritamente regulada para assegurar a replicação precisa de cada cromossoma apenas uma vez durante o ciclo celular. A replicação ocorre de acordo com uma ordem altamente regulado - várias regiões genômicas grandes (~ Mb) replicar no início da fase S (início de replicar domínios), enquanto que outras regiões genômicas replicar mais tarde em (domínios médio e replicar tarde) médio ou fase S tardia ^1. A maior parte do genoma replica ao mesmo tempo em todos os tecidos (domínios ToR constitutivos), enquanto que 30% - 50% do genoma, muda a sua TdR entre tecidos ^2, durante a diferenciação

Protocolo

Nota: ToR pode ser avaliada apenas com o crescimento de células, não sincronizadas. O procedimento deve começar com pelo menos 1 - 2 x 10 ⁶ células de crescimento rápido, que geralmente resultam na ~ 1 x 10 ⁵ células em fase S (o passo limitante da velocidade). Recomenda-se para conduzir cada experiência utilizando-se dois ou três repetições. Todo o processo de CNR-ToR pode ser concluída dentro de uma semana - dois dias deve ser dedicado a todas as etapas até a preparação biblioteca, um a dois dias são necessários para sequenciamento e um dia adicional é necessário para a análise de dados inicial.

1. Recolha de Células....

Resultados

Um mapa típico TdR é mostrado na Figura 3 para fibroblastos de rato embrionários (MEFs). Esta figura demonstra o processo de análise, uma vez que mostra ambos os pontos, que são a razão E / S para G1 normalizada janelas individuais (passo 8.3), bem como a linha que resulta da interpolação e alisamento cúbico (passo 8.5).

Tais mapas capturar a organização do programa de replicação, que é uma colcha de retalhos .......

Discussão

CNR-TdR pode ser realizado, em princípio, em qualquer população de células em proliferação eucariótica que pode ser dividida por FACS para fases G1 e S (revisto por Rhind N. e Gilbert ²⁰ DM). O método aqui descrito foi adaptado para células de mamífero com um tamanho de genoma de ~ 3 Gb, tais como humano e de ratinho. Pequenas mudanças no protocolo CNR-ToR (em preparação celular e profundidade sequenciamento) são necessários, a fim de ajustá-lo para outros eucariotas. Deve ser dada atenção à reco.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
PBS	BI (Indústrias Biológicas)	02-023-1A
Tripsina-EDTA	BI (Indústrias Biológicas)	03-052-1B
Tubo cônico de 15 mL	Corning	430790
5 mL Tubo de fundo redondo de poliestireno com tampa de filtro de células;	BD-Falcon	352235
Etanol	Gadot	64-17-5
RNAse-A 10 mg/mL	Sigma	R4875
Propidiom iodeto 1 mg/mL	Sigma	P4170
Parafilm	Parafilm	PM-996
1.5 mL DNA LoBind Eppendorf tubes	Eppendorf	22431021
BSA	Sigma	A7906
1.7 mL MaxyClear tube	Axygen	MCT-175-C
- Agencourt AMPure XP	Ultrasonicator Covaris M-series da Beckman Coulter	A63881
		-530092
50 µ L microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6 x 16 mm	Covaris	520096
Qubit fluorômetro	Invitrogen
Qubit dsDNA Kit de ensaio de alta sensibilidade (HS)	Invitrogen	Q32854
Eletroforese 2200 Sistema de estação de fita	Agilent	D1000 ScreenTape
Seqeuncing - Sistema Illumina NextSeq	Illumina	SY-415-1001
Kit Dneasy para purificação de DNA	Qiagen	69504
PureProteom Suporte Magnético	Millipore	LSKMAGS08
Anti-BrdU/FITC	DAKO	F7210
Classificador FACS	BD	FACSARIA III
Facs software	BD	FACSDiva v 8.0.1

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