Summary
Restenosis após procedimentos cardiovasculares (cirurgia de bypass, angioplastia ou stent) é um problema significativo que reduz a durabilidade desses procedimentos. Uma terapia ideal inibiria a proliferação de células musculares lisas (VSMC) enquanto promovia a regeneração do endotélio. Descrevemos um modelo para avaliação simultânea da proliferação de VSMC e função endotelial in vivo.
Abstract
A reconstrução arterial, seja a cirurgia de angioplastia ou de derivação, envolve trauma iatrogênico causando ruptura endotelial e proliferação de células musculares lisas vasculares (VSMC). Modelos murinos comuns estudam pequenos vasos como as artérias carótida e femoral. Aqui, descrevemos um sistema in vivo no qual tanto a proliferação de VSMC quanto a função de barreira endotelial podem ser avaliadas simultaneamente em um vaso grande. Estudamos a resposta aórtica infra-renal a lesão em camundongos C57BL / 6. A aorta foi ferida da veia renal esquerda para a bifurcação aórtica por 30 esmagamentos transmurais de 5 segundos de duração com um aplicador com ponta de algodão. As alterações morfológicas foram avaliadas com histologia convencional. A espessura da parede da aorta foi medida a partir da superfície luminal para adventitia. A integração de EdU e a coloração de contadores com DAPI e alfa-actina foram utilizadas para demonstrar a proliferação de VSMC. A ativação de ERK1 / 2, um conhecido moderador da formação de hiperplasia intimal, foi dissuadidoExtraído pela análise Western Blot. O efeito da inflamação foi determinado por imuno-histoquímica para células B, células T e macrófagos . As seções de face do endotélio foram visualizadas com microscopia eletrônica de varredura (SEM). A função de barreira endotelial foi determinada com coloração Evans Blue. A lesão transmural resultou em espessamento da parede aórtica. Esta lesão induziu a proliferação de VSMC, mais proeminente aos 3 dias após a lesão e a ativação precoce de ERK1 / 2 e diminuiu a expressão de p7 kip1. A lesão não resultou em aumento da infiltração de células B, células T ou macrófagos na parede do vaso. A lesão causou desnudação de células endoteliais parciais e perda de contato célula-célula. A lesão resultou em perda significativa da função de barreira endotelial, que retornou à linha de base após sete dias. O modelo de ferimento aórtico transmural transmural murino fornece um sistema eficiente para estudar simultaneamente a proliferação de VSMC e a função de barreira endotelial em um vaso grande.
Introduction
Restenosis Após procedimentos cardiovasculares (cirurgia de bypass, angioplastia ou stent) é um problema significativo que reduz a durabilidade desses procedimentos. Todos os procedimentos de revascularização estão repletos de reestenose. As estratégias atuais para prevenir a reestenose (stents de libertação de fármaco e balões revestidos de drogas) inibem a célula muscular muscular lisa vascular (VSMC) e a proliferação de células endoteliais (EC). Conseqüentemente, essas intervenções impedem a reestenose mediada por VSMC, mas também impedem a regeneração do endotélio. Sem um endotélio intacto, os pacientes devem estar em potentes agentes antiplaquetários para diminuir o risco de trombose in situ no risco de complicações hemorrágicas. Uma terapia ideal inibiria a proliferação de VSMC enquanto promovia a regeneração do endotélio. Assim, há uma necessidade de estudar simultaneamente a proliferação de VSMC e a função de barreira endotelial i n vivo .
Atualmente, existemModelos de reestenose de mouse de al mouse 1 . Estes modelos incluem ligadura de carótida e lesão de fio arterial femoral 2 . Os modelos aórticos incluem posicionamento do stent 3 , lesão do balão 4 e aloenxerto aórtico 5 . Todos os modelos atuais são limitados. A ligação da carótida gera uma lesão neointimal mediada pelo fluxo e não possui lesão endotelial. Além disso, as artérias carotídeas e femorais têm muitas vezes menos camadas celulares que os vasos humanos, limitando seu valor de translação. A aorta do mouse, com aproximadamente 1,3 mm de diâmetro, é o único vaso que se aproxima de uma artéria humana (coronária) clinicamente relevante (3).
Apesar do potencial de tradução dos modelos aórticos murinos da doença, os modelos atuais têm limitações. Esses modelos exigem habilidades micro-cirúrgicas avançadas e equipamentos especializados, como balões de angioplastia e stents. Aqui, apresentamosUma técnica nova e reprodutível para induzir simultaneamente a proliferação de VSMC e interromper a função de barreira endotelial.
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Protocol
Declaração de Ética: os protocolos para manejo de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal (IACUC) da Universidade de Maryland (número de protocolo 0416009) e conduzido de acordo com os padrões AAALAC-International.
1. Procedimento cirúrgico
- Técnica anestésica
- Esterilize todos os instrumentos utilizados na cirurgia de sobrevivência com esterilização a vapor a 121 ° C durante 30 min.
- Induzamos a anestesia através de um tanque de indução com 100% de O2 e 2.5% de isoflurano administrado por vaporizador de precisão. Após a indução, interrompa o isoflurano e lave a câmara com O 2 . Manter anestesia com 1,5-2% de isoflurano através da máscara facial e 1 L / min O 2 por inalação.
- Anexe a câmara de indução e a máscara facial a um agente de tratamento de carvão para adsorção de gás residual para proteger o pessoal. Assegurar um plano anestésico adequado por demonstraçãoQue não há resposta a estímulos nocivos (pitada de dedo do pé).
- Crie um campo operacional consistindo em uma bandeja cirúrgica com almofada isotérmica para fornecer suporte térmico durante a cirurgia. Uma almofada isotérmica adicional proporcionará suporte térmico aos animais em sua gaiola de recuperação.
- Preparação Animal
- Realize a seguinte investigação sobre ratinhos C57BL / 6 machos de 10 a 12 semanas de idade.
- Remova o cabelo na superfície abdominal ventral do animal do esterno para a região inguinal com um agente depilatório ou uma cortadora elétrica com uma lâmina número 40.
- Em caso de agente depilatório, aplique este composto na área cirúrgica por 2-3 min e depois remova-o com algodão. Utilizamos um composto comercialmente disponível de hidróxido de cálcio e hidróxido de sódio.
- Prepare a área sobre o ombro com 70% de álcool e injete subcutaneamente carprofen (5 mg / kg) com uma agulha de calibre 25 ou menor. esteO tratamento proporcionará analgesia pós-operatória para o animal.
- Transfira o animal para o campo cirúrgico e posicione-se em recumbência dorsal.
- Prepare o local cirúrgico esfregando 8-12% providone-iodo com um aplicador de algodão limpo ou uma gaze de algodão. Em seguida, enxágue a pele duas vezes com 70% de álcool.
- Coloque o lubrificante ocular em ambos os olhos para reduzir a incidência de dessecação da córnea. Cubra o local cirúrgico com uma cobertura estéril.
- Técnica Operativa
- Faça uma mediana da incisão da laparotomia abdominal com aproximadamente 2-2,5 cm de comprimento com um bisturi começando imediatamente caudal no processo de xifóide e estendendo-se para a pélvis.
- Mobilize o intestino delgado e o duodeno e reflita lateralmente à direita. Enrole uma tira de algodão estéril gasteado e embebido com solução salina estéril para injeção para permitir a embalagem das vísceras para melhorar a exposição.
- Com o intestino delgado mobilizado para o lado direito doAbdômen, exponha o retroperitoneum e expõe a aorta abdominal da veia renal esquerda à bifurcação aórtica ( Figura 1 ).
- Com um aplicador de ponta de algodão estéril, entregue 30 tritões consecutivos, cada cinco segundos de duração.
- Remova a embalagem e permita que as vísceras voltem à sua posição nativa.
- Faixa da fáscia com uma sutura de monofilamento absorvente 4-0 (polydioxanona). A pele é fechada com uma sutura de monofilamento não absorvível de 6-0 (nylon).
- Assistência de recuperação e pós-procedimento
- Após o procedimento, coloque o animal em uma gaiola de recuperação com roupa de cama limpa em uma almofada isotérmica para continuar o suporte térmico até que o animal possa se mexer normalmente. Não deixe o animal desacompanhado até demonstrar a capacidade de manter a decúbito esternal.
- Monitore o animal a cada hora pelas primeiras 4 h após a cirurgia. Uma vez que o animal está ambulante normalmente retorna i T para a sala de criação atribuída. O animal não será alojado na companhia de outro animal até que ele tenha se recuperado completamente.
- Monitore o animal duas vezes ao dia durante as primeiras 72 h após a cirurgia e pelo menos 3 vezes por semana a partir de então. O monitoramento inclui a pesagem do animal três vezes por semana.
- Administrar carpofen (5 mg / kg) por via subcutânea duas vezes ao dia durante as primeiras 72 h após a cirurgia.
2. Procurement of Tissue
- Método de Eutanásia
- Eutanize os animais em pontos de tempo predeterminados.
- Induzamos a anestesia através de um tanque de indução com 100% de O2 e 2.5% de isoflurano administrado por vaporizador de precisão.
- Para estudar a integridade do endotélio, administre o corante azul Evans para o animal.
NOTA: Evans Blue é um corante azo com carga negativa com alta afinidade de ligação para a albumina e só pode manchar os vasos sanguíneos na ausência de um endotélio intactoS = "xref"> 6. - Para estudos de integridade endotelial, no momento da eutanásia, perfusar os animais com 5 mL de 0,3% de corante Evans Blue seguido por 5 mL de PBS a pressão fisiológica durante 5 min. O animal é mantido em um plano cirúrgico de anestesia durante o procedimento de perfusão.
- Para estudar a integridade do endotélio, administre o corante azul Evans para o animal.
- Depois de atingir um plano anestésico profundo, abra o baú com esternotomia. Faça uma laceração no átrio direito para permitir a drenagem do sangue do animal e o acesso ao ventrículo esquerdo seja acessado com uma agulha 21 G e injete solução salina tamponada com fosfato (PBS) até que o efluente do átrio direito seja limpo.
- Após a perfusão com PBS, entre no abdômen através de uma incisão na linha média.
- Mais uma vez, mobilize o intestino delgado para o lado direito do abdômen, expondo a aorta da infra-renal, dissecando a aorta dos tecidos adjacentes e extrale-a da veia renal esquerda para a bifurcação aórtica.
- Armazene a aorta excisada em um paraformald a 4%Solução de eído até o processamento do tecido.
- Para estudos de integridade endotelial, abra a aorta longitudinalmente e fixe-a para uma folha de cera expondo a totalidade da superfície luminal 6 . Realizar uma avaliação qualitativa da integridade endotelial pelo grau de coloração com corante Evans Blue 6 .
- Para outros ensaios histológicos, separe a aorta transversalmente e incorpore-a em compostos óptimos de temperatura de corte (OCT) conforme ditado pelo método histológico a ser utilizado 7 .
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Representative Results
As secções transversais da aorta embutidas em OCT foram seccionadas e coradas com hematoxilina e eosina, em seguida, foram coradas com mancha Verhoeff-Van Gieson (VVG) para identificar a lâmina elástica interna e externa 7 . Os danos causados por esmagamento induziram o espessamento da parede aórtica em comparação com os aortas de animais tratados com procedimento simulado (laparotomia e mobilização do intestino delgado sozinho). A espessura da parede, avaliada pela distância da adventitia ao lúmen, foi maior três dias após a lesão (42,2 ± 1,7 μm vs. 22,1 ± 1,1 μm para a laparotomia sozinha) ( Figura 2A-B ). A lesão resultou em células com um aspecto mais arredondado e um contorno irregular da superfície luminal ( Figura 2C ).
O aumento do espessamento da parede da aorta lesada é, pelo menos em parte, mediado pelo aumento da proliferação de músculos medianosCélulas celulares. Para provar que o espessamento da parede se deve ao aumento da proliferação em oposição à hipertrofia celular, utilizamos um ensaio de proliferação de EdU. Neste ensaio, o análogo de timidina 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) é administrado por via intravenosa ao rato 24 h antes da eutanásia. O EdU é incorporado no DNA durante a síntese. O EdU é detectado por uma reação de clique (cicatrização de azoto e alquina catalisada com cobre usando corante fluorescente verde) 8 . Os camundongos Sham expostos apenas à laparotomia não apresentaram fluorescência observada em qualquer camada da aorta. Conversley, camundongos submetidos a lesão aórtica demonstraram fluorescência na mídia e na íntima da aorta ( Figura 3 ).
O espessamento da parede da aorta após lesão por esmagamento ativa as vias de sinalização celular envolvidas na reestenose em seres humanos. A proteína quinase ativada por mitógenos (MAP Kinase) ERK1 / 2 é um dos principais mediadores da formação de hiperplasia intimalEm resposta à estimulação de um mitogênio, ERK1 / 2 é fosforilado e ativado 9 , 10 . Os dados do nosso laboratório também demonstraram que o inibidor de cinase dependente de ciclina p27 kip1 diminuiu em resposta a estímulos mitogênicos na parede do vaso 12 . Os ratinhos foram sacrificados a 1, 3, 7 dias e 1 mês após a lesão aórtica. A aorta infra-renal foi isolada e a expressão protéica de ERK1 / 2, fosfo-ERK1 / 2 (a forma ativada de ERK1 / 2) e o inibidor de kinase dependente de ciclina p27 kip1 foram determinados por análise de Western blot ( Figura 4A ). Não houve alteração na expressão total da proteína ERK1 / 2 ao longo do tempo. No entanto, três dias após a lesão, a expressão de fosfo-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) foi superior a 200% maior do que a expressão Pi-ERK1 / 2 da linha de base. A expressão de p27 kip1 diminuiu em pontos de tempo precoce e atingiu um nadir de aproximadamente 20% da linha de base sete dias apósFerimento. Ambos os níveis de linha de base estimados por Pi-ERK1 / 2 e p27 kip1 aproximaram-se um mês após a lesão ( Figura 4B ). Assim, o espessamento observado da parede aórtica é pelo menos em parte devido ao aumento da proliferação medial.
O modelo de lesão aórtica permite a avaliação simultânea da proliferação do músculo liso medial e da função da barreira endotelial. A microscopia eletrônica de varredura (SEM) foi utilizada para caracterizar o efeito da lesão de esmagamento na morfologia do endotélio. A superfície luminal da aorta é revestida por um endotélio confluente que previne a adesão de células e moléculas nascidas no sangue ( Figura 5A , Scale bar = 100 μm). Em contraste, lesões por esmagamento resultam em ruptura de células endoteliais e desnudação parcial do endotélio ( Figura 5B , barra de escala = 100 μm). Conforme visto em maior ampliação, a interrupção do endotélio resulta em adesiDe partículas consistentes em tamanho e forma com plaquetas. A adesão dessas partículas ocorre em toda a zona da lesão e não se limita a áreas de desnudatura bruta observadas a menor ampliação ( Figura 5C , barra de escala = 50 μm). A morfologia da partícula aderente é melhor observada em maior ampliação. Essas partículas são consistentes com plaquetas e fibrina ( Figura 5D , barra de escala = 10 μm).
Além da morfologia endotelial, a função de barreira do endotélio pode ser avaliada com este modelo de lesão vascular. O colorante azo Evans Blue não pode permear o endotélio normal e intacto da aorta murina. O dano à função de barreira do endotélio permite a coloração da membrana basal com Evans Blue. Os ratos tratados com uma laparotomia sozinhos (farsa) mantiveram a função de barreira do endotélio e estes aortas eram brancos. A lesão por esmagamento resultou emPerda difusa da função de barreira endotelial e estes aortas corados de azul escuro. A intensidade da coloração com Evans Blue diminuiu três dias após a lesão crush e a função de barreira completa foi restaurada na semana após a lesão ( Figura 6A ). A função de barreira endotelial pode ser ainda quantificada pesando as amostras e homogeneizando em 10 vezes o volume de solução de ácido tricloroacético a 50%. Diluir o sobrenadante em etanol com 4 vezes permite a determinação da intensidade de fluorescência (excitação de 620 nm e emissão de 680 nm) como descrito por Aoki et al . 11 . A quantidade de Evans Blue eluída da aorta infra-renal foi mais de três vezes maior nos aorta imediatamente após a lesão em comparação com aortas submetidas apenas a laparotomia (Ferido - Dia 0). A aorta continuou a manchar com Evans Blue aos um e três dias após a lesão, mas de forma menos intensa que no momento da lesão, sugerindo uma recuperação gradual da função da barreira endotelial. Uma semana atrasQuando a lesão lesada apresentou coloração equivalente como uma aorta tratada com laparotomia sozinha ( Figura 6B ).
Figura 1: A lesão é criada por esmagamento brusco da aorta da veia renal esquerda para a bifurcação aórtica. Figura adaptada com permissão de Yu et al ., PLoS One 2015 12 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: lesão por esmagamento induz o espessamento da parede da aorta. ( A ) As alterações morfológicas induzidas pelas lesões por esmagamento na aorta. As secções transversais representativas de 5 um foram coradas com VVG a 0,1, 3 e 7 dias após a lesão. Barras de escala = 100 μm. ( B ) A espessura da parede foi maior 3 dias após a lesão, 42,2 ± 1,7 μm, e foi significativamente maior que a aorta de animais simulados expostos à laparotomia sozinhos, 22,1 ± 1,1 μm. O significado estatístico foi determinado com o teste t de duas caudas do estudante. * Indica p <0,05, n = 3. ( C ) A lesão por esmagamento induziu uma aparência arredondada de VSMC medial (corada em verde para a actina do músculo liso) e alterando a orientação celular. Os núcleos foram contrastados com DAPI (azul). Barras de escala = 10 μm. Os dados são apresentados como médias e desvios-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: lesão por esmagamento induz a vida útil da célulaRação no muro da aorta. Os ratos foram expostos a laparotomia sozinha (farsa) ou a laparotomia com lesão aórtica. O análogo de timidina 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) foi administrado 24 h antes da eutanásia. O EdU é incorporado no DNA durante a síntese. EdU é detectado por uma reação de clique (cicatrização de azoto-alxina catalisada por cobre usando corante fluorescente verde). Não houve edU detectável (verde) na parede aórtica dos animais simulados. Nos animais submetidos à lesão por esmagamento, EdU manchou de forma proeminente na mídia da aorta e em um grau um pouco menor na íntima. As células do músculo liso vascular foram identificadas por coloração com anticorpo de actina do músculo liso (vermelho). Este achado sugere que o espessamento da parede observado observado na Figura 2 é devido ao aumento da proliferação celular. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figurinhaE.
Figura 4: A via de proteína quinase ativada por mitógenos (MAP Kinase) é ativada em resposta a lesão por esmagamento. ( A ) O MAP Kinase ERK1 / 2 é fosforilado quando ativado e está associado com hiperplasia e reestenose intimal. Os ratinhos foram sacrificados a 1, 3, 7 dias e 1 mês após a lesão aórtica. A análise Western Blot foi utilizada para avaliar a expressão protéica de ERK1 / 2 total, fosfo-ERK1 / 2 e o inibidor kinase dependente de ciclina p27 kip1 . A expressão de proteínas foi normalizada para um animal simulado tratado com laparotomia sozinho. ( B ) Nenhuma alteração foi observada na expressão total da proteína ERK1 / 2 ao longo do tempo. No entanto, três dias após a lesão, a expressão de fosfo-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) foi superior a 200% maior do que a expressão Pi-ERK1 / 2 da linha de base. A expressão de p27 kip1 diminuiu no início do tempo aponta umD atingiu um nadir de aproximadamente 20% da linha de base sete dias após a lesão. Tanto Pi-ERK1 / 2 quanto p27 kip1 expressão aproximaram níveis de linha de base um mês após a lesão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Lesões por esmagamento interrompe as células endoteliais da aorta. ( A ) Utilizou-se a microscopia eletrônica de varredura (SEM) para caracterizar o efeito da lesão por amora na morfologia do endotélio. A superfície luminal da aorta normal é revestida por um confônio, endotélio que previne a adesão de células e moléculas nascidas no sangue. ( B ) A lesão por esmagamento resulta na ruptura de células endoteliais e desnudação parcial do endotélio. ( C ) Como visto em maior magnificaA interrupção do endotélio resulta na adesão de partículas consistentes em tamanho e forma com plaquetas. A adesão dessas partículas ocorre em toda a zona da lesão e não se limita a áreas de desnudatura bruta observadas a menor ampliação. ( D ) A maior ampliação, essas partículas são consistentes com plaquetas e fibrina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: A lesão da aorta torácica permite a quantificação da função de barreira endotelial. ( A ) O dano à função de barreira do endotélio permite a coloração da membrana basal com corante Evans Blue. Os ratos tratados com uma laparotomia isolada (farsa) mantiveram a função de barreira do endotélio e daEsses aortas eram brancos. A lesão por esmagamento resultou em uma perda difusa da função de barreira endotelial e esses aortas coraram azul escuro. A intensidade da coloração com Evans Blue diminuiu três dias após a lesão crush, e a função de barreira completa foi restaurada na semana após a lesão. ( B ) A ligação de Evans Blue à aorta infra-renal foi quantificada por eluição de Evans Blue a partir da amostra e quantificação por intensidade de fluorescência. Os dados são apresentados como médias e desvios-padrão. A maioria dos Evans Blue foi eluída a partir da aorta imediatamente após a lesão crush. No momento da lesão, a aorta ligou três vezes mais Evans Blue do que a aorta submetida a laparotomia sozinha. À medida que a aorta foi autorizada a se recuperar, houve menos comprometimento a um e três dias após a lesão. Uma semana após a lesão, a aorta ligou a mesma quantidade de Evans Blue à medida que os aortas são submetidos a laparotomia sozinhos. O significado estatístico foi determinado com o teste t de duas caudas do estudante. * DeNotas p <0,05, n = 3, NS indica não significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Caracterizamos os efeitos de um modelo de lesão aórtica murina que resulta em hiperplasia mediana e disfunção da barreira endotelial. O destacamento parcial da CE ao longo da íntima da aorta acompanhou a perda do contato celular e o aumento das protrusões celulares. Correspondentemente, a função de barreira endotelial foi significativamente prejudicada, o que estimulou as vias de sinalização sensíveis aos mitógenos, levando à proliferação de VSMCs e engrossamento da parede vascular. Os pontos fortes deste modelo é que é tecnicamente mais fácil de aprender e executar do que outros modelos aórticos da doença e permite a avaliação simultânea da resposta proliferativa às lesões e à função endotelial. O passo crítico neste protocolo é a verdadeira lesão por esmagamento. A variabilidade na extensão da lesão por esmagamento pode resultar em diferentes graus de lesão e, portanto, quantidades variáveis de proliferação de células musculares lisas. Um passo que reduz essa variabilidade em nosso laboratório é ter um sCientista, cego ao tratamento ou condição experimental, realiza todas as lesões por esmagamento.
Uma limitação deste modelo é a sua generalização para processos de doenças humanas clinicamente relevantes. Apesar da resposta proliferativa inicial robusta de VSMCs neste modelo, não modela os eventos tardios de reestenose, ou seja, não se desenvolveu neointima. Os mediadores inflamatórios diminuídos, como as citocinas, podem regular esse processo. Esse achado pode ser devido à recuperação rápida do endotélio de uma lesão parcial. Semelhante a um modelo de lesão vascular vascular relatado anteriormente em coelhos 13 , a infiltração de células imunes era menor. Na presente investigação, avaliamos o perfil das citocinas inflamatórias, os animais simulados e os animais de lesão aórtica com o conjunto de profiler. No entanto, não houve diferença significativa no perfil da citocina que explicasse a diferença na resposta proliferativa entre animais simulados e feridos (dadosnão mostrado). A lesão descrita no presente relatório é temporariamente limitada. Enquanto outros modelos de lesão aórtica e hiperplasia da íntima, como o modelo de angioplastia aórtica, denusam completamente o endotélio, o modelo atual apenas denuncia parcialmente a aorta. A desnudação completa do endotélio requer significativamente mais tempo para se recuperar e esses animais experimentam os efeitos da lesão por um longo período de tempo.
Este modelo produz uma resposta rápida de VSMCs e ECs para lesão permitindo quantificação de alterações morfológicas e bioquímicas em uma semana. É mais eficiente do que outros modelos que levam 14-28 dias antes do efeito da intervenção ser evidente. Este modelo usa a aorta murina, que é o único vaso murino que se aproxima de um vaso humano clinicamente relevante. A vantagem significativa desta técnica em comparação com outros modelos aórticos é que esse modelo é relativamente fácil de aprender, e não requer caro ou dificil obter eqUipment 2 , 3 , 4 , 5 . Em conclusão, o modelo de lesão aórtica murina fornece uma plataforma in vivo tecnicamente simples, econômica e eficiente para avaliar simultaneamente a resposta de VSMCs e ECs a lesões vasculares.
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Disclosures
Este trabalho foi financiado pelo Prêmio de Desenvolvimento de Carreira do Departamento de Assistentes de Veteranos (1IK2BX001553-01) (TSM) e a bolsa de estudos EJ Wylie da Cura Vascular (TSM).
Acknowledgments
Agradecemos a Hsia Ru-ching PhD, do Centro de Microscopia Eletrônica da Faculdade de Medicina da Universidade de Maryland, pelo seu suporte técnico no processamento das amostras de microscopia eletrônica de varredura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
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