Abstract
Placenta er det første organ til at udvikle under embryogenese og er nødvendig for overlevelsen af den udviklende embryo. Moderkagen består af diverse trofoblastiske celler, der adskiller fra de ekstra-embryonale trophectoderm celler i præimplantationsperioden blastocyst. Som sådan er vores forståelse af de tidlige differentiering begivenheder i den menneskelige placenta begrænset på grund af etiske og juridiske begrænsninger på isolation og manipulation af menneskelige embryogenese. Humane pluripotente stamceller (hPSCs) er et robust modelsystem til undersøgelse menneskelig udvikling og kan også differentieres in vitro til trofoblastiske celler, der udtrykker markører for de forskellige trofoblast celletyper. Her præsenterer vi en detaljeret protokol for at differentiere hPSCs i trofoblastiske celler ved hjælp knoglemorfogent protein 4 og inhibitorer af Activin / Nodal signalveje. Denne protokol genererer forskellige trofoblast celletyper, der kan transficeres med siRNAstil undersøgelse tab-of-funktion fænotyper eller kan være inficeret med patogener. Derudover kan hPSCs modificeres genetisk og derefter differentieret til trofoblast progenitorer for gevinst af funktion analyser. Dette in vitro differentiering fremgangsmåde til frembringelse af menneskelige trofoblaster startende fra hPSCs overvinder de etiske og juridiske begrænsninger for at arbejde med tidlige menneskelige embryoner, og dette system kan bruges til en lang række applikationer, herunder forsknings- og stamcelleforskning.
Introduction
Moderkagen er nødvendig for vækst og overlevelse af fosteret under graviditeten og letter udveksling af gasser, næringsstoffer, affaldsprodukter og hormoner mellem mødres og føtale cirkulation. Det første organ dannet under pattedyr embryogenese er placenta, som begynder at udvikle 6-7 dage efter undfangelse og 3,5-4,5 dage i mus 1, 2, 3, 4. Trofoblastiske celler er de vigtigste celler i placenta, og disse celler repræsenterer en af de tidligste afstamning differentieringsfaktorer begivenheder af pattedyr embryo. De opstår fra de ydre ekstra embryonale trophectoderm celler i præimplantationsperioden blastocyst. Vores viden om de tidlige stadier af placenta udvikling er begrænset af etiske og logistiske begrænsninger for modellering tidlig menneskelig udvikling.
Under embryonisk implantation trophoblasterinvadere den maternale epitel og differentiere til specialiserede progenitorceller 5. Cytotrophoblaster (CTBS) er mononukleære, udifferentierede forfædre, der smelter og differentierer i syncytiotrofoblaster (Syns) og extravillous invasive trophoblaster (EVTs), som anker moderkagen til livmoderen. Syns er flerkernede, terminalt differentierede celler, som syntetiserer hormoner er nødvendige for at opretholde graviditet. De tidlige differentiering begivenheder, der genererer EVTs og Syns er afgørende for placenta dannelse, som nedskrivninger i trofoblastiske celler resulterer i abort, præeklampsi, og intrauterin vækst begrænsning 1. De typer af humane trofoblast cellelinier, som er blevet udviklet, indbefatter udødeliggjort CTBS og choriocarcinomas, som producerer placentale hormoner og display invasive egenskaber 6. Primære trofoblastiske celler fra humane første trimester moderkager kan isoleres, men cellerne hurtigt differentiate og stoppe prolifererende in vitro. Vigtigere, transformeret og primære cellelinier har forskellige genekspressionsprofiler, hvilket indikerer, at tumorigene og udødeliggjort trofoblast cellelinjer ikke præcist kan repræsentere primære trophoblaster 7. Derudover disse linjer er usandsynligt at ligne placenta trofoblast stamceller stamfædre, fordi de stammer fra senere fase først gennem tredje trimester.
Der er behov for et robust in vitro kultursystem for early stage humane trofoblaster for at studere de tidlige begivenheder af placental dannelse og funktion. Humane embryonale stamceller (hESCs), som deler egenskaber med den indre cellemasse af embryo præimplantationsperioden, anvendes ofte til at modellere tidlig menneskelig udvikling, herunder dannelsen af den tidlige placenta. Både humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) og hESCs kan opdeles i trophoblaster in vitro under anvendelse Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Denne omdannelse af pluripotente celler til trofoblastiske celler under anvendelse BMP4 er specifikt for humane celler og er almindeligt anvendt til at undersøge udviklingen af den tidlige humane placenta fordi det ikke kræver adgang til tidlige humane embryoner 9, 16. For nylig blev det opdaget, at tilsætning af inhibitorerne A83-01 (A) og PD173074 (P), som blokerer SMAD2 / 3 og MEK1 / 2 signalveje, øger effektiviteten af hPSC differentiering til trophectoderm-lignende progenitorer, primært Syns og EVTs, uden den omfattende generation af mesoderm, endoderm eller ektoderm celler 9, 17 in vitro-modelsystem 9, 11. Her præsenterer vi en detaljeret protokol til in vitro differentiering af hPSCs i humane trofoblast stamfædre hjælp BMP4 / A / P dyrkningsmedium. Disse betingelser producere rigelige antal celler til en lang række anvendelser, herunder RNA-sekventering, genafbrydelse hjælp siRNA'er, patogene infektioner, og genetisk modifikation under anvendelse af lipofektion-medieret transfektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: differentieringen af enten hESCs eller hiPSCs i trofoblast stamceller hPSCs dyrket på muse embryonale fibroblaster (MEF'er) er skiftet til fødefri betingelser for to passager inden initiering differentiering med BMP4 / A / P. Denne proces eliminerer MEF kontaminering af differentierede celler. Her præsenterer vi en protokol for embryonale differentiering, og den samme protokol kan anvendes på hiPSCs.
1. Kultur og Recovery af hESCs på bestrålede mus embryonale fibroblaster (MEF) (præparater)
- Gamma-bestråling af MEF'er
- Gør 500 ml medium til dyrkning af MEF'er: DMEM med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1x penicillin / streptomycin (Pen / Strep) og 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer (NEAA).
- Tø et hætteglas af primære MEF'er og bruge MEF medium til dyrkning af cellerne. Expand de primære MEF'er til 30 plader under anvendelse MEF dyrkningsmedium.
BEMÆRK: Oxygenkoncentrationer er ikke kritiske for dette trin, såenten kan anvendes fysiologiske (4%) eller omgivende (20%) forhold i inkubatoren. - Høste MEF. Bruge 0,25% trypsin for at fjerne de MEF'er fra pladerne og overføre cellerne til en konisk rør. Placer MEF'er til et bestråling instrument og eksponere cellerne til 3.500 gråtoner.
BEMÆRK: Den tid vil afhænge af aktiviteten af kilden inde i strålerøret enhed. - Resuspendere bestrålede MEF'er med MEF dyrkningsmedium og tælle antallet af celler under anvendelse af et hæmocytometer.
- Pelletere MEF'er anvendelse af en centrifuge og tilsættes 50% MEF dyrkningsmedium og 50% celle frysemedium (80% FBS og 20% MEF dyrkningsmedium). Alikvot 1 x 10 6 celler pr hætteglas.
- Placer bestrålede MEF hætteglas i en -80 ° C fryser natten over, og derefter overføre dem til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
- Optøning af frosne MEF'er og hESCs til kultur
- Lav 500 ml embryonale medium: DMEM / F-12 med 20% Serum Replacement, 0,1 mM NEAA, 2 mM L-glutamin, 10 ng / ml bFGF, 0,1 mM ß-mercaptoethanol og 1 x Pen / Strep.
- Optø et hætteglas af MEF én dag før optøning af hESCs. Coat en 6-brønds plade med 0,1% gelatine, ved hjælp af 1 ml for hver brønd. Inkuber i mindst 20 minutter ved stuetemperatur, og derefter fjerne gelatine.
- Fjern et hætteglas med MEF'er fra opbevaring i flydende nitrogen og fordybe hætteglasset i et 37 ° C vandbad. Se hætteglasset intermitterende indtil kun små iskrystaller tilbage. Hurtigt overføre indholdet af hætteglasset til 9 ml MEF medium inde i en 15 ml konisk rør.
- Pelletere cellerne ved centrifugering ved 200 xg i 5 min. Aspirere supernatanten og resuspender cellepelleten i MEF medium. Alikvot den MEF'er jævnt på en 6-brønds plade. Sæt pladen i en 37 ° C med lavt oxygen (4%) inkubator natten over.
- Rutinemæssig kultur af hESCs på MEF
- Fjern en hESC hætteglas fra flydende nitrogen og hurtigt tø hætteglasset ved hjælp af en 37 ° C vandbad. Forsigtigt pipette de hESCs i en 15 ml konisk rør indeholdende 9 ml embryonale medium og spin ned ved 200 xg i 5 min. Fjern mediet og udeluk cellerne med 1 ml embryonale medium.
- Aspirer MEF medium fra pladen forberedt i trin 1.2.4 og der tilsættes 1 ml af embryonale menneskelige stamceller medium. Tilføj Rock inhibitor Y-27632 (10 uM) til embryonale medium. Overfør hESCs på MEF.
- Placer cellerne i et 37 ° C med lavt oxygen (4%) inkubator natten over. Udskift hESC medium dagligt. Skrab differentierede celler med en Pasteur-pipette, visualiseret under en opretstående mikroskop ved 4X.
- Passage de hESCs hver 4-6 dage, afhængig af cellekonfluens og størrelsen af hESC kolonier. Forbered en plade af MEF dagen før passage. Når cellerne er klar til passage, fjerne embryonale medium og vask grundigt med 1 ml PBS.
- Tilsæt 1 mg / ml collagenase (forvarmet til 37 ° C), inkuberes ved 37 ° C i 5 minutter, og fjern collagenase. Wash cellerne med PBS, tilsættes 1 ml embryonale medium per brønd, og manuelt skrabe cellerne i små klumper med spidsen af en 5 ml pipette. Overfør suspenderede celleklumper til en ny MEF-coatet brønd (e).
2. Overgang af hESCs fra MEF'er til Feeder-fri betingelser på ekstracellulære matrix-coatede plader
- Forbered MEF Conditioned Medium (CM)
- Plate de bestrålede MEF i en T75 kolben på 90-100% sammenløb; Det er vigtigt, at MEF'er tæt udplades. Observere cellerne under anvendelse af et mikroskop for at bestemme, om de har fastgjort til bunden af kolben (MEF vedhæfte ca. 6 timer efter udpladning eller næste dag).
BEMÆRK: Løse celler flyde i mediet, når observeret ved hjælp af et mikroskop. Den næste dag fjernes MEF medium og tilsættes 25 ml embryonale medium uden B-FGF. - Indsamle det konditionerede medium efter 24 timer inkubation. Erstat med frisk medium daglig i højst 12 dage. Foretage opsamlet CM anvendelse af et 0,22 um filter. Før anvendelse tilsættes frisk B-FGF til CM.
BEMÆRK: CM kan fryses ved -80 ° C og opbevares i op til 1 år. Alternativt opbevares CM ved 4 ° C i 2 uger.
- Plate de bestrålede MEF i en T75 kolben på 90-100% sammenløb; Det er vigtigt, at MEF'er tæt udplades. Observere cellerne under anvendelse af et mikroskop for at bestemme, om de har fastgjort til bunden af kolben (MEF vedhæfte ca. 6 timer efter udpladning eller næste dag).
- Overgang de hESCs fra kulturen på MEF til feeder-fri ekstracellulære matrix-coatede plader.
- Fremstilling af ekstracellulær matrix til belægning vævskulturplader
- Tø en alikvot af ekstracellulær matrix på is (ca. 3-4 timer). Brug af iskold Tips, en kold, 50 ml konisk rør, og DMEM / F12-medium, Overfør 2 mg af ekstracellulær matrix i 24 ml iskold DMEM / F-12 (fortyndingen afhænger af den ekstracellulære matrix koncentration fra leverandøren ).
- overføre Umiddelbart 50 ml konisk rør til is og opbevar det ved 4 ° C. Til belægning vævskulturplader, tilsættes en passende mængde af fortyndet ekstracellulær matrix til brønden (f.eks 1 ml per brønd i en 6-brønds plade). Swirl at belægge pladen og inkuber ved stuetemperatur i mindst 1 time.
- Passage hESCs fra MEF'er (som i trin 1.3) ved hjælp af CM indeholdende B-FGF (10 ng / ml).
- Aspirer at fjerne den ekstracellulære matrix fra den nye plade og tilføje CM indeholdende B-FGF. Overfør skrabet cellulære klumper fra MEF plade med en pipette og udportionerer den ind i det ekstracellulære matrix-coatede plade. Der inkuberes i 37 ° C med lavt oxygen inkubator natten over.
- Udskift CM med B-FGF medium dagligt; mængden af mediet vil afhænge af størrelsen af dyrkningskolbe. Brug 2 ml medium for en 6-godt godt. Skrabe differentierede celler med en Pasteur-pipette.
- Passage hESCs hver 6-7 dage, når kolonierne er lyse, når de ses under mikroskop.
BEMÆRK: hESC kolonier dyrket på ekstracellulære matrix-coatede plader vokse sig større end MEF-dyrkede celler. - Når feeder-fri celler er klar til passage, fjerne mediet, vask af annonceDing 1 ml PBS under anvendelse af en pipette, aspirat at fjerne PBS, tilsættes 0,5 mg / ml dispase (forvarmet til 37 ° C) med en pipette, og der inkuberes ved 37 ° C i 5 min.
- Vask cellerne med PBS ved tilsætning af 2 ml PBS per brønd og opsugning bagefter. Der tilsættes 1 ml CM per brønd og manuelt skrabe cellerne i små klumper med spidsen af en 5 ml pipette.
- Plate de suspenderede celleklumper til nye ekstracellulære matrix-coatede plader; cellerne skal overholde efter 24 timer.
- Fremstilling af ekstracellulær matrix til belægning vævskulturplader
3. Differentiering af hESCs Brug BMP4 / A / P
- Forbered differentiering medium. Brug CM (der mangler B-FGF) og tilsæt (friske) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 uM), og PD173074 (0,1 uM). Tilføj disse inhibitorer til CM før brug.
- Brug fødefri hESCs vokser på ekstracellulære matrix-coatede plader i 1 passage, dyrket inde i en inkubator indstillet til 4% oxygen. Efter den første passage på ekstracellulær matrix-coatede plader,Lad cellerne binde i 24 timer. Den næste dag, initiere differentiering. Fjern CM (indeholdende B-FGF) og erstatte det med CM indeholdende BMP4 / A / P (2 ml per brønd i en 6-brønds plade). Fortsæt dyrkning af cellerne under anvendelse af 4% ilt niveauer.
- Erstatte CM indeholdende BMP4 / A / P (2 ml / brønd i en 6-brønds plade) hver 2. dag. Aspirer at fjerne den gamle medium og tilføje nye CM anvendelse af en pipette. På den anden dag efter tilsætning BMP4 og fjernelse B-FGF (betragtet differentiering dag 2), vil cellemorfologien ændres, vises større når de observeres under anvendelse af et mikroskop.
BEMÆRK: udifferentierede celler, som udviser lyse runde kanter, vil ikke være til stede. - Saml celler på ønskede tidspunkter. Differentierede celler vil stoppe dividere efter omkring 2 uger. Transficere celler i løbet af denne periode (se næste afsnit).
4. Transfektion af trofoblastceller med siRNA'er eller Plasmid-DNA
- Forbered trofoblastiske celler til transfektion
- Kultur hESCs for to passager på ekstracellulær matrix efter at overføre dem fra MEF'erne (se trin 2.2). Brug hESC medium indeholdende B-FGF.
- Split de hESCs på en ny ekstracellulær matrix plade en dag før differentiering. Høj cellulær konfluens er vigtig, så opdele cellerne 1: 1 på en ny plade / brønd, som vil sikre mindst 50% konfluens den næste dag. Inkuber cellerne natten over i lav-oxygen-inkubator.
BEMÆRK: hESCs behøver ikke at blive talt under dette trin. - Den næste dag udskiftes mediet med differentieringen medium (CM indeholdende BMP4 / A / P og mangler B-FGF, under anvendelse af 2 ml / brønd i en 6-brønds plade). Fjern det gamle medium ved aspiration og overføre det nye medium (2 ml) ved anvendelse af en pipette. Placer cellerne i et lavt iltindhold inkubator (4% oxygen) natten over.
- Differentiere cellerne, indtil den ønskede tids-(mellem dag 1 og 14). Dagen før transfektion Trypsinisér cellerne under anvendelse af 0,05% trypsin i 5 minutter. Plate dem til den ønskede konfluens (afhængigt af transfektionsreagens protokol) på en gelatine-coatet plade (tilsæt 0,1% gelatine til en vævsdyrkningsplade i 20 minutter og aspirat at fjerne). Tilføj CM indeholder BMP4 / A / P (mangler B-FGF) og inkuberes natten over.
- Den næste dag, tilsættes frisk differentiering medium til cellerne. Transficere siRNA'er anvendelse af et siRNA-transfektionsreagens. For plasmid-DNA, bruge en passende lipofectamin-reagens.
- Følge produktet protokol som beskrevet for hver transfektionsreagens. Overfør siRNA-Lipofectamin komplekser til hver brønd / plade af celler, bland forsigtigt og dyrke cellerne natten over i en lav-oxygen-inkubator.
BEMÆRK: Visse transfektionsreagenser hæmmes af antibiotika, som kræver CM mangler Pen / Strep. - Den næste dag, udskiftes med frisk differentiering medier.
- Cellerne høstes på ønsketd tidspunkter (f.eks 24 timer, 48 timer og 72 timer) til at kontrollere genafbrydelse effektivitet ved brug af kvantitativ RT-PCR. Til høstning af celler, bruge 0,05% trypsin, tilsætning af 1 ml per brønd og inkubering i 5 minutter ved 37 ° C. Der tilsættes 5 ml MEF medium per brønd for at neutralisere trypsin. Spin ned cellerne ved 200 x g i 5 min og bruge cellepelleten i RNA-isolering.
5. patogeninfektion af trofoblastceller: Sendai virusinfektion
- Forbered hESCs til differentiering
- Kultur hESCs for to passager på ekstracellulær matrix efter overførslen fra MEF'erne (se trin 2.2). Brug hESC medium indeholdende B-FGF.
- Split de hESCs på en ny ekstracellulær matrix plade en dag før differentiering. Høj cellulære sammenflydning er vigtige, så opdele celler 1: 1 på en ny plade / brønd, som vil sikre mindst 50% sammenflydning den næste dag. Inkuber cellerne natten over i et lavt iltindhold inkubator (4% oxygen). <br /> BEMÆRK: hESCs behøver ikke at blive talt under dette trin.
- Den næste dag udskiftes mediet med differentieringen medium (CM indeholdende BMP4 / A / P og mangler B-FGF) og kultur natten over i en lav-oxygen inkubator (4% oxygen).
- Sendai viral infektion af trofoblastceller
- En dag før den ønskede differentiering dag, Trypsinisér de differentierende celler (til enkelte celler) under anvendelse af 0,05% trypsin i 5 minutter og overføre dem til en gelatine-coatet plade. Tilføj differentiering medium og inkuberes natten over i en lav-oxygen-inkubator.
- Den næste dag tilsættes medium for infektion (dette vil variere afhængigt af virus). Brug CM mangler Pen / Strep indeholdende BMP4 / A / P, der anvendes 0,5 ml for en brønd i en 6-brønds plade. Tilføj Sendai-virus for MOI = 1. Inkuber i 8 timer i en lav-oxygen-inkubator.
- Hvis der er behov yderligere tidspunkter, fjerne virus medium efter 4 timer og erstatte det med BMP4 / A / P CM. Saml cellerfor RNA-isolering under anvendelse af en celleskraber.
- Bestemme effektiviteten af viral infektion ved udførelse QRT-PCR for gener involveret i den virale svar 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oversigt over In Vitro Differentiering af hPSCs
Dette in vitro-differentiering protokol begynder med udifferentierede hESCs dyrket på MEF'er, der er skiftet til fødefri betingelser for en passage (figur 1A). Mens vi beskrev differentieringen af hESCs i denne protokol, brugte vi denne protokol med succes differentiere hiPSCs i trofoblastiske celler. Overgangen til ekstracellulær matrix fjerner størstedelen af de bestrålede MEF'er, som er uønskede til analyser, der kræver rene populationer af humane trofoblastiske celler. Udifferentierede hPSCs dyrkes på ekstracellulær matrix og dyrket med CM indeholdende B-FGF indtil kolonierne er klar til passage (ca. en uge). Dette fastholder den pluripotente tilstand forud for at fremkalde BMP4 / A / P-medieret differentiering. Kolonierne er forstyrret i klumper af ~ 50-100 cellerhjælp dispase og passeret en anden gang på en ekstracellulær matrix-coatede plade. Dagen efter passage, de adhærente celler er klar til at inducere differentiering, og mediet skiftet til indeholde BMP4 / A / P mangler B-FGF. De differentierede celler prolifererer i ca. 2 uger, i hvilket tidsrum cellerne kan opsamles til RNA isolering eller anvendt til transfektionseksperimenter. Morfologiske ændringer vises 1-2 dage efter differentiering er igangsat, og resultaterne fra et repræsentativt forsøg er vist i figur 1B. Bemærk at celler på differentieringsfaktorer dage 1-2 er større i størrelse end cellerne fra dag 0 (figur 1B). Den differentierede celle koloni vokser hurtigt, og denne ændring er mærkbar hver dag. Som differentierende skrider frem, deler cellerne og udvide ud fra midten af kolonien, der vokser i en udadgående retning (dag 3-5, figur 1 B). Den ydre del af kolonien indeholder større celler sammenlignet med than celler i centrum af kolonien. De differentierende celler bliver mørkere og fladere end pluripotente stamceller dyrket på ekstracellulær matrix; ændringerne i celle lysstyrke er mere synlige, når du ser cellerne med en opretstående mikroskop bruges til rutinemæssig cellekultur. De individuelle kolonier flette sammen ved differentiering dag 5 (figur 1B), med celler voksende oven på hinanden. Efter differentiering dag 4-5, celler indeholdende multiple kerner er til stede (ikke vist) (figur 1B).
BMP4 / A / P inducerer differentiering og ekspression af trofoblast Markers
Vi undersøgte genekspression ændringer i løbet af de første tre dage af BMP4 / A / P differentiering ved hjælp af kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR). RNA isoleredes differentieringsfaktorer dag 1, 2, og 3 og omdannes til cDNA. Forsvinden af pluripotente stamceller kan vurderes både By morfologi, visuelt ved mikroskopi og ved QRT-PCR under anvendelse af primere for pluripotens gener. De relative ekspressionsniveauer af NANOG, en markør af pluripotente stamceller, reduceres med ~ 75% efter én dags differentiering, når celler dyrkes med BMP4, og niveauerne er reduceret med ~ 90% i nærvær af BMP4 / A / P ( figur 2). Ved differentiering dag 2, niveauerne af NANOG er meget lav for celler dyrket i BMP4 alene eller i BMP4 / A / P forhold til dem i embryonale CM medium (indeholdende B-FGF). Dette er en forventet resultat, fordi vi ikke overholder udifferentierede celler efter to dages differentiering (figur 1B), som er lysere og mindre i størrelse i forhold til differentierede celler. Effektiviteten af BMP4-medieret differentiering til trofoblastiske celler kan direkte vurderes ved QRT-PCR under anvendelse af primere specifikke for to trofoblast markører: KRT7 og CDX2. Begge disse gener ikke udtrykkes i human pluripotente stamcellerceller, og deres ekspression øges efter 2-3 dages BMP4 behandling (figur 2). Brug de betingelser, der er beskrevet her, KRT7 transkriptniveauer stige på differentiering dag 1 i BMP4 / A / P medium og forbliver konstant i de første 3 dage af differentiering (figur 2). KRT7 udtryk ved brug af BMP4 alene har en forsinket stigning på dag 2 efter aftale med tidligere observationer, at Activin / Nodal hæmmere øger differentiering på hESCs 9. En anden måde at vurdere effektiviteten af anvendelse af disse inhibitorer er at bestemme steady-state overflod af CDX2 og KRT7 transkripter i celler behandlet med BMP4 alene. CDX2 niveauer er ens for differentiering dag 1-3 ved brug af enten BMP4 alene eller BMP4 sammen med Activin / Nodal hæmmere. Men KRT7 transkripter er mere rigelige efter én dags differentiering i nærvær af disse inhibitorer, hvilket tyder på en merehurtig differentiering (figur 2). CDX2 udtryk topper typisk ved differentiering dag 2 for begge forhold og falder efter dag 3 (figur 2). Udifferentierede hESCs udtrykker ikke hverken KRT7 eller CDX2 (figur 2), som forventet. Afslutningsvis BMP4 / A / P forhold hurtigt differentiere hESCs, og placenta markør udtryk kan påvises så tidligt som differentiering dag 3.
Transfektioner af siRNA'er og plasmid-DNA og virusinfektioner Brug In Vitro afledte trophoblastisk Cells
In vitro afledte humane trofoblastiske celler kan transficeres med siRNA'er at forstyrre genekspression af enten kodende eller ikke-kodende RNA'er. Vi indledte differentiering af hESCs under anvendelse BMP4 / A / P, udføres to runder af siRNA transfektioner (med 75 pmol siRNA'er) på differentieringsfaktorer dag 1 og 2,og indsamles cellerne i RNA-isolering. Kvantitativ RT-PCR er en effektiv metode til bestemmelse af knockdown effektivitet for enten kodende eller ikke-kodende gener. Brug to siRNAs komplementære til forskellige regioner i lange, ikke-kodende RNA lncRHOXF1 19, opnåede vi 80% knockdown af lncRHOXF1 udskrifter (figur 3A). Dernæst transficerede vi en siRNA (25 pmol) til protein-kodende gen hnRNP U, også på differentierende dag 1 og 2. Vi observerede en 80% reduktion i hnRNP U-transkripter efter to på hinanden følgende transfektioner. In vitro differentierede trophoblast progenitorceller kan også anvendes til at undersøge medfødte immunresponser. Vi udførte infektioner af differentiering dag 2 celler under anvendelse Sendai-virus ved en MOI på 1 og opsamlet cellerne efter 8 timer af viral inkubation. Brug af QRT-PCR, vi har registreret rigelige viralt protein transkripter (Sev-NP) i inficerede celler (figur 3B), hvilket indikerer aktiv viral propagation i trofoblastiske celler. Vigtigere, inficerede celler (ved hjælp MOI = 1) ændrer ikke i udseende og er levedygtige (data ikke vist). In vitro afledt trofoblastiske celler kan også transficeres med plasmid-DNA. Vi udførte transfektioner under anvendelse af en GFP plasmid og indført denne konstruktion i BMP4 / A / P-behandlede celler på differentiering dag 1 og dag 3 og afbildes for GFP den følgende dag (figur 4). Vi typisk opnået 30-50% transfektionseffektivitet ved 24 timer efter transfektion. Som konklusion kan in vitro afledt trofoblastceller anvendes til GAIN- og tab-af-funktion eksperimenter.
Figur 1: In vitro differentiering af humane pluripotente stamceller til tidlige trofoblastiske celler under anvendelse BMP4 / A / P. (A) Skematisk af BMP4 differentiering af hPSCs til trofoblastiske celler ved hjælp BMP4 / A / P. (B) Repræsentative lyse-field billeder af HUES9 celler under d0, d2, og d6 af BMP4 / A / P differentiering. Scale bar = 50 uM. Pilene angiver encellede hESCs, der ikke differentierede. Pilene fremhæve morfologiske træk under differentiering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: BMP4 / A / P differentiering nedregulerer hurtigt pluripotens markør NANOG og opregulerer trofoblast gener CDX2 og KRT7. QRT-PCR-analyse for NANOG (pluripotens markør), CDX2, og KRT7 (trofoblast markører). Værdierne er gennemsnit fra tredobbelte foranstaltninger. //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Gene forstyrrelser og virusinfektion anvendelse af in vitro differentierede humane trofoblastiske celler. (A) QRT-PCR-analyse af hESCs (HUES9) differentieret og derefter transficeret med siRNA'er specifikke for den lange, ikke-kodende RNA lncRHOXF1 (venstre) eller protein-kodende gen hnRNP U (højre) i to på hinanden følgende dage. Knockdown effektivitet (KD) er typisk 70-80%, og resultaterne fra en transfektion forsøg er vist. (B) QRT-PCR-analyse af Sendai virusproteinet udskrift af differentiering dag 2 trofoblastiske celler inficeret med Sendai-virus (MOI = 1) i 8 timer. Fejlsøjlerne angiver SEM."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Indførelse af plasmid DNA i in vitro differentierede humane trofoblastiske celler. Transfektion af GFP plasmid DNA i differentiering dag 1 og dag 3 trophectoderm progenitorceller, visualiseret den følgende dag. Scale bar = 50 uM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenterede de grundlæggende trin for at differentiere hESCs i trofoblast stamfædre. Denne protokol er for nylig blevet optimeret til hurtigt differentiere hESCs med tilsætning af activin / Nodal signaling inhibitorer, øge differentieringen til trofoblastiske celler og undgå dannelsen af mesoderm progenitorer, som typisk observeres med BMP4 behandling alene. Det BMP4 model system giver mulighed for undersøgelse af de tidligste stadier af menneskets trofoblast afstamning specifikation og ekspansion. Derudover denne BMP4 modelsystem er også nyttig til undersøgelse af differentiering af trofoblastiske celler til specifikke undergrupper afstamninger, hvilket ikke er muligt ved hjælp choriocarcinoma cellelinjer og extravillous trophoblast cellelinier. In vitro afledt trofoblastiske celler kan også anvendes til tab-af-funktion forsøg med siRNAs 19. Derudover kan hESCs eller hiPSCs være genetisk modificeret til inducerbar ekspression af transgen ES 19 eller til indsættelse af reportergener på endogene loci 20, og disse celler kan differentieres til trofoblastiske celler under anvendelse af betingelserne beskrevet her.
Kritiske trin i protokollen
Det er bydende nødvendigt at udelade B-FGF (FGF2) fra CM differentiering medium for at opnå trofoblastiske stamceller fra hESCs. Tilstedeværelsen af B-FGF sammen med BMP4 i dyrkningsmediet forøger ekspressionen af mesoderm og endoderm progenitorer 16. Inddragelsen af B-FGF i trofoblasten differentiering medium menes at forklare, hvorfor en nylig undersøgelse viste, at BMP4-medieret differentiering genererer mesoderm og endoderm celler i stedet for trophoblaster 21. Det er veletableret, at B-FGF sammen med activin A og BMP4 fremmer endoderm og mesoderm differentiering i en dosisafhængig måde 22,s = "xref"> 23. I musen er udviklingen af epiblasten, trophectoderm, og primitive endoderm slægter er afhængige af FGF signalveje 24. I differentiere hESCs, er B-FGF-induceret signalering kræves til mesoderm formation når BMP4 anvendes til at inducere differentiation 21, 25. I modsætning hertil inhiberingen af både FGF og activin / Nodal signalveje, sammen med BMP4, favoriserer SYN-dannelse i hESC-afledte trofoblast progenitorer og forhindrer dannelsen af mesoderm og primitive endoderm progenitorer 26.
Begrænsninger af teknikken
Den mest typiske problem med denne protokol af hPSC differentiering til trofoblast stamfædre er forbundet med at starte med en overvejende udifferentieret population af hESCs eller hiPSCs på MEF. Fordi hPSCs akkumulere differentierede celler ved både de indre og ydre kanteraf kolonierne, er det vigtigt at overvåge mængden af differentiering dagligt og fjerne differentierede kolonier (eller dele af kolonier). Tilstedeværelsen af differentierede celler kan komplicere differentiering proces, navnlig når cellerne overføres til den ekstracellulære matrix. De differentierede celler vil hurtigt proliferere på den ekstracellulære matrix i nærværelse af CM, og disse celler vil hurtigt overtage den kultur og udkonkurrere de hPSCs. Derfor er det ideelt til at begynde med sunde, udifferentierede kolonier af hPSCs dyrket på MEF'er før overførsel af cellerne til den ekstracellulære matrix.
Betydningen af Teknik med Respekt for eksisterende / Alternative Metoder
Ved brug af denne differentiering protokol, de resulterende trofoblast ophav er en heterogen blanding af celletyper. Trofoblaster består af villøse cytotrophoblaster, syncytiotrofoblaster (Syns) og extravillous cytotrophoblaster(EVTs) 27. Villøse cytotrophoblaster er de stamceller, der genererer EVTs og Syns. BMP4-opdelte hPSCs vil generere en blanding af villøse cytotrophoblaster, Syns og EVTs 9, 15, der er blevet fastlagt af genet eller protein ekspression af placenta-specifikke markører. De distinkte differentieringsveje kan skelnes ved sekretion af HLA-G (karakteristisk for EVTs) eller humant choriongonadotropin (fra Syns) 28, 29. For nylig er det blevet vist, at inhiberingen af activin / Nodal signalering favoriserer EVT differentiering fra hESCs, og fjernelse af denne inhibering favoriserer differentiering til SYN 17. Faktisk en tidligere publikation fandt, at bruge BMP4 alene at differentiere hESCs genererer det meste SYN celler 26. De data ved hjælp BMP4 / A / P og konditioneret medium (mangler B-FGF) viser, at derer både EVT og SYN celler til stede ved differentiation dag 5. Hvis der ønskes yderligere oprensning ren EVT eller SYN populationer ved hjælp celleoverflademarkører, såsom HLA-G konjugeret til perler til isolering af EVTs, er mulig 29. Afslutningsvis kulturen her beskrevne fremgangsmåde er en effektiv måde at generere betydelige mængder trofoblastiske celler fra hPSCs, der kan bruges til en lang række applikationer. Fordi denne protokol genererer både Syns og EVTs, det er en egnet modelsystem til undersøgelse af tidlige humane placenta. Disse celler kan anvendes til en lang række applikationer, herunder lægemiddeludvikling og genteknologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 µm syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
References
- Rugg-Gunn, P. J.
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
- Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
- Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
- Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
- Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
- Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
- Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
- Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
- Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
- Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
- Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
- Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be? Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
- Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
- Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
- Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082 (2009).
- Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
- Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
- Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
- Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
- Cole, L. A.
- Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
