Restenosis após procedimentos cardiovasculares (cirurgia de bypass, angioplastia ou stent) é um problema significativo que reduz a durabilidade desses procedimentos. Uma terapia ideal inibiria a proliferação de células musculares lisas (VSMC) enquanto promovia a regeneração do endotélio. Descrevemos um modelo para avaliação simultânea da proliferação de VSMC e função endotelial in vivo.
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Artigo de método
Lesão por esmagamento aórtico murino: um eficiente
Neste artigo
Resumo
Resumo
A reconstrução arterial, seja a cirurgia de angioplastia ou de derivação, envolve trauma iatrogênico causando ruptura endotelial e proliferação de células musculares lisas vasculares (VSMC). Modelos murinos comuns estudam pequenos vasos como as artérias carótida e femoral. Aqui, descrevemos um sistema in vivo no qual tanto a proliferação de VSMC quanto a função de barreira endotelial podem ser avaliadas simultaneamente em um vaso grande. Estudamos a resposta aórtica infra-renal a lesão em camundongos C57BL / 6. A aorta foi ferida da veia renal esquerda para a bifurcação aórtica por 30 esmagamentos transmurais de 5 segundos de duração com um aplicador com ponta de algodão. As alterações morfológicas foram avaliadas com histologia convencional. A espessura da parede da aorta foi medida a partir da superfície luminal para adventitia. A integração de EdU e a coloração de contadores com DAPI e alfa-actina foram utilizadas para demonstrar a proliferação de VSMC. A ativação de ERK1 / 2, um conhecido moderador da formação de hiperplasia intimal, foi dissuadidoExtraído pela análise Western Blot. O efeito da inflamação foi determinado por imuno-histoquímica para células B, células T e macrófagos . As seções de face do endotélio foram visualizadas com microscopia eletrônica de varredura (SEM). A função de barreira endotelial foi determinada com coloração Evans Blue. A lesão transmural resultou em espessamento da parede aórtica. Esta lesão induziu a proliferação de VSMC, mais proeminente aos 3 dias após a lesão e a ativação precoce de ERK1 / 2 e diminuiu a expressão de p7 kip1. A lesão não resultou em aumento da infiltração de células B, células T ou macrófagos na parede do vaso. A lesão causou desnudação de células endoteliais parciais e perda de contato célula-célula. A lesão resultou em perda significativa da função de barreira endotelial, que retornou à linha de base após sete dias. O modelo de ferimento aórtico transmural transmural murino fornece um sistema eficiente para estudar simultaneamente a proliferação de VSMC e a função de barreira endotelial em um vaso grande.
Introdução
Restenosis Após procedimentos cardiovasculares (cirurgia de bypass, angioplastia ou stent) é um problema significativo que reduz a durabilidade desses procedimentos. Todos os procedimentos de revascularização estão repletos de reestenose. As estratégias atuais para prevenir a reestenose (stents de libertação de fármaco e balões revestidos de drogas) inibem a célula muscular muscular lisa vascular (VSMC) e a proliferação de células endoteliais (EC). Conseqüentemente, essas intervenções impedem a reestenose mediada por VSMC, mas também impedem a regeneração do endotélio. Sem um endotélio intacto, os pacientes devem estar em potentes agentes antiplaquetários para diminuir o risco de trombose in situ no risco de complicações hemorrágicas. Uma terapia ideal inibiria a proliferação de VSMC enquanto promovia a regeneração do endotélio. Assim, há uma necessidade de estudar simultaneamente a proliferação de VSMC e a função de barreira endotelial i n vivo .
Atualmente, existemModelos de reestenose de mouse de al mouse 1 . Estes modelos incluem ligadura de carótida e lesão de fio arterial femoral 2 . Os modelos aórticos incluem posicionamento do stent 3 , lesão do balão 4 e aloenxerto aórtico 5 . Todos os modelos atuais são limitados. A ligação da carótida gera uma lesão neointimal mediada pelo fluxo e não possui lesão endotelial. Além disso, as artérias carotídeas e femorais têm muitas vezes menos camadas celulares que os vasos humanos, limitando seu valor de translação. A aorta do mouse, com aproximadamente 1,3 mm de diâmetro, é o único vaso que se aproxima de uma artéria humana (coronária) clinicamente relevante (3).
Apesar do potencial de tradução dos modelos aórticos murinos da doença, os modelos atuais têm limitações. Esses modelos exigem habilidades micro-cirúrgicas avançadas e equipamentos especializados, como balões de angioplastia e stents. Aqui, apresentamosUma técnica nova e reprodutível para induzir simultaneamente a proliferação de VSMC e interromper a função de barreira endotelial.
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Protocolo
Declaração de Ética: os protocolos para manejo de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal (IACUC) da Universidade de Maryland (número de protocolo 0416009) e conduzido de acordo com os padrões AAALAC-International.
1. Procedimento cirúrgico
- Técnica anestésica
- Esterilize todos os instrumentos utilizados na cirurgia de sobrevivência com esterilização a vapor a 121 ° C durante 30 min.
- Induzamos a anestesia através de um tanque de indução com 100% de O2 e 2.5% de isoflurano administrado por vaporizador de precisão. Após a indução, interrompa o isoflurano e lave a câmara com O 2 . Manter anestesia com 1,5-2% de isoflurano através da máscara facial e 1 L / min O 2 por inalação.
- Anexe a câmara de indução e a máscara facial a um agente de tratamento de carvão para adsorção de gás residual para proteger o pessoal. Assegurar um plano anestésico adequado por demonstraçãoQue não há resposta a estímulos nocivos (pitada de dedo do pé).
- Crie um campo operacional consistindo em uma bandeja cirúrgica com almofada isotérmica para fornecer suporte térmico durante a cirurgia. Uma almofada isotérmica adicional proporcionará suporte térmico aos animais em sua gaiola de recuperação.
- Preparação Animal
- Realize a seguinte investigação sobre ratinhos C57BL / 6 machos de 10 a 12 semanas de idade.
- Remova o cabelo na superfície abdominal ventral do animal do esterno para a região inguinal com um agente depilatório ou uma cortadora elétrica com uma lâmina número 40.
- Em caso de agente depilatório, aplique este composto na área cirúrgica por 2-3 min e depois remova-o com algodão. Utilizamos um composto comercialmente disponível de hidróxido de cálcio e hidróxido de sódio.
- Prepare a área sobre o ombro com 70% de álcool e injete subcutaneamente carprofen (5 mg / kg) com uma agulha de calibre 25 ou menor. esteO tratamento proporcionará analgesia pós-operatória para o animal.
- Transfira o animal para o campo cirúrgico e posicione-se em recumbência dorsal.
- Prepare o local cirúrgico esfregando 8-12% providone-iodo com um aplicador de algodão limpo ou uma gaze de algodão. Em seguida, enxágue a pele duas vezes com 70% de álcool.
- Coloque o lubrificante ocular em ambos os olhos para reduzir a incidência de dessecação da córnea. Cubra o local cirúrgico com uma cobertura estéril.
- Técnica Operativa
- Faça uma mediana da incisão da laparotomia abdominal com aproximadamente 2-2,5 cm de comprimento com um bisturi começando imediatamente caudal no processo de xifóide e estendendo-se para a pélvis.
- Mobilize o intestino delgado e o duodeno e reflita lateralmente à direita. Enrole uma tira de algodão estéril gasteado e embebido com solução salina estéril para injeção para permitir a embalagem das vísceras para melhorar a exposição.
- Com o intestino delgado mobilizado para o lado direito doAbdômen, exponha o retroperitoneum e expõe a aorta abdominal da veia renal esquerda à bifurcação aórtica ( Figura 1 ).
- Com um aplicador de ponta de algodão estéril, entregue 30 tritões consecutivos, cada cinco segundos de duração.
- Remova a embalagem e permita que as vísceras voltem à sua posição nativa.
- Faixa da fáscia com uma sutura de monofilamento absorvente 4-0 (polydioxanona). A pele é fechada com uma sutura de monofilamento não absorvível de 6-0 (nylon).
- Assistência de recuperação e pós-procedimento
- Após o procedimento, coloque o animal em uma gaiola de recuperação com roupa de cama limpa em uma almofada isotérmica para continuar o suporte térmico até que o animal possa se mexer normalmente. Não deixe o animal desacompanhado até demonstrar a capacidade de manter a decúbito esternal.
- Monitore o animal a cada hora pelas primeiras 4 h após a cirurgia. Uma vez que o animal está ambulante normalmente retorna i T para a sala de criação atribuída. O animal não será alojado na companhia de outro animal até que ele tenha se recuperado completamente.
- Monitore o animal duas vezes ao dia durante as primeiras 72 h após a cirurgia e pelo menos 3 vezes por semana a partir de então. O monitoramento inclui a pesagem do animal três vezes por semana.
- Administrar carpofen (5 mg / kg) por via subcutânea duas vezes ao dia durante as primeiras 72 h após a cirurgia.
2. Procurement of Tissue
- Método de Eutanásia
- Eutanize os animais em pontos de tempo predeterminados.
- Induzamos a anestesia através de um tanque de indução com 100% de O2 e 2.5% de isoflurano administrado por vaporizador de precisão.
- Para estudar a integridade do endotélio, administre o corante azul Evans para o animal.
NOTA: Evans Blue é um corante azo com carga negativa com alta afinidade de ligação para a albumina e só pode manchar os vasos sanguíneos na ausência de um endotélio intactoS = "xref"> 6. - Para estudos de integridade endotelial, no momento da eutanásia, perfusar os animais com 5 mL de 0,3% de corante Evans Blue seguido por 5 mL de PBS a pressão fisiológica durante 5 min. O animal é mantido em um plano cirúrgico de anestesia durante o procedimento de perfusão.
- Para estudar a integridade do endotélio, administre o corante azul Evans para o animal.
- Depois de atingir um plano anestésico profundo, abra o baú com esternotomia. Faça uma laceração no átrio direito para permitir a drenagem do sangue do animal e o acesso ao ventrículo esquerdo seja acessado com uma agulha 21 G e injete solução salina tamponada com fosfato (PBS) até que o efluente do átrio direito seja limpo.
- Após a perfusão com PBS, entre no abdômen através de uma incisão na linha média.
- Mais uma vez, mobilize o intestino delgado para o lado direito do abdômen, expondo a aorta da infra-renal, dissecando a aorta dos tecidos adjacentes e extrale-a da veia renal esquerda para a bifurcação aórtica.
- Armazene a aorta excisada em um paraformald a 4%Solução de eído até o processamento do tecido.
- Para estudos de integridade endotelial, abra a aorta longitudinalmente e fixe-a para uma folha de cera expondo a totalidade da superfície luminal 6 . Realizar uma avaliação qualitativa da integridade endotelial pelo grau de coloração com corante Evans Blue 6 .
- Para outros ensaios histológicos, separe a aorta transversalmente e incorpore-a em compostos óptimos de temperatura de corte (OCT) conforme ditado pelo método histológico a ser utilizado 7 .
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Resultados
As secções transversais da aorta embutidas em OCT foram seccionadas e coradas com hematoxilina e eosina, em seguida, foram coradas com mancha Verhoeff-Van Gieson (VVG) para identificar a lâmina elástica interna e externa 7 . Os danos causados por esmagamento induziram o espessamento da parede aórtica em comparação com os aortas de animais tratados com procedimento simulado (laparotomia e mobilização do intestino delgado sozinho). A espessura da parede, avaliada ...
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Discussão
Caracterizamos os efeitos de um modelo de lesão aórtica murina que resulta em hiperplasia mediana e disfunção da barreira endotelial. O destacamento parcial da CE ao longo da íntima da aorta acompanhou a perda do contato celular e o aumento das protrusões celulares. Correspondentemente, a função de barreira endotelial foi significativamente prejudicada, o que estimulou as vias de sinalização sensíveis aos mitógenos, levando à proliferação de VSMCs e engrossamento da parede vascular. Os pontos fortes deste modelo é que é...
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Divulgações
Este trabalho foi financiado pelo Prêmio de Desenvolvimento de Carreira do Departamento de Assistentes de Veteranos (1IK2BX001553-01) (TSM) e a bolsa de estudos EJ Wylie da Cura Vascular (TSM).
Agradecimentos
Agradecemos a Hsia Ru-ching PhD, do Centro de Microscopia Eletrônica da Faculdade de Medicina da Universidade de Maryland, pelo seu suporte técnico no processamento das amostras de microscopia eletrônica de varredura.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Lubrificante ocular | Dechra | 17033-211-38 | Agentes farmacêuticos |
| Isoflurano | VetOne | 502017 | Agentes farmacêuticos |
| Carprofeno | Zoetis | 26357 | Agentes farmacêuticos |
| Vaporizador de precisão | Summit Medical | 10675 | Material cirúrgico |
| Limpador de carvão | Bickford Inc. | 80120 | Suprimentos cirúrgicos |
| Almofada isotérmica | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Suprimentos cirúrgicos |
| Aplicador estéril com ponta de algodão | Fisher Scientific | 23-400-124 | Suprimentos cirúrgicos |
| 4-0 sutura de monofilamento absorvível | Ethicon, Inc | J310 | Suprimentos cirúrgicos |
| 5-0 sutura monofilamentar não absorvível | Ethicon,Inc | 1666 | Suprimentos cirúrgicos |
| 21-gauge x 1 polegada agulha | BD Biosciences | 305165 | Suprimentos cirúrgicos |
| 25-gauge x 1 polegada agulha | BD Biosciences | 305125 | Suprimentos cirúrgicos |
| Esterilizador seco | Cellpoint | 7770 | Material cirúrgico |
| Tesoura fina | Ferramentas de ciências finas | 14058-09 | Instrumentos cirúrgicos |
| Pinça Adson | Ferramentas de ciências finas | 11006-12 | Instrumentos cirúrgicos |
| Dumont # 5 pinça fina | Ferramentas de ciências finas | 11254-20 | Instrumentos |
| cirúrgicos Tesoura de mola Vannas 3 mm de ponta | Ferramentas de ciências finas | 15000-00 | Instrumentos cirúrgicos |
| Agulha Driver | Fine Science | 91201-13 | Instrumentos cirúrgicos |
| Cabo de bisturi #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Instrumentos |
| cirúrgicos Lâminas de bisturi #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Instrumentos cirúrgicos |
| PBS | Reagentes Lonza | 17-516F | para processamento de tecidos |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagentes para processamento |
| de tecidos Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagentes para processamento de tecidos |
| Cera de modelagem | Bego | 40001 | Reagentes para processamento de tecidos |
| Composto OCT | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagentes para processamento de tecidos |
| Solução de hematoxilina de Mayer | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagentes para análise imunohistológica |
| Solução de Eosina Y alcoólica; | Reagentes Sigma-Aldrich | HT110316 | para análise imuno-histológica |
| Kit de coloração de elastina | Reagentes Sigma-Aldrich | HT25A | para análise imuno-histológica |
| Click-it Edu Alexa-488 Kit de imagem | Invitrogen | C10337 | Reagentes para análise imuno-histológica |
| Anti-Erk1/2 Anticorpo | Tecnologia de Sinalização Celular | 4695 | Reagentes para imuno-histológico análise |
| Anticorpo anti-fosfo-Erk1/2 | Tecnologia de sinalização celular | 4370 | Reagentes para análise imuno-histológica |
| Anticorpo anti-p27kip1 | Tecnologia de sinalização celular | 3698 | Reagentes para análise imuno-histológica |
| Ácido tricloroacético | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagentes para análise imuno-histológica |
Referências
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- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
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- Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
- Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062(2013).
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Reimpressões e permissões
