Summary
심혈관 수술 (바이 패스 수술, 혈관 성형술 또는 스텐트 삽입) 후의 재 협착은 이러한 과정의 내구성을 감소시키는 중요한 문제입니다. 이상적인 치료법은 내피 세포의 재생을 촉진시키면서 평활근 세포 (VSMC)의 증식을 억제합니다. 우리는 생체 내에서 VSMC의 증식과 내피 기능의 동시 평가를위한 모델을 설명합니다.
Abstract
혈관 성형술이든 우회 수술이든 동맥 재건술은 내피 세포 손상 및 혈관 평활근 세포 증식을 유발하는 의원 성 외상을 포함합니다. 일반적인 쥐 모델은 경동맥과 대퇴 동맥과 같은 작은 혈관을 연구합니다. 여기서 우리는 VSMC 증식과 내피 장벽 기능이 대형 혈관에서 동시에 평가 될 수 있는 생체 내 시스템을 설명한다. 우리는 C57BL / 6 마우스의 손상에 대한 신장 하 대동맥 반응을 연구했습니다. 대동맥은 좌측 신장 정맥에서 대퇴 동맥 분 지로 손상되었는데, 코튼 팁 도포기로 5 초간 30 회 변형시켰다. 형태 학적 변화는 전통적인 조직학으로 평가되었다. 대동맥 벽 두께는 내강 표면에서 외막까지 측정되었다. VSMC 증식을 입증하기 위해 EdU 통합 및 DAPI 및 알파 - 액틴에 의한 카운터 염색을 사용 하였다. ERK1 / 2 (내막 과형성 형성의 알려진 조절 인자)의 활성화가 억제되었다Western blot 분석으로 채취 하였다. 염증의 효과는 B 세포, T 세포 및 대 식세포에 대한 면역 조직 화학 법에 의해 결정되었다 . 내피 세포의 각면을 주사 전자 현미경 (SEM)으로 시각화 하였다. Evans Blue 염색으로 내피 장벽 기능을 측정 하였다. Transmural 손상으로 대동맥 벽이 두꺼워졌다. 이 손상은 손상 후 3 일째에 가장 현저하게 VSMC 증식을 유도하고 ERK1 / 2의 조기 활성화 및 p27 kip1 발현을 감소 시켰다. 부상으로 혈관벽에 B 세포, T 세포 또는 대 식세포 침윤이 증가하지 않았습니다. 상해로 인해 부분 내피 세포 누출과 세포 - 세포 접촉의 손실이 발생했습니다. 손상으로 인해 7 일 후에 기준선으로 돌아온 내피 장벽 기능이 크게 상실되었습니다. 횡격막 횡격막 둔 상동맥 손상 모델은 대형 선박에서 VSMC 증식과 내피 장벽 기능을 동시에 연구 할 수있는 효율적인 시스템을 제공합니다.
Introduction
재 협착 심혈관 수술 (바이 패스 수술, 혈관 성형술 또는 스텐트 삽입)은 이러한 과정의 내구성을 감소시키는 중요한 문제입니다. 모든 재 혈관 화 절차는 재협착에 시달립니다. 재 협착 (약물 방출 스텐트 및 약물 코팅 된 풍선)을 방지하는 현재의 전략은 혈관 평활근 세포 (VSMC) 및 내피 세포 증식 (EC)을 억제한다. 결과적으로, 이러한 중재는 VSMC가 중재하는 재 협착을 예방할뿐만 아니라 내피 세포의 재생을 막습니다. 손상되지 않은 내피없이 환자는 출혈 합병증의 위험이있는 현장 혈전증의 위험을 줄이기 위해 강력한 항 혈소판제를 사용해야합니다. 이상적인 치료법은 VSMC의 증식을 억제하면서 내피 세포의 재생을 촉진합니다. 따라서, 생체 내에서 VSMC 증식과 내피 장벽 기능을 동시에 연구 할 필요가있다.
현재,재 협착의 알 마우스 모델 1 . 이 모델에는 경동맥 결찰 및 대퇴 동맥 와이어 손상 2가 포함 됩니다. 대동맥 모델은 스텐트 배치 3 , 풍선 손상 4 및 대동맥 동종 이식 5를 포함 합니다. 현재 모델은 모두 제한되어 있습니다. 경동맥 연결은 혈류가 매개되는 신생 내막 병변을 유발하고 내피 손상을 일으키지 않습니다. 또한 경동맥과 대퇴 동맥은 인간 혈관보다 세포 배양이 훨씬 적어서 병독성이 제한됩니다. 직경 약 1.3 mm 인 마우스 대동맥은 임상 관련 (관상 동맥) 인간 동맥 (3)과 근사하는 유일한 혈관입니다.
질병의 쥐 대동맥 모델의 번역 가능성에도 불구하고, 현재 모델에는 한계가 있습니다. 이러한 모델은 첨단 미세 수술 기술과 혈관 성형 풍선 및 스텐트와 같은 전문 장비가 필요합니다. 여기서, 우리는VSMC의 증식을 동시에 유도하고 내피 장벽 기능을 파괴하는 새로운 재현 가능 기술.
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Protocol
윤리 성명서 : 동물 취급을위한 프로토콜은 메릴랜드 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) (프로토콜 번호 0416009)의 승인을 받았고 AAALAC-International 표준에 따라 시행되었습니다.
1. 수술 절차
- 마취 기법
- 생존 수술에 사용 된 모든기구를 121 ° C에서 30 분 동안 증기 멸균하여 소독하십시오.
- 정밀 증발기 를 통해 전달 되는 100 % O 2 및 2.5 % 이소 플루 란 을 포함 하는 유도 탱크를 통해 마취를 유도합니다. 사후 유도, isoflurane을 중단하고 O 2로 챔버를 플러시하십시오. 안면 마스크 를 통한 1.5-2 % isoflurane과 흡입에 의한 1 L / min O2로 마취를 유지하십시오.
- 인원을 보호하기 위해 배기 가스 흡착을위한 숯 제거제에 유도 챔버와 안면 마스크를 부착하십시오. 시위로 적절한 마취기를 확보하십시오.유해한 자극 (발가락 핀치)에 대한 반응이 없다는 것.
- 등온 패드가있는 수술 트레이로 구성된 수술장을 만들어 수술 중에 열을 받치도록하십시오. 추가적인 등온 패드는 회복 케이지에서 동물에게 열적지지를 제공합니다.
- 동물 준비
- 10-12 주령의 수컷 C57BL / 6 마우스에 대해 다음 조사를 수행하십시오.
- 탈모 제 또는 40 번 칼날이 달린 전기 클리퍼로 흉골에서 사타구니 부위까지 동물 복부 복부 표면의 머리카락을 제거합니다.
- 탈모제의 경우 2-3 분 동안이 화합물을 수술 부위에 바른 후면으로 제거하십시오. 우리는 상업적으로 이용 가능한 수산화칼슘과 수산화 나트륨 화합물을 사용합니다.
- 70 % 알콜로 어깨 부분을 준비하고 25 게이지 또는 더 작은 보어 바늘로 carprofen (5 mg / kg)을 피하 주사하십시오. 이치료는 동물을위한 수술 후 진통제를 제공 할 것입니다.
- 외과 분야에 동물을 전송하고 지느러미 응급실에서 위치.
- 깨끗한 코튼 어플리케이터 또는면 거즈로 8-12 %의 섭취 된 요오드를 문질러 수술 부위를 준비하십시오. 그런 다음 70 % 알코올로 피부를 두 번 헹굽니다.
- 각막 건조의 발병률을 줄이기 위해 안구 윤활제를 양안에 넣으십시오. 멸균 드레이프로 수술 부위를 덮으십시오.
- 수술 기법
- 중간 복부 개복술 절개를 대략 2-2.5 cm 길이로 만들고, 칼피스를 즉시 꼬리뼈 골반쪽으로 가져오고 골반쪽으로 확장합니다.
- 소장과 십이지장을 동원하여 오른쪽 옆으로 반사시킵니다. 노출을 향상시키기 위해 내장을 포장 할 수 있도록 주사 용 멸균 식염수로 닦고 닦아 낸 멸균 된면을 겹쳐서 감습니다.
- 소장이 오른쪽에 동원되어복강 내막을 노출시키고 복부 대동맥을 좌측 신장 정맥에서 대동맥 분기로 노출시킨다 ( 그림 1 ).
- 멸균 된 면봉으로 된 애플리케이터로 각 5 초 동안 30 회 연속 분쇄합니다.
- 패킹을 제거하고 내장이 원래 위치로 돌아가도록하십시오.
- 실행중인 4-0 흡수 monofilament 봉합사 (polydioxanone)로 근막을 닫으십시오. 피부는 6-0 비 흡착성 모노 필라멘트 봉합사 (나일론)로 막습니다.
- 복구 및 사후 절차 관리
- 절차가 끝나면 등온 패드에 깨끗한 침구가있는 복구 케이지에 동물을 넣어 동물이 정상적으로 보행 할 수있을 때까지 열 지원을 계속하십시오. 흉골의 머리맡을 유지할 수있을 때까지 동물을 방치하지 마십시오.
- 수술 후 처음 4 시간 동안 매 시간마다 동물을 관찰하십시오. 동물이 정상적으로 돌아 오는 동안 나는 할당 된 축산 실로 그것이 완전히 회복 될 때까지 동물은 다른 동물의 회사에 수용되지 않을 것입니다.
- 수술 후 첫 72 시간 동안은 동물을 하루 두 번, 그 후 일주일에 적어도 3 번은 동물을 관찰하십시오. 모니터링은 일주일에 세 번 동물의 무게를 측정하는 것을 포함합니다.
- 수술 후 첫 72 시간 동안 carpofen (5 mg / kg)을 매일 두 번 피하 투여하십시오.
2. 조직 조달
- 안락사의 방법
- 미리 정해진 시간에 동물을 안락사하십시오.
- 정밀 증발기를 통해 전달되는 100 % O 2 및 2.5 % 이소 플루 란을 포함하는 유도 탱크를 통해 마취를 유도합니다.
- 내피의 완전성을 연구하기 위해 Evans Blue 염료를 동물에게 투여하십시오.
참고 : Evans Blue는 알부민에 대한 결합 친화력이 높은 음전하를 띤 아조 염료이며 손상되지 않은 내피가없는 경우에만 혈관을 염색 할 수 있습니다s = "xref"> 6. - 내피 완전성 연구를 위해, 안락사시, 0.3 % 에반스 블루 (Evans Blue) 염색약 5 mL와 생리 학적 압력 5 mL PBS로 5 분간 동물을 관류시킨다. 동물은 재관류 과정 중에 마취 외과 수술 평면에 유지됩니다.
- 내피의 완전성을 연구하기 위해 Evans Blue 염료를 동물에게 투여하십시오.
- 깊은 마취기를 마친 후 흉골 절개로 가슴을 엽니 다. 오른쪽 아트리움에서 열혈을하여 동물의 혈액을 배수시키고 21G 주사 바늘로 왼쪽 심실에 액세스하고 오른쪽 심방의 유출액이 깨끗해질 때까지 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)를 주입하십시오.
- PBS로 재관류 한 후 정중선 절개를 통해 복부로 들어갑니다.
- 다시 한번, 소장을 신장 우측 대동맥을 드러내는 복부의 오른쪽으로 동원시키고, 인접한 조직으로부터 대동맥을 급히 절개하여 왼쪽 신장 혈관에서 대동맥 분기로 절제합니다.
- excised 대동맥을 4 % paraformald에 보관하십시오.조직 처리가 발생할 때까지 ehyde 용액.
- 내피 완전성 연구를 위해, 대동맥을 세로로 열고 내강 표면 전체를 노출시키는 왁스 시트에 핀을 고정시킵니다. Evans Blue dye 6로 염색 정도에 따라 혈관 내피의 정성 평가를 수행하십시오.
- 다른 조직학 검사의 경우, 대동맥을 횡 방향으로 절개하고 조직 학적 방법에 따라 최적 절개 온도 (OCT) 화합물에 삽입하십시오 7 .
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Representative Results
OCT에 내장 된 횡단 절제 된 대동맥을 절단하고 hematoxylin과 eosin으로 염색 한 후 Verhoeff-Van Gieson (VVG) 염색으로 반으로 염색하여 내부 및 외부 신축성 층을 확인 하였다. 가식 과정 (개복술과 작은 창자 동원)으로 치료 한 동물의 대동맥에 비해 크러쉬 부상으로 대동맥 벽 비후가 유발되었습니다. 외막에서 내강까지의 거리로 평가 한 벽 두께는 손상 3 일 후 가장 컸다 (42.2 ± 1.7 μm vs. 개복술 단독 22.1 ± 1.1 μm) ( 그림 2A-B ). 손상으로 인해 세포는 더 둥글게 보이고 관목 표면의 불규칙한 윤곽을 보입니다 ( 그림 2C ).
손상된 대동맥의 벽 두께 증가가 적어도 부분적으로 내측 혈관 평활근의 증식 증가에 의해 매개된다cle 세포. 벽의 비후가 세포 비대와는 달리 증가 된 증식으로 인한 것임을 증명하기 위해 EdU 증식 분석을 사용했습니다. 이 분석에서, 티미 딘 유사체 5-에 티닐 -2'- 데 옥시 우리 딘 (EdU)은 안락사 전에 24 시간 동안 마우스에게 정맥 내 투여된다. EdU는 합성 중에 DNA에 통합됩니다. EdU는 클릭 반응 (녹색 - 형광 염료를 이용한 구리 - 촉매 반응 된 아 지드 - 알킨 시클로 부가)에 의해 검출된다 .8 . 개복술에만 노출 된 가성 마우스는 대동맥의 어떤 층에서도 형광이 관찰되지 않았다. Conversley, 대동맥 손상을받은 마우스는 대동맥의 막 및 내막 모두에서 형광을 보였다 ( 그림 3 ).
압박 손상 후 대동맥 벽 비후는 사람의 재 협착과 관련이있는 세포 신호 전달 경로를 활성화시킵니다. mitogen-activated protein kinase (MAP kinase) ERK1 / 2는 내막 과형성 형성의 주요 중재자 중 하나이다mitogen으로부터의 자극에 반응하여, ERK1 / 2는 인산화되고 활성화된다. 우리 연구실의 데이터에 따르면 사이클린 의존성 키나아제 억제제 p27 kip1 은 혈관벽에서 분열 촉진 자극에 반응하여 감소한다는 사실 도 입증되었습니다. 대동맥 파열 손상 후 1, 3, 7 일 및 1 개월 째에 마우스를 안락사시켰다. 신장 하 대동맥을 분리하고 서양 얼룩 분석으로 ERK1 / 2, phospho-ERK1 / 2 (ERK1 / 2 활성화 형태) 및 cyclin 의존성 키나아제 억제제 p27 kip1의 단백질 발현 을 측정 하였다 ( 그림 4A ). ERK1 / 2 단백질 발현은 시간이 지남에 따라 변화가 관찰되지 않았다. 그러나 손상 3 일 후에 phospho-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) 발현은 기준 Pi-ERK1 / 2 발현보다 200 % 이상 높았다. p27 kip1 발현은 조기의 시점에서 감소하였고, 7 일 후 약 20 %의 최저치에 도달 하였다테 부상. Pi-ERK1 / 2와 p27 kip1 발현은 손상 후 1 개월 째 기준선 수준과 비슷 했다 ( 그림 4B ). 따라서 관찰 된 대동맥 벽의 비후는 적어도 부분적으로 증가 된 내측 증식으로 인한 것이다.
대동맥 손상 모델은 내측 평활근 증식과 내피 장벽 기능을 동시에 평가할 수 있습니다. 내피의 형태에 대한 압착 손상의 영향을 특성화하기 위해 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용 하였다. 대동맥의 내강 표면은 혈액이 태어난 세포와 분자의 부착을 방지하는 합류, 내피에 의해 정렬되어 있습니다 ( 그림 5A , Scale bar = 100 μm). 대조적으로, 호감 부상으로 내피 세포가 파괴되고 내피 세포가 부분적으로 벗겨집니다 ( 그림 5B , Scale bar = 100 μm). 높은 배율에서 볼 수 있듯이, 내피의 파괴로 인해 부착이 일어난다혈소판과 크기와 모양이 일치하는 입자가 붙어 있습니다. 이 입자들의 접착은 손상 부위 전체에 걸쳐 발생하며 낮은 배율에서 관찰 된 심부 눈꺼풀 제거 영역에만 국한되지 않습니다 ( 그림 5C , 눈금 막대 = 50μm). 점착성 입자의 형태는 고배율에서 가장 잘 관찰됩니다. 이 입자들은 혈소판과 섬유소와 일치합니다 ( 그림 5D , Scale bar = 10 μm).
내피 형태학 외에도, 혈관 손상 모델로 내피의 장벽 기능을 평가할 수 있습니다. 아조 염료 Evans Blue는 쥐 대동맥의 정상적인 손상되지 않은 내피를 침투 할 수 없습니다. 내피의 장벽 기능 손상으로 Evans Blue로 염막을 염색 할 수 있습니다. 개복술 단독 치료 (가짜) 된 마우스는 내피 세포의 장벽 기능을 유지했으며이 대동맥은 흰색이었습니다. 크러쉬 부상으로 인해내피 장벽 기능의 산만 한 소실과이 대동맥은 진한 파란색으로 물들어있다. Evans Blue로 인한 염색의 강도는 압착 손상 후 3 일째에 감소하였고, 손상 후 1 주일에는 전체 장벽 기능이 회복되었다 ( 그림 6A ). 내피 장벽 기능은 시료를 칭량하고 10 배 부피의 50 % 트리클로로 아세트산 용액으로 균질화하여 추가로 정량 할 수 있습니다. 상등액을 4 배 에탄올로 희석하면 Aoki 등이 기술 한 바와 같이 형광 강도 (여기 620 nm 및 방출 680 nm)를 측정 할 수 있다 . 11 . 대동맥 대동맥에서 유출 된 Evans Blue의 양은 개복술만을받은 대동맥에 비해 상해 직후의 대동맥에서 3 배 이상 높았다 (Injured - Day 0). 대동맥은 손상 후 1 일 및 3 일에 Evans Blue로 계속 염색되었지만 손상 시보 다 덜 강해서 내피 장벽 기능의 점진적인 회복을 시사한다. 1 주 후미손상된 대동맥은 개복술만으로 치료 한 대동맥과 동등한 염색을 보였다 ( 그림 6B ).
그림 1 : 대동맥을 왼쪽 신 날 정맥에서 대동맥 분기로 뭉툭하게 분쇄하여 상해를 입었습니다. 유 외 ( Yu et al .), PLoS One 2015의 허락을 받아 변경된 그림 12 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 크러시 상해는 대동맥 벽 두껍게를 유발합니다. ( A ) 크러시 손상으로 인한 대동맥의 형태 학적 변화. 대표적인 5 μm 단면을 VVG로 0,손상 후 1, 3, 7 일. 스케일 바 = 100 μm. ( B ) 벽 두께는 부상 3 일 후 42.2 ± 1.7 μm로 가장 컸으며, 개복술을받은 가짜 동물의 대동맥보다 22.1 ± 1.1 μm 더 컸다. 통계적 유의성은 학생의 양측 t- 검정으로 결정되었다. * Cr <p> 0.05, n = 3을 나타냄. ( C ) 크러시 손상으로 내측 VSMC가 둥글게 보이고 (α 평활근 액틴의 경우 녹색으로 염색 됨) 세포의 방향이 바뀌었다. 핵은 DAPI (청색)로 대조 염색되었다. 스케일 바 = 10 μm. 데이터는 평균 및 표준 편차로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 3 : 부술 상해는 세포 Prolife를 유도합니다대동맥 벽에 배급. 마우스는 개복 개복술 (sham) 또는 대동맥 파열 손상을 동반 한 개복술에 노출되었다. Thymidine analogue 5- ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)은 안락사 전 24 시간에 투여되었다. EdU는 합성 중에 DNA에 통합됩니다. EdU는 클릭 반응 (녹색 - 형광 염료를 사용하는 구리 - 촉매 된 아 지드 - 알킨 시클로 부가)에 의해 검출된다. 가짜 동물의 대동맥 벽에는 검출 가능한 EdU (녹색)가 없었다. 압착 손상을 입은 동물에서, EdU는 대동맥 매체에서 현저하게 염색되었고, 내막에서 다소 더 낮은 정도로 염색되었다. 혈관 평활근 세포는 α- 평활근 액틴 항체 (적색)로 염색 됨으로써 동정되었다. 이 발견은 그림 2에서 관찰 된 관찰 된 벽의 두꺼움이 세포 증식의 증가에 기인 함을 시사한다. 스케일 바 = 10 μm. 이 figur의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오이자형.
그림 4 : Mitogen-activated Protein Kinase (MAP Kinase) 경로는 크러쉬 상해에 반응하여 활성화됩니다. ( A ) MAP Kinase ERK1 / 2는 활성화되면 인산화되어 내막 과형성 및 재 협착과 관련이있다. 대동맥 파열 손상 후 1, 3, 7 일 및 1 개월 째에 마우스를 안락사시켰다. Western blot 분석을 통해 총 ERK1 / 2, phospho-ERK1 / 2 및 cyclin dependent kinase inhibitor p27 kip1의 단백질 발현을 평가 하였다. 단백질 발현은 개복술로 치료 한 가짜 동물에게 정상화되었다. ( B ) 시간이 지남에 따라 총 ERK1 / 2 단백질 발현에서 변화가 관찰되지 않았다. 그러나 손상 3 일 후에 phospho-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) 발현은 기준 Pi-ERK1 / 2 발현보다 200 % 이상 높았다. 조기에 p27 kip1 발현이 감소d는 상처의 7 일 후 기준선의 약 20 %의 최하층에 도달했다. Pi-ERK1 / 2 및 p27 kip1 발현은 손상 후 1 개월 째 기준선 수준에 가까웠다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 크러시 상해가 대동맥 내피 세포를 파괴합니다. ( A ) 스캔 전자 현미경 (SEM)은 내피의 형태학에 대한 분쇄 손상의 영향을 특성화하는데 사용되었다. 정상 대동맥의 내강 표면은 혈액이 태어난 세포와 분자의 부착을 방지하는 융합 성 내피 세포에 의해 줄 지어 있습니다. ( B ) 호감 상처는 내피 세포의 파괴 및 내피의 부분적 박리를 야기한다. ( C ) 높은 magnifica에서 볼 수 있듯이혈소판과 크기 및 형태가 일관된 입자의 부착을 초래하는 내피의 파괴. 이 입자들의 접착은 손상 부위 전체에 걸쳐 발생하며 낮은 배율에서 관찰되는 심한 눈물 흘림의 영역에 국한되지 않습니다. ( D ) 배율이 높을수록 이들 입자는 혈소판 및 피브린과 일치합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 6 : 무딘 대동맥 상해는 내피 장벽 기능의 부량을 허용합니다. ( A ) 내피의 장벽 기능 손상으로 Evans Blue 염색으로 기저막을 염색 할 수 있습니다. 개복 수술 (sham) 단독 치료를받은 마우스는 내피 세포의 장벽 기능을 유지하였고 th대동맥은 백인이었다. 호감 상처는 내피 장벽 기능의 산만 한 손실을 가져 왔고이 대동맥은 짙은 청색으로 얼룩지게됩니다. Evans Blue로 인한 염색의 강도는 압착 손상 후 3 일째에 감소하였고, 손상 후 일주일에 완전한 장벽 기능이 회복되었다. ( B ) Evans Blue를 신장 하 대동맥에 결합시키는 것은 에반스 블루를 표본으로부터 용리시키고 형광 강도로 정량화함으로써 정량화 하였다. 데이터는 평균 및 표준 편차로 표시됩니다. 대부분의 에반스 블루는 호감 부상 직후에 대동맥으로부터 용출되었습니다. 부상 당시 대동맥은 개복술 만받은 대동맥보다 3 배 이상 에반스 블루에 묶여있었습니다. 대동맥이 회복되면서 부상 후 1 ~ 3 일에 구속력이 약해졌습니다. 상처 입은 지 일주일 후, 대동맥은 개복술을 단독으로받은 대동맥과 같은 양의 에반스 블루를 묶었습니다. 통계적 유의성은 학생의 양측 t- 검정으로 결정되었다. * de유의 수준 p <0.05, n = 3, NS는 유의하지 않음을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 내측 과형성 및 내피 장벽 기능 장애를 초래하는 쥐 대동맥 손상 모델의 효과를 특성화했다. 대동맥 내막을 따라 부분적인 EC 분리는 세포 - 세포 접촉의 손실과 세포 돌출의 증가를 수반했다. 따라서, 내피 장벽 기능이 현저히 손상되어 분열 촉진 물질 민감성 신호 전달 경로가 자극되어 VSMC가 증식되고 혈관벽이 두꺼워진다. 이 모델의 강점은 다른 대동맥 질환 모델보다 배우고 실행하는 것이 기술적으로 더 쉽고 상해 및 내피 기능에 대한 증식 반응을 동시에 평가할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 실제 크러쉬 부상입니다. 압착 손상 범위 내에서의 가변성은 다양한 정도의 상해를 초래할 수 있으며, 따라서 가변적 인 양의 평활근 세포 증식을 초래할 수있다. 우리 연구실의 이러한 변동성을 줄이는 한 가지 단계는치료 또는 실험 조건을 알지 못하는 정신과 의사는 모든 상처 입은 부상을 수행합니다.
이 모델의 한계는 임상 적으로 관련된 인간의 질병 과정에 대한 일반화 가능성이다. 이 모델에서 VSMCs의 초기 강력한 증식 반응에도 불구하고, 재 협착의 후반 사건, 즉 신생 내막은 발생하지 않았다. 사이토 카인과 같은 염증 매개체의 감소는이 과정을 조절할 수 있습니다. 이 발견은 부분 손상으로 인한 내피의 신속한 회복 때문일 수 있습니다. 토끼 13 에서 이전에보고 된 혈관 압착 손상 모델과 유사하게, 면역 세포의 침윤은 사소한 것이었다. 본 연구에서 우리는 프로파일 러 어레이로 가짜 동물 및 대동맥 손상 동물의 염증성 사이토 카인의 프로파일을 평가 하였다. 그러나, 가짜 동물과 손상된 동물 사이의 증식 반응의 차이를 설명하는 사이토 카인 프로파일에는 유의 한 차이가 없었다 (데이터도시되지 않음). 현재 보고서에 설명 된 부상은 일시적으로 제한됩니다. 대동맥 혈관 형성 모델과 같은 대동맥 손상 및 내막 과형성의 다른 모델이 내피를 완전히 없애지 만, 현재 모델은 대동맥을 부분적으로 만 제거합니다. 내피의 완전한 박리는 회복하는데 훨씬 더 오랜 시간이 걸리고,이 동물들은 장시간 동안 부상의 결과를 경험합니다.
이 모델은 상해에 대한 VSMC 및 EC의 신속한 반응을 생성하여 일주일 내에 형태 학적 및 생화학 적 변화를 정량화합니다. 개입의 효과가 분명해지기까지 14-28 일이 걸리는 다른 모델보다 더 효율적입니다. 이 모델은 임상 관련 인간 혈관과 유사한 유일한 쥐 혈관 인 쥐 대동맥을 사용합니다. 다른 대동맥 모델과 비교 한이 기법의 중요한 이점은이 모델이 배우기가 상대적으로 쉽고 eq를 얻기가 비싸거나 어렵지 않다는 것입니다장비 2 , 3 , 4 , 5 . 결론적으로, 쥐 대동맥 박리 손상 모델은 VSMC 및 EC가 혈관 손상에 대한 반응을 동시에 평가하기 위해 기술적으로 직접적이고 저렴하며 효율적인 생체 내 플랫폼을 제공합니다.
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Disclosures
이 작품은 Veterans Affairs Career Development Award (1IK2BX001553-01) (TSM) 및 Vascular Cures EJ Wylie 장학금 (TSM)에 의해 지원되었습니다.
Acknowledgments
우리는 스캐닝 전자 현미경 샘플 처리에 대한 그녀의 기술 지원으로 Maryland School of Medicine의 Electron Microscopy Core Facility에서 Hsia Ru-ching 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
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- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
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