Sistema Induzível de Expressão Multigênica mediada por polimerização T7 de T7, pMGX

Resumo

Este estudo descreve métodos para a co-expressão mediada por T7 de múltiplos genes de um único plasmídeo em Escherichia coli usando o sistema de plasmídeo pMGX.

Resumo

A co-expressão de múltiplas proteínas é cada vez mais essencial para a biologia sintética, estudando complexos proteína-proteína e caracterizando e aproveitando os caminhos biossintéticos. Neste manuscrito, descreve-se o uso de um sistema altamente eficaz para a construção de operões sintéticos multigenes sob o controle de uma polimerase de ARN T7 induzível. Este sistema permite que muitos genes sejam expressos simultaneamente a partir de um plasmídeo. Aqui, um conjunto de quatro vetores relacionados, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K e pMGX-hisK, com o marcador selecionável por resistência à ampicilina ou kanamicina (A e K) e possuindo ou não uma hexahistidina N-terminal A tag (his) é divulgada. São fornecidos protocolos detalhados para a construção de operões sintéticos usando este sistema de vetores juntamente com os dados correspondentes, mostrando que um sistema baseado em pMGX contendo cinco genes pode ser facilmente construído e usado para produzir todas as cinco proteínas codificadas em Escherichia coli . Este sistemaEm e protocolo permite que os pesquisadores rotineiramente expressam módulos complexos de múltiplos componentes e caminhos em E. coli .

Introdução

A co-expressão de múltiplas proteínas é cada vez mais essencial, particularmente em aplicações de biologia sintética, onde vários módulos funcionais devem ser expressos ¹ ; No estudo dos complexos proteína-proteína, onde a expressão e função muitas vezes requerem co-expressão ^{2 , 3} ; E na caracterização e aproveitamento de caminhos biossintéticos, onde cada gene na via deve ser expresso ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8} . Vários sistemas fo....

Protocolo

1. Obtendo Genes de Interesse

1. Desenhe genes sintéticos.
   1. Otimize uma sequência de genes para a expressão de E. coli .
   2. Remova todos os sites de restrição problemáticos da sequência (AvrII, NdeI, EcoRI e XbaI).
   3. Incorporar sites de restrição para clonagem; É recomendado um site 5 '-NdeI e um site 3'-EcoRI. Outros locais podem ser utilizados, se necessário; Referem-se à região de multiclonagem do plasmídeo selecionado ( Figura S1- S4 ). Se desejado, inclua uma etiqueta de codificação 5 'ou 3' para a detecção Western Blot.
   4. Comercialment....

Resultados

Neste estudo, o objetivo era co-expressar cinco proteínas de um único plasmídeo. Os fragmentos de gene sintético otimizados com cinco codões que codificam as marcas de hexahistidina N- ou C-terminal foram adquiridos comercialmente. Os genes sintéticos foram amplificados por PCR e clonados individualmente em um vetor PCR-blunt e sequenciados. Para gerar o plasmídeo policórónico, os cinco genes de interesse foram primeiro clonados num plasmídeo pMGX adequado, pMGX-A. A.......

Discussão

A co-expressão de múltiplos genes é cada vez mais essencial, particularmente na caracterização e reconstituição das vias metabólicas complexas multigênicas ^{3 , 4 , 5} . O sistema pMGX faz co-expressão multigene na rotina ^{6 , 7 , 8 de} E. coli e acessível a diversos pesquisadores. Neste estudo, mostraram-se cinco proteínas de int.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Enzimas
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)	New England Biolabs	M0290S
AvrII	New England Biolabs	R0174S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
NdeI	New England Biolabs	R0111S
XbaI	Novo England Biolabs	R0145S
Herculase II Fusion DNA Polimerase	Agilent Technologies	600677
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
Nome	Empresa<	strong>Número de Catálogo	Comentários
Reagents
1 kb Escada de DNA	New England Biolabs	N3232L
4-20% Mini-PROTEAN TGX Géis de Proteína Sem Manchas	Bio-Rad	456-8095
50x TAE	Fisher Thermo Scientific	BP1332-4
	Ágar Fisher Thermo Scientific	BP1423-500
Agarose	Fisher Thermo Scientific	BP160-500
Ampicilina	Sigma-Alrich	A9518-5G
BL21 (DE3) células quimicamente comeptent			Célula Comeptent preparada em casa
B-PER Reagente de Extração de Proteína Bacteriana	Fisher Thermo Scientific	PI78243
mistura dNTP	Agilent Technologies
	de Extração de Gel de PolimeraseOmega	D2500-02	E.Z.N.A Gel Extraction, fornecido pela VWR Cat 3: CA101318-972
Glycine	Fisher Thermo Scientific	BP381-1
His Tag Anticorpo [HRP], mAb, Mouse	GenScript	A00612
Immobilon Western Substrato de HRP quimioluminescente	EMD Millipore	WBKLS0100
IPTG	Sigma-Alrich	15502-10G
LB	Fisher Thermo Scientific	BP1426-500
Metanol	Fisher Thermo Scientific	A411-20
Leite em pó instantâneo pasteurizado em pó	mercearia		Leite de mercearia sem nome é adequado
Membrana de nitrocelulose	Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)	10600007	Membrana PT 0.45 µ m 200 mm x 4 m, fornecido pela VWR Cat #: CA10061-086
Kit de isolamento de DNA de plasmídeo	Omega	D6943-02	E.Z.N.A MiniKit de DNA de plasmídeo I, fornecido pela VWR Cat #: CA101318-898
pMGX	Boddy Lab		Solicitação do Boddy Lab Contato cboddy@uottawa.ca
Primers Tecnologias de	DNA		Projete os primers conforme necessário para o gene desejado
			Projete e otimize conforme necessário
Papel de Filtro de Mancha Espessa	Bio-Rad	1703932
Base Tris	BioShop	TRS001.1
Tween-20	Sigma-Alrich	P9416-50ML
XL1-Blue células quimicamente competentes			Célula de componente preparada em casa
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipment
BioSpectrometer	Eppendorf	RK-83600-07
Caixa de gel - PAGE	Bio-Rad	1658005	Mini-PROTEIN Tetra Eletroforese Vertical
Cell Gel Imager	Alpha Innotech		AlphaImager EC
Incubadora-forno	Fisher Thermo Scientific	11-690-650D
Incubadora-agitadora	Isotemp Fisher Thermo Scientific	SHKE6000-7	MaxQ 6000
Personna Navalhas	Fisher Thermo Scientific	S04615
Power Pack	Bio-Rad	S65533Q	FB300
Transiluminador	VWR International	Termociclador M-10E,6W
	Eppendorf	Z316091	Mastercycler Personal, fornecido pela Sigma
UV Face-Shield		18-999-4542
Banho de Água	Fisher Thermo Scientific	15-460-2SQ
Aparelho de Transferência Ocidental	Bio-Rad	1703935	Mini-Trans Blot Cell

Fornecido com Kit de local integradas