Artigo de método

Análise da segregação cromossômica, acetilação de histona e morfologia do fuso em ovócitos de cavalo

DOI:

10.3791/55242

⸱

11 de maio de 2017

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1Department of Health, Animal Science and Food Safety, University of Milan, 2IRCCS. Istituto Ortopedico Galeazzi, 3PRC, CNRS, IFCE, Université de Tours, INRA, 4PAO, INRA, 5Clinique des Animaux de Compagnie et des Équidés, Université de Liège, 6University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Cluj-Napoca, Romania

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito descreve uma abordagem experimental para caracterizar morfologicamente e bioquimicamente ovócitos de cavalo. Especificamente, o presente trabalho ilustra como recolher ovócitos de equídeos imaturos e maduros por captação de óvulos guiados por ultra-som (OPU) e como investigar a segregação cromossómica, a morfologia do fuso, a acetilação das histonas globais ea expressão de mRNA.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O campo da reprodução assistida tem sido desenvolvido para tratar a infertilidade em mulheres, animais de companhia e espécies ameaçadas. No cavalo, a reprodução assistida também permite a produção de embriões de alto desempenho sem interromper sua carreira esportiva e contribui para um aumento no número de potros de éguas de alto valor genético. O presente manuscrito descreve os procedimentos utilizados para a coleta de ovócitos imaturos e maduros de ovários de cavalo usando o coletor de óvulos (OPU). Estes oócitos foram então utilizados para investigar a incidência de aneuploidia através da adaptação de um protocolo previamente desenvolvido em ratinhos. Especificamente, os cromossomos e os centrómeros dos oócitos da metafase II (MII) foram marcados fluorescentemente e contados em planos focais sequenciais após varrimento de microscópio confocal a laser. Esta análise revelou uma incidência mais elevada na taxa de aneuploidia quando os oócitos imaturos foram recolhidos dos folículos e maturados in vitro em comparação comIn vivo. A imunocoloração para a tubulina ea forma acetilada da histona quatro em resíduos de lisina específicos também revelaram diferenças na morfologia do fuso meiótico e no padrão global de acetilação das histonas. Por fim, investigou-se a expressão de mRNAs que codificam histonas desacetilases (HDAC) e acetil-transferases (HATs) por transcrição reversa e PCR quantitativa (q-PCR). Não foram observadas diferenças na expressão relativa dos transcritos entre oócitos maturados in vitro e in vivo . De acordo com um silenciamento geral da actividade transcricional durante a maturação do oócito, a análise da quantidade total de transcrição só pode revelar estabilidade ou degradação do ARNm. Portanto, esses achados indicam que outras regulamentações de translação e pós-tradução podem ser afetadas.

Em geral, o presente estudo descreve uma abordagem experimental para caracterizar morfologicamente e bioquimicamente o oócito de cavalo, a ceTipo que é extremamente desafiador para estudar devido à baixa disponibilidade da amostra. No entanto, pode expandir nossos conhecimentos sobre a biologia reprodutiva e infertilidade em espécies monovulatórias.

Introdução

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Uma vasta gama de técnicas de reprodução assistida foi desenvolvida para tratar a infertilidade em mulheres, animais de companhia e espécies ameaçadas de extinção. Um dos procedimentos mais comuns em contextos clínicos é a recuperação de oócitos da fase metafásica II (MII) dos folículos ovarianos por aspiração transvaginal guiada por ultrassom, captação de óvulos (OPU) 1 . Estes oócitos são então fertilizados in vitro (FIV), com o (s) embrião (s) resultante (s) implantado (s) num útero receptor. Os oócitos do estádio MII (maduro) são recuperados após a administração de gonadotropinas exógenas. No entanto, este tratamento está associado, em alguns pacientes, ao desenvolvimento da síndrome de hiperestimulação ovariana (OHSS) 2 .

Aproveitando a capacidade intrínseca de ovócitos inteiramente crescidos e imaturos (estágio GV) para retomar espontaneamente a meiose uma vez isolado de seus folículos, é possível obter oócitos maduros sem adminisGonadotropina 3 . Esse procedimento é chamado de maturação in vitro de oócitos (IVM) e representa uma abordagem menos voltada para o uso de drogas, menos dispendiosa e mais paciente para a tecnologia de reprodução assistida. No entanto, o sucesso do desenvolvimento embrionário com oócitos maturados in vitro é geralmente menor do que com os oócitos maturados in vivo 4 , 5 . Uma possível explicação é que os oócitos maturados in vitro são mais afetados por erros na segregação cromossômica, ea aneuploidia resultante prejudica o desenvolvimento embrionário normal 6 .

Compreender as bases moleculares da segregação cromossômica errada durante IVM acabaria por revelar o pleno potencial desta técnica. Nesta via, a abordagem experimental utilizada para investigar as características morfológicas e bioquímicas dos oócitos maturados in vitro , em comparação com a maturidade in vivoEd oócitos é aqui descrito 7 , 8 . Especificamente, os procedimentos para a OPU de oócitos imaturos e maduros e a IVM de oócitos imaturos são ilustrados usando cavalos adultos e de ciclismo natural como modelo experimental. Em seguida, a imunofluorescência e a análise de imagem são usadas para investigar a segregação cromossômica, a morfologia do fuso e o padrão global de acetilação das histonas nesses gametas. Finalmente, é descrito um protocolo de transcrição reversa e PCR quantitativa para a análise da expressão de mRNA.

Em comparação com modelos de animais roedores, os cavalos não permitem a manipulação genética, são menos fáceis de manipular e requerem manutenção cara. No entanto, este modelo está ganhando interesse considerável para o estudo da maturação do oócito 9,10 , devido à semelhança com a fisiologia ovariana humana 11 , 12 </ Sup>. Além disso, o desenvolvimento de protocolos confiáveis ​​de IVM-IVF no cavalo tem um interesse econômico substancial, pois permitiria um aumento no número de potros de éguas de alto valor genético.

Uma das limitações da realização de experiências em oócitos, especialmente em espécies monovulatórias, é a disponibilidade restrita de amostras. Este limite foi superado aqui ajustando uma abordagem, previamente desenvolvida em ratinhos, a ovócitos de cavalo 13 , 14 para conduzir a contagem de cromossomas que minimiza a perda de amostra (ver a discussão para uma comparação com outras técnicas disponíveis). Além disso, um protocolo de coloração com fluorescência tripla foi otimizado para realizar múltiplas análises na mesma amostra, e as análises de q-PCR foram realizadas em pools de 2 oócitos apenas.

Em termos globais, o presente estudo descreve uma abordagem experimental destinada a caracterizar morfologicamente eRacterizar o oócito de cavalo, um tipo de célula que é extremamente desafiador para estudar devido à baixa disponibilidade da amostra. No entanto, pode expandir o nosso conhecimento da biologia reprodutiva e infertilidade das espécies monovulatórias.

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Protocolo

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Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais CEEA Val de Loire Número 19 e foram realizados de acordo com os Princípios Orientadores para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Coleção de Oócitos e Maturação In Vitro

  1. Recolha de óvulos
    1. Avaliar diariamente por ultra-som o diâmetro dos folículos ovarianos em uma coorte de éguas adultas. No surgimento de um folículo ≥ 33 mm (folículo dominante), injete a égua com 1.500 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG) na parte superior da veia jugular (iv).
      1. Antes de realizar a injeção, esfregue a área com álcool, localize o sulco jugular e coloque o polegar 2-3 cm sob o local da injeção para induzir a veia a subir. Insira a agulha quase paralela ao pescoço e aspirar para certificar-se de que a agulha está na veia (o sangue vai entrar na seringa). Neste ponto, injete; HCG irá induzir a mAtuação do oócito no folículo dominante.
    2. 35 h após a injecção de hCG, sedar a égua com detomidina (15 μg / kg, iv), tartarato de butorfanol (10 μg / kg, iv) e brometo de butilscopolamina (0,2-0,3 mg / kg, 15 mL / égua, iv).
    3. Conecte a agulha à sonda de ultra-som. Insira a sonda de ultra-som vaginalmente e segure o ovário transrectalmente para fazer face à sonda de ultra-som. Instruir um operador a manobra da agulha eo outro para manter o ovário no lugar, com o folículo voltado para a sonda de ultra-som . Comece a partir do ovário com o folículo dominante.
    4. Punção da parede vaginal e da parede do folículo dominante com a agulha (sondas de ultra-som para OPU são equipadas com um canal para a agulha conectada a um sistema de sucção); Serão visíveis na imagem ecográfica.
    5. Aspirar o fluido folicular em um tubo cônico de 50 mL ligado ao sistema de sucção. Despeje o conteúdo doTubo em uma grande placa de Petri e procurar o complexo cumulus-oócito (COC) usando um estereomicroscópio.
    6. Uma vez que o COC nem sempre é recuperado com o fluido folicular, lave o folículo com solução salina tamponada com fosfato modificada (DPBS) de Dulbecco contendo 5 UI / mL de heparinato a 37 ° C. Examinar DPBS para COC presença, como descrito anteriormente para o fluido folicular no passo 1.1.5. Lave várias vezes até que o COC seja recuperado.
    7. Uma vez que o COC do folículo dominante é recuperado, perfure e lave os folículos ≥ 5 e ≤ 25 mm, conforme descrito para o folículo dominante nos passos 1.1.3-1.1.4; Os folículos ≥5 e ≤25 não expressam o receptor da hormona luteinizante / coriogonadotropina (LHCGR) e, portanto, seus oócitos não amadurecerão em resposta à hCG e serão coletados no estádio GV (imaturos). Apenas mantenha COCs com várias camadas completas de células de cumulus e ooplasma marrom finamente granulado. Descarte os outros.
    8. No final da OPU, emA égua com benzil-penicilina 15.000 UI / animal para prevenir a infecção.
    9. Casa da égua em uma calma, estábulo limpo, pelo menos, 2 h. Verifique os sinais de consciência, determinando a posição das orelhas, a reação aos estímulos ( por exemplo, o ruído) e marcha antes de retornar a égua para a companhia de outros animais.
  2. Maturação in vitro
    1. TCM199 tamponado com HEPES quente (Hepes 20 mM) suplementado com heparina de 1790 UI / L, albumina de soro bovino (BSA) a 0,4%, penicilina e estreptomicina a 37 ° C. Prepare este meio com antecedência. Filtrar-esterilizar e mantê-lo a 4 ° C por até 6 meses.
    2. Preparar o meio IVM suplementando NaHCO3 com tampão TCM199 (25 mM NaHCO3) com 50 ng / mL de factor de crescimento epidérmico (EGF) e 20% de soro de vitelo 7 . Use NaHCO 3 -buffered TCM199 dentro de 3 semanas de abrir um novo frasco. Preparar o FEG com antecedência como 100x estoques, congelá-lo a -20 ° C, E usá-lo dentro de 6 meses. Distribuir 500 μL nos poços de uma placa de 4 poços e incubar em ar humidificado com 5% de CO 2 a 38,5 ° C durante pelo menos 2 h.
    3. Após a recuperação dos COCs dos folículos ≥5 e ≤25 mm, coloque-os em uma placa de Petri (diâmetro de 3,5 cm) cheia com 2 mL de HEPES-TCM199. Mover os COCs para diferentes áreas do prato, a fim de lavar os detritos celulares.
    4. Transferir os COCs para o meio IVM e incubar durante 28 h em ar umidificado com 5% de CO 2 a 38,5 ° C.

2. Imunofluorescência e Análise de Imagem

  1. Contagem de cromossomos
    1. Após a coleta do folículo dominante ou no final da IVM, incubar os COCs com monastrol 100 μM durante 1 h em ar umidificado com 5% de CO2 a 38,5 ° C. Preparar antecipadamente o monastrol como 100x estoques e armazená-lo a -20 ° C por até 1 ano.
    2. Remova as células cumulusTratando-os com hialuronidase a 0,5% ou pipetando suavemente; Remover a zona pelúcida tratando-a em 0,2% de pronase. Preparar a hialuronidase e a pronase com antecedência como 10x estoques e armazená-los a -20 ° C por até 1 ano.
    3. Fixar os oócitos em paraformaldeído a 4% em DPBS durante 15 min a 38,5 ° C seguido por mais 45 min a 4 ° C.
      CUIDADO! Usar equipamento de proteção pessoal ao manusear o paraformaldeído e eliminar os materiais contaminados de acordo com as diretrizes de eliminação de resíduos perigosos.
    4. Lavar os oócitos por transferência sequencial em 3 poços cheios com 500 μL de DPBS suplementado com álcool polivinílico a 0,1% (PVA). Permeabilize em Triton X-100 a 0,3% durante 10 min à temperatura ambiente (RT).
    5. Bloqueia a ligação não específica por incubação em DPBS suplementado com albumina de soro bovino a 1% (DPBS-1% de BSA) e soro de burro normal a 10% durante pelo menos 30 min à RT. As amostras podem ser mantidas em solução de bloqueio a 4 ° C durante 3-4 dias.
    6. Para a coloração primária, incubar os oócitos em coelho anti-Aurora B fosfo-Thr232 em DPBS suplementado com 1% BSA (diluição 1:50) a 4 ° C durante a noite.
    7. Lavar os oócitos como descrito no passo 2.1.4. Incubar os oócitos numa solução de anti-IgG anti-coelho conjugado com isotiocianato de tetra-metilrhodamina (TRITC) (1: 100 em DPBS-1% BSA) durante 1 h à RT no escuro.
    8. Lavar os oócitos como descrito no passo 2.1.4 e, em seguida, colocar 3-4 oócitos numa gota de meio de montagem não endurecedor e anti-fade suplementado com YOPRO1 20 μM num vidro. Repita o procedimento até que todos os ovócitos estejam montados (3-4 oócitos por lâmina).
    9. Permitir que os oócitos para resolver por cerca de 10 min no meio de montagem e, em seguida, cobri-los com uma lamela. Para evitar o esmagamento dos oócitos, aplique duas tiras de fita dupla face antes de colocar a lamela na lâmina de vidro.
      NOTA: Esta precaução também assegurará que todas as amostras estejam igualmente comprimidas entre o vidro sliDe e a lamela. As lâminas de vidro podem ser congeladas a -20 ° C e fotografadas durante os 2-3 dias seguintes.
    10. Imagem das amostras em um microscópio confocal de varredura a laser com um objetivo de 60X usando os canais vermelho (centromeres) e verde (cromossomos) 7 , 13 , 14 , 20 , 21 . Digitalizar as amostras abrangendo toda a placa metafásica no eixo z, com passos cada 0,35 μm. Salve as imagens digitalizadas de cada plano.
    11. Contar os centromeres em seções confocal serial usando a função de contagem de células do software NIH ImageJ (disponível em: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
      NOTA: Evite uma contagem repetida de centromeres que aparecem em seções adjacentes, identificando os centromeres que aparecem, permanecem e desaparecem em seqüências com um código numérico.
    12. Repita o cromossômico coUnindo no passo 2.1.11 com um operador independente.
      NOTA: Classifique os oócitos como euploides (32 cromossomos), hiperplóides (> 32) ou hipoplóides (<32).
  2. Morfologia do fuso e acetilação das histonas
    1. Após a coleta do folículo dominante ou no final da IVM, remover as células cumulus por tratamento em hialuronidase a 0,5% ou por pipetagem suave, conforme descrito no passo 2.1.2.
    2. Lavar os oócitos em DPBS-PVA, como no passo 2.1.4, e fixá-los em paraformaldeído a 2,5% durante 20 min a 38 ° C. Lavar extensivamente, tal como descrito no passo 2.1.4, e permeabilizar em 0,1% de Triton X-100 durante 5 min à TA.
      NOTA: Usar equipamento de proteção pessoal ao manusear o paraformaldeído e eliminar os materiais contaminados de acordo com as diretrizes de eliminação de resíduos perigosos.
    3. Bloqueia a ligação não específica por incubação em DPBS suplementado com 2% de albumina de soro bovino (DPBS - 2% de BSA), 0,05% de saponina e 10% de soro de burro normalR 2 h à TA.
      NOTA: As amostras podem ser mantidas em solução de bloqueio a 4 ° C durante 3-4 dias.
    4. Para a coloração primária, incubar os oócitos em anti-alfa-tubulina de ratinho (1: 150) e anti-acH4K16 de coelho (1: 250) em DPBS-2% BSA com 0,05% de saponina a 4 ° C durante a noite.
    5. Lave os oócitos como no passo 2.1.4. Incubar os oócitos numa solução de IgG anti-rato de burro conjugado com corante fluorescente verde (1: 500) e IgG anti-coelho conjugado com TRITC (1: 100) em DPBS-2% de BSA com 0,05% de saponina durante 1 h a RT no escuro.
    6. Lavar os oócitos como no passo 2.1.4 e, em seguida, colocar 3-4 oócitos numa gota do meio de montagem não endurecível e anti-fade suplementado com 1 μg / mL de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) Em uma lâmina de vidro.
    7. Monte os oócitos em lâminas de vidro como descrito no passo 2.1.8.
    8. Image as amostras em um microscópio confocal de varredura a laser com um objetivo 60x usando os canais vermelho (acH4K16), verde (alfa-tubulina) e azul (DNA).
      NOTA: Mantenha as configurações de laser para os canais vermelho e azul constantes durante a aquisição de todas as amostras. Digitalizar as amostras abrangendo todo o fuso meiótico e placa metafásica no eixo z, com passos cada 0,35 μm. Salve as imagens digitalizadas (planos únicos e imagem 3D projetada).
    9. Meça o comprimento do eixo do pólo a pólo e o diâmetro do fuso na largura máxima na imagem projetada usando a função de medição do software NIH ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30 .html). Repita cada 3 vezes e calcule a média.
    10. Quantifique a fluorescência relativa de acH4K16 usando a função de densidade integrada do software NIH ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Normalize-o para a densidade integrada da coloração DAPI.

3. Análise da Expressão de mRNA

  1. Depois de os COCs terem sido recuperados dos folículos de 5 a 25 mm, recolher as células da granulosa sQue permaneceu na placa de Petri e lavou-a duas vezes em DPBS frio por centrifugação a 10.600 xg durante 2 min. Snap congelar em azoto líquido. Armazenar as amostras a -80 ° C por até 6 meses; As células servirão para a curva padrão.
  2. Remova cuidadosamente todas as células cumulus, como descrito no passo 2.1.2, a partir de oócitos maduros (GV), maturados in vitro e in vivo .
  3. Lavar os oócitos, tal como descrito em 2.1.4, em DPBS-PVA, recolhê-los individualmente em volumes de 1 μL e colocar 2 μL de RNALater por cima. Snap-freeze em nitrogênio líquido. Armazenar as amostras a -80 ° C por até 6 meses.
  4. Adicionar 2 pg de RNA de luciferase a cada amostra como um pico-in. Juntar os oócitos 2 x 2 e extrair o RNA total utilizando um kit à base de filtro de membrana de sílica adequado para recuperar RNA de pequenas amostras.
  5. Reverse-transcrever o ARN em 10 μL com 0,25 μg de hexâmeros aleatórios e transcriptase reversa do vírus da leucemia Moloney de rato durante 1 h a 37 & # 176; C. Armazenar as amostras a -20 ° C por até 6 meses.
  6. Diluir o cDNA das células da granulosa em água isenta de RNAse para 50 ng / μL. Diluir seriamente esta solução 1:10 para obter soluções de 5 ng / μL, 0,5 ng / μL, 0,05 ng / μL e 0,005 ng / μL.
  7. Reúnam-se as reacções em triplicado num volume total de 20 μL por reacção utilizando ADNc equivalente a 0,05 oócitos como substrato, ou 5 μL das diluições em série de cDNA de células de granulosa, 10 μL de super-mistura SYBR verde e 0,3 μM de cada iniciador específico Tabela 1 ).
  8. Executar a reacção num ciclador térmico utilizando um protocolo de 3 passos: 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 20 s, repetido 40 vezes. Finalmente, adquire a curva de fusão, a partir de 60 ° C, e aumente a temperatura em 0,5 ° C a cada 20 s até 95 ° C.
  9. Avaliar a quantidade inicial (SQ) do mRNA específico nas amostras de oócitos utilizando a curva padrãoF "> 15 calculado com base na amostra de células da granulosa Expressar os dados como a razão entre o SQ do gene de interesse eo SQ dos genes housekeeping.

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Resultados

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As descobertas originais destas experiências foram descritas em profundidade previamente 7 e são aqui relatadas como um exemplo de resultados que podem ser obtidos utilizando os protocolos descritos.

Taxa de maturação

Dos 32 COCs obtidos pela OPU dos folículos dominantes, 28 (88%) estavam na fase MII. Quatorze dos 58 COCs coletados de folículos ...

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Discussão

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Embora a IVM tenha sido realizada em cavalos há mais de 20 anos 16 , ainda não sabemos se o oócito pode ser a origem da aneuploidia embrionária, como tem sido proposto para os seres humanos 17 . A razão é provavelmente que a preparação de spreads de oócitos para contagem de cromossomos resulta em perda de amostra considerável. Com isto em mente, um levantamento dos métodos utilizados para investigar erros na segregação cromossômica foi conduzido para procurar a técnica mai...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Os autores gostariam de agradecer a Fabrice Vincent pelo suporte com microscopia confocal de varredura a laser (LSCM) e Philippe Barrière e Thierry Blard pela realização de exames de ultra-sonografia ovariana diária e injeção de hCG. Este trabalho foi apoiado em parte pelo projecto "Ex Ovo Omnia" (Concessão nº 26096200 à AML) "Regione Sardegna and Regione Lombardia"; (Contrato 2012 a FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, Agência de Execução de Investigação (REA) "Pro-Ovum" (subvenção n.º 303640 a VL); E pela Escola de Pós-Doutoramento em Agricultura e Medicina Veterinária, co-financiada pelo Fundo Social Europeu, Programa Operacional Sectorial para o Desenvolvimento de Recursos Humanos 2007-2013 (Contrato POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 ao IM). A coleta de oócitos in vivo foi financiada pelo Institut Français du Cheval et de l'Equitation.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
sonda de ultrassomAlokaUST-5820-7,5
centravet de gonadotrofina coriônica humanaCHO0041.500 unidade/animal
IV centravet de detomidinaMED0109 - 15 µ g/kg IV
butilescopolamina bromurecentravetEST0010,2 mg/kg IV
estereomicroscópioNIKONSMZ-2B
butorfanolcentravetDOL00310µ g/kg IV
benzil-penicilinacentravetDEP203 IM15.000 UI/animal
TCM199Sigma-AldrichM3769 10X1Lpó para tamponado com hepes TCM199
Sal de sódio para hepesSigma-AldrichH3784-100G
albumina de soro bovinoSigma-AldrichA8806
heparina Sigma-AldrichH3149-10KU
NaHCO3-tamponado TCM199Sigma-AldrichM2154-500MLlíquido para fator
crescimento epidérmicoSigma-AldrichE4127
soro de bezerro recém-nascidoSigma-AldrichN4762-500ML
pratos de 4 poçosNUNCLON
HeraeusBB6060
monastrolSigma-AldrichM8515
hialuronidaseSigma-AldrichH3506
pronaseSigma-AldrichP5147
paraformaldeídoSigma-AldrichP6148
álcool polivinílicoSigma-Aldrich341584
triton-X 100Sigma-AldrichT8787
soro de burro normalSigma-AldrichD9663
coelho anti-Aurora B fosfo-Thr232BioLegend636102
burro conjugado com TRITC anti-coelho IgGVector Laboratories711-025-152
Vecta-ShieldVector LaboratoriesH-1000
YOPRO1Thermofisher MicroscópioScientific Y3603
LSM 780Zeiss
confocal de varredura a laserLSM 700Zeiss
ImageJ softwarersb.info. nih.gov/ij/download.htmlrecurso
mouse anti-alfa-tubulinaSigma-AldrichT8203
coelho anti-acH4K16Upstate Biotecnologia07-329
AlexaFluor 488-coniugated burro anti-rato IgGLife TechnologiesA21202
4',6-diamidino-2-fenilindolSigma-AldrichD8417Centrífuga DAPI
Eppendorf5417R
RNALaterInvitrogenAM7020
Luciferase RNAPromegaL4561
Kit de isolamento de RNA PicoPureApplied Biosystems12204-01
hexâmeros aleatóriosThermofisher ScientificN8080127
camundongo Moloney leucemia vírus transcriptase reversaThermofisher Scientific
SYBR supermix verde BioRad1708880
primers específicosSigma-Aldrichprimers específicos foram projetados usando o software Primer3Plus (recurso gratuito)
termocicladorBioRadMyiQ
camundongo monoclonal anti-CENPAAbcamab13939
camundongo monoclonal anti-Aurora BAbcamab3609
de médio IVM incubadora 144444 confocal de varredura a laser microscópio gratuito 28025013

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467(1984).
  2. Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials. Hum Reprod. , (2016).
  3. Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
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