Abstract
Morkaken er den første orgel til å utvikle under embryogenese og er nødvendig for overlevelsen av utvikling av embryo. Morkaken består av diverse trofoblastisk celler som skiller fra de ekstra-embryonale trophectoderm cellene i preimplantation blastocyst. Som sådan, er vår forståelse av de tidlige differensierings hendelsene i human placenta begrenset på grunn av etiske og juridiske restriksjoner på isolasjon og manipulasjon av menneskelig embryogenese. Humane pluripotente stamceller (hPSCs) er et robust modellsystem for å undersøke humant utvikling og kan også bli differensiert in vitro inn i trofoblastisk celler som uttrykker markører for de forskjellige trophoblast celletyper. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å differensiere hPSCs inn trofoblastisk celler ved hjelp av bein morphogenic protein 4 og hemmere av de activin / nodal signalveier. Denne protokollen genererer ulike trophoblast celletyper som kan transfektert med sirnasfor å undersøke tap-av-funksjon fenotyper eller kan være infisert med patogener. I tillegg kan hPSCs genmodifisert og deretter differensiert i trophoblast stamfedre for gevinst-of-funksjonsanalyser. Denne in vitro differensiering metode for generering av menneskelige trophoblasts fra hPSCs overvinner de etiske og juridiske begrensninger ved å jobbe med tidlig menneskelige embryo, og dette systemet kan brukes til en rekke applikasjoner, inkludert medisiner og stamcelleforskning.
Introduction
Morkaken er nødvendig for vekst og overlevelse av fosteret under graviditet og forenkler utveksling av gasser, næringsstoffer, avfallsstoffer og hormoner mellom mors og fosterets sirkulasjon. Den første organ som dannes i løpet av pattedyr embryogenese er placenta, som begynner å utvikle 6-7 dager efter befruktning hos mennesker og 3,5-4,5 dager i mus 1, 2, 3, 4. Trofoblastiske celler er de viktigste cellene i morkaken, og disse cellene representerer en av de tidligste avstamning differensierings hendelsene i pattedyr embryo. De oppstår fra de ytre ekstra-embryonale trophectoderm cellene i preimplantation blastocyst. Vår kunnskap om de tidlige stadiene av morkake utvikling er begrenset av etiske og logistiske begrensninger på modellering tidlig menneskelig utvikling.
Under embryonale implantasjon, trophoblastsinvadere mors epitel og differensiere i spesialiserte stamceller 5. Cytotrophoblasts (CTBS) er mononukleærerte, udifferensierte stamceller som blandes og differensiere til syncytiotrophoblasts (Syns) og extravillous invasive trophoblasts (EVTs), som anker morkaken til livmor. Syns er multinucleated, terminalt differensierte celler som syntetisere hormoner som er nødvendige for å opprettholde svangerskapet. De tidlige differensiering hendelser som genererer EVTs og Syns er avgjørende for morkakedannelse, som svekkelser i trofoblastisk cellene føre til spontanabort, svangerskapsforgiftning, og intrauterin veksthem en. De typer menneskelige trophoblast cellelinjer som er utviklet blant annet foreviget CTBS og choriocarcinomas, som produserer placenta hormoner og vise invasive egenskaper 6. Primære trofoblastiske celler fra menneske første trimester placentas kan isoleres, men cellene raskt differentiate og stoppe proliferating in vitro. Viktigere, transformert og primære cellelinjer har ulike genuttrykk profiler, noe som indikerer at tumorigen og udødeliggjort trophoblast cellelinjer kanskje ikke nøyaktig representerer primær trophoblasts 7. I tillegg er disse linjene er usannsynlig å likne morkake trophoblast stamcelle forfedre fordi de er utledet fra senere stadium først gjennom tredje trimester.
Det er et behov for et robust in vitro kultursystem med tidlig stadium humane trofoblaster for å studere de tidlige hendelsene i morkakedannelse og funksjon. Humane embryonale stamceller (hESCs), som deler egenskaper med den indre cellemasse av preimplantasjonsperioden embryo, blir ofte brukt til å modellere tidlig menneskelig utvikling, inkludert dannelsen av de tidlige placenta. Begge menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCs) og hESCs kan differensieres til trophoblasts in vitro ved hjelp av Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Denne omdannelse av pluripotente celler til trofoblastisk celler ved hjelp BMP4 er spesifikk for humane celler og er mye brukt for å studere utviklingen av tidlig human placenta fordi den ikke krever tilgang til tidlige humane embryo 9, 16. Nylig ble det oppdaget at tilsetning av inhibitorene A83-01 (A) og PD173074 (P), som blokkerer SMAD2 / 3 og MEK1 / 2 signalveier, øker effektiviteten av hPSC differensiering til trophectoderm-lignende forløpere, hovedsakelig Syns og EVTs, uten omfattende generering av mesoderm, endoderm eller ektoderm celler 9, 17 in vitro modell system 9, 11. Her presenterer vi en detaljert protokoll for in vitro differensiering av hPSCs inn menneskelige trophoblast stamceller ved hjelp BMP4 / A / P kulturmedium. Disse betingelsene produserer rikelig antall celler for en lang rekke anvendelser, inkludert RNA-sekvensering, gen avbrudd ved hjelp av sirnas, patogene infeksjoner, og genetisk modifisering ved hjelp av lipofeksjon-mediert transfeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: For differensiering av enten hESCs eller hiPSCs inn trophoblast stamfedre, hPSCs dyrket på mus embryonale fibroblaster (MEFs) blir overført til mater-frie forhold for to passeringer før oppstart differensiering med BMP4 / A / P. Denne prosessen eliminerer MEF forurensning av differensierte celler. Her presenterer vi en protokoll for hESC differensiering, og den samme protokoll kan anvendes for å hiPSCs.
1. Kultur og gjenoppretting av hESCs på Bestrålte mus embryonale fibroblaster (MEFs) (Preparater)
- Gamma-bestråling av MEFs
- Gjør 500 ml medium for dyrking av MEFs: DMEM med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1x penicillin / streptomycin (Pen / Strep), og 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer (NEAA).
- Tine en ampulle med primær MEFs og bruke MEF medium for dyrking av cellene. Utvide de primære MEFs til 30 plater ved hjelp av MEF kulturmediet.
MERK: Oksygenkonsentrasjonen er ikke kritisk for dette trinnet, såenten fysiologiske (4%) eller omgivelses (20%) betingelser i kuvøse kan anvendes. - Høste MEFs. Bruk 0,25% trypsin for å fjerne MEFs fra platene og overføre cellene til en konisk tube. Plasser MEFs inn et bestråling instrument og eksponere cellene til 3500 gråtoner.
MERK: Tiden vil avhenge av aktiviteten av kilden inne til stråleenheten. - Resuspender de bestrålte MEFs med MEF kulturmedium og telle antallet celler ved hjelp av et hemocytometer.
- Pellet MEFs ved hjelp av en sentrifuge, og tilsett 50% MEF kulturmedium og 50% cellefrysemedium (80% FBS og 20% MEF kulturmedium). Delmengde 1 x 10 6 celler per hetteglass.
- Plasser bestrålte MEF hetteglassene i en -80 ° C fryseren over natten, og deretter overføre dem til flytende nitrogen for langtidslagring.
- Opptining av frosne MEFs og hESCs for kultur
- Lag 500 ml hESC medium: DMEM / F-12 med 20% serum fortrengtement, 0,1 mM NEAA, 2 mM L-Glutamin, 10 ng / ml bFGF, 0,1 mM P-merkaptoetanol og 1 x Pen / Strep.
- Tine en ampulle med MEFs en dag før tining hESCs. Belegge en 6-brønns plate med 0,1% gelatin, ved hjelp av 1 ml for hver brønn. Inkuber i minst 20 minutter ved romtemperatur, og deretter fjerne gelatin.
- Fjern en ampulle med MEFs fra lagring i flytende nitrogen og lev hetteglasset i et 37 ° C vannbad. Se hetteglasset midlertidig inntil bare små iskrystaller forbli. Raskt overføre innholdet i hetteglasset til 9 ml MEF medium inne i et 15 ml konisk rør.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 200 xg i 5 minutter. Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i MEF medium. Alikvot den MEFs jevnt på en 6-brønners plate. Sette platen inn i en 37 ° C med lav oksygen (4%) inkubator over natten.
- Rutinemessig kultur hESCs på MEFs
- Fjern en hESC ampulle fra flytende nitrogen og raskt tine hetteglasset ved hjelp av et tre7 ° C vannbad. Forsiktig pipette de hESCs inn i en 15 ml konisk rør som inneholder 9 ml hESC medium og spinne ned ved 200 xg i 5 min. Fjern medium og resuspender cellene med 1 ml hESC medium.
- Aspirer MEF medium fra platen utarbeidet i trinn 1.2.4 og tilsett 1 ml hESC medium. Legg Rock inhibitor Y-27632 (10 mm) til hESC medium. Overfør hESCs på MEFs.
- Plassere cellene i et 37 ° C med lav oksygen (4%) inkubator over natten. Bytt hESC medium daglig. Skrap av differensierte celler med en Pasteur pipette, visualisert under en oppreist mikroskop på 4X.
- Passasje de hESCs hver 4-6 dager, avhengig av celle konfluens og størrelsen på hESC kolonier. Forbered en plate av MEFs dagen før aging. Når cellene er klare til å passasje, fjerne hESC mediet og vask godt med 1 ml PBS.
- Tilsett 1 mg / ml kollagenase (forvarmet til 37 ° C), inkuberes ved 37 ° C i 5 minutter, og fjerne den kollagenase. Waske cellene med PBS, tilsett 1 ml hESC medium per brønn, og manuelt skrape cellene i små klumper ved hjelp av tuppen på en 5 ml pipette. Overfør de suspenderte celleklumper inn i en ny MEF-belagt brønn (er).
2. Overgang av hESCs fra MEFs til mater-frie betingelser på ekstracellulær matriks-belagte plater
- Forbered MEF Kondisjonert Medium (CM)
- Plate de bestrålte MEFs i en T75 kolbe på 90-100% konfluens; er det viktig at MEFs er tett belagt. Observere cellene ved hjelp av et mikroskop for å bestemme hvorvidt de er festet til bunnen av kolben (MEFs feste omtrent 6 timer etter plating eller den neste dag).
MERK: fristilt celler flyte i mediet når observert ved hjelp av et mikroskop. Neste dag, fjerne MEF medium og tilsett 25 ml hESC medium som mangler B-FGF. - Samle det kondisjonerte mediet etter 24 timers inkubering. Bytt ut med friskt medium daglig i maksimalt 12 dager. Filtrer samlet CM ved hjelp av en 0,22 mikrometer filter. Før bruk, legge fersk B-FGF til CM.
MERK: CM kan fryses ved -80 ° C og lagres i opp til ett år. Alternativt lagre CM ved 4 ° C i 2 uker.
- Plate de bestrålte MEFs i en T75 kolbe på 90-100% konfluens; er det viktig at MEFs er tett belagt. Observere cellene ved hjelp av et mikroskop for å bestemme hvorvidt de er festet til bunnen av kolben (MEFs feste omtrent 6 timer etter plating eller den neste dag).
- Transition de hESCs fra kultur på MEFs å mater frie ekstracellulære matrix-belagte plater.
- Fremstilling av ekstracellulær matriks for belegning vevskulturplater
- Tine en delmengde av ekstracellulær matriks på is (ca. 3-4 timer). Ved hjelp av is-kald tips, en kald, 50 ml konisk rør, og DMEM / F12-medium, overføring 2 mg av ekstracellulær matriks inn i 24 ml is-kald DMEM / F-12 (fortynningen avhenger av den ekstracellulære matriks-konsentrasjonen fra leverandør ).
- Umiddelbart overføre 50 ml konisk rør til is og lagre det ved 4 ° C. For belegg vevskulturplater, tilsett passende mengde fortynnet ekstracellulær matriks til brønnen (f.eks, 1 ml per brønn i en 6-brønn plate). Virvel for å belegge platen og inkuber ved værelsetemperatur i minst en time.
- Passasje hESCs fra MEFs (som i trinn 1.3) ved hjelp av CM som inneholdt B-FGF (10 ng / ml).
- Aspirer å fjerne den ekstracellulære matrise fra den nye platen og tilsett CM inneholder B-FGF. Overfør skrapt cellulære klumper fra MEF plate ved hjelp av en pipette og delmengde det i det ekstracellulære matrise-belagt plate. Inkuber i 37 ° C lavt oksygen inkubator over natten.
- Sett på CM med B-FGF medium daglig; mengden av mediet vil avhenge av størrelsen på kulturflaske. Bruk 2 ml medium for en seks-brønns godt. Skrap av differensierte celler med en Pasteur pipette.
- Passage hESCs hver 6-7 dager, når kolonier er lyse sett under mikroskop.
MERK: hESC kolonier dyrket på ekstracellulære matrix-belagte plater vokse seg større enn MEF-dyrkede celler. - Når materen frie celler er klar til passasje, fjerne mediet, vask av annonseding 1 ml PBS ved hjelp av en pipette, aspirere å fjerne PBS, tilsett 0,5 mg / ml dispase (forvarmet til 37 ° C) med en pipette, og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter.
- Vask cellene med PBS ved tilsetning av 2 ml PBS per brønn og aspirering etterpå. Tilsett 1 ml av CM per brønn og manuelt skrape cellene i små klumper ved hjelp av spissen på en 5 ml pipette.
- Plate de suspenderte celleklumper i nye ekstracellulære matrix-belagte plater; cellene bør følge etter 24 timer.
- Fremstilling av ekstracellulær matriks for belegning vevskulturplater
3. Differensiering av hESCs Bruke BMP4 / A / P
- Forbered differensiering medium. Bruk CM (mangler B-FGF) og legge til (frisk) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 mm), og PD173074 (0,1 mm). Legg disse hemmere til CM før bruk.
- Bruk mater fritt hESCs vokser på ekstracellulære matrix-belagte plater for en passering, dyrket inne i en kuvøse satt til 4% oksygen. Etter første passering på ekstracellulære matrix-belagte plater,la cellene feste i 24 timer. Neste dag, initiere differensiering. Ta av CM (som inneholder B-FGF) og erstatte den med CM inneholder BMP4 / A / P (2 ml per brønn i en 6-brønns plate). Fortsett dyrking av celler ved anvendelse av 4% oksygen.
- Erstatte den CM holdige BMP4 / A / P (2 ml / brønn i en 6-brønn plate) hver 2 dager. Aspirer å fjerne den gamle medium og legge til nye CM hjelp av en pipette. På den andre dagen etter å ha lagt BMP4 og fjerne B-FGF (regnes differensiering dag 2), vil cellen morfologi endres, vises større når observert ved hjelp av et mikroskop.
MERK: udifferensierte celler, som viser lyse runde kanter, vil ikke være til stede. - Samle celler ved ønskede tidspunkter. Differensierte celler vil slutte å dele etter rundt to uker. Transfektere celler i løpet av denne tidsperioden (se neste avsnitt).
4. Transfeksjon av trofoblastisk Celler med sirnas eller Plasmid DNA
- Forbered trofoblastiske celler for transfeksjon
- Kultur hESCs for to passeringer på ekstracellulære matrise etter å overføre dem fra MEFs (se trinn 2.2). Bruk hESC medium som inneholder B-FGF.
- Dele hESCs på en ny ekstracellulære matrise plate én dag før differensiering. Høy cellesammenflytning er viktig, så splitte cellene 1: 1 på en ny plate / brønn, noe som vil sikre at minst 50% konfluens den neste dag. Cellene inkuberes over natten i lav-oksygen inkubator.
MERK: hESCs trenger ikke å bli regnet i dette trinnet. - Den neste dagen, erstatte mediet med differensiering medium (CM inneholder BMP4 / A / P og mangler B-FGF, ved hjelp av 2 ml / brønn for en seks-brønns plate). Ta ut det gamle mediet ved aspirasjon og overføre den nye medium (2 ml) ved anvendelse av en pipette. Plassere cellene i et lavt oksygen-inkubator (4% oksygen) over natten.
- Skille cellene til ønsket tidspunkt (mellom dag 1 og 14). Dagen før transfeksjon, trypsineres cellene ved bruk av 0,05% trypsin i 5 min. Plate dem til ønsket konfluens (avhengig av transfeksjon reagens-protokollen) på en gelatin-belagt plate (tilsett 0,1% gelatin til en vevskulturskål i 20 min og aspirere å fjerne). Legg CM inneholder BMP4 / A / P (mangler B-FGF) og inkuberes over natten.
- Neste dag, legger frisk differensiering medium til cellene. Transfektere sirnas bruker en siRNA transfeksjon reagens. For plasmid DNA, bruk en passende lipofektamin reagens.
- Følg produktet protokoll som beskrevet for hver transfeksjon reagens. Overfør siRNA-lipofektamin-komplekser til hver brønn / skål av celler, bland forsiktig, og kulturen cellene over natten i en lav-oksygen inkubator.
MERK: Noen transfeksjon reagenser er hemmet av antibiotika, som krever CM mangler Pen / Strep. - Den neste dagen, erstatte med frisk differensiering media.
- Høste cellene ved ønsketd tidspunkter (for eksempel 24 timer, 48 timer og 72 timer) for å kontrollere genet avbrudd effektivitet ved bruk av kvantitativ RT-PCR. For høsting av celler ved å bruke 0,05% trypsin, tilsetning av 1 ml pr brønn og inkubering i 5 minutter ved 37 ° C. Tilsett 5 ml MEF medium per brønn for å nøytralisere trypsin. Spinne ned cellene ved 200 xg i 5 minutter og bruk cellepelleten for RNA-isolering.
5. Patogen Infeksjon i trofoblastisk Cells: Sendai virusinfeksjon
- Forbered hESCs for differensiering
- Kultur hESCs for to passeringer på ekstracellulære matrise etter overføringen fra MEFs (se trinn 2.2). Bruk hESC medium som inneholder B-FGF.
- Dele hESCs på en ny ekstracellulære matrise plate én dag før differensiering. Høy cellulær confluency er viktige, så dele celler 1: 1 på en ny plate / brønn, noe som vil sikre minst 50% confluency neste dag. Cellene inkuberes over natten i en lav-oksygen inkubator (4% oksygen). <br /> MERK: hESCs trenger ikke å bli regnet i dette trinnet.
- Den neste dagen, erstatte mediet med differensiering medium (CM inneholder BMP4 / A / P og mangler B-FGF) og kultur over natten i en lav-oksygen inkubator (4% oksygen).
- Sendai virusinfeksjon av trophoblastic celler
- En dag før den ønskede differensiering dag, trypsineres de differensierende celler (til enkle celler) ved anvendelse av 0,05% trypsin i 5 minutter og overføre dem til en gelatin-belagt plate. Legg differensiering medium og inkuberes over natten i en lav-oksygen kuvøse.
- Den neste dag, tilsett medium for infeksjon (dette vil variere avhengig av virus). Bruk CM mangler Pen / Strep inneholder BMP4 / A / P, ved hjelp av 0,5 ml for en brønn i en seks-brønns plate. Legg Sendai virus for MOI = 1. Inkuber i 8 timer i en lav-oksygen kuvøse.
- Hvis ytterligere tidspunkter er nødvendig, fjerne viruset holdig medium etter 4 timer, og erstatte den med BMP4 / A / P CM. samle cellerfor RNA isolering ved hjelp av en celle skrape.
- Bestemme effektiviteten av viral infeksjon ved å utføre QRT-PCR for gener involvert i den virale respons 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oversikt over In Vitro Differensiering av hPSCs
Denne in vitro differensiering protokollen begynner med udifferensierte hESCs dyrket på MEFs som er overført til mater-frie forhold for en passasje (figur 1A). Mens vi beskrev differensiering av hESCs i denne protokollen, brukte vi denne protokollen for å kunne differensiere hiPSCs inn trophoblastic celler. Overgangen til ekstracellulær matriks fjerner det meste av de bestrålte MEFs, som er uønsket for analyser som krever rene populasjoner av humane trophoblastic celler. Udifferensierte hPSCs er dyrket på ekstracellulære matrise og dyrket med CM som inneholder B-FGF til koloniene er klare for aging (ca. en uke). Dette opprettholder den pluripotent tilstand før induserende BMP4 / A / P-mediert differensiering. Koloniene blir forstyrret i klumper av ~ 50-100 cellerved hjelp av dispase og passert en andre gang på en ekstracellulær matriks-belagt plate. Dagen etter aging, de adherente cellene er klare til å indusere differensiering, og mediet byttet til å inneholde BMP4 / A / P som mangler B-FGF. De differensierte celler prolifererer i ca. to uker, under hvilket tidsrom cellene kan samles for RNA-isolering eller brukt for transfeksjon eksperimenter. Morfologiske endringer vises 1-2 dager etter differensiering er igangsatt, og resultater fra en representant eksperimentet er vist i figur 1B. Legg merke til at cellene på differensiering dager 1-2 er større i størrelse enn cellene fra dag 0 (figur 1B). Den differensierte celle kolonien vokser raskt, og denne endringen er merkbar hver dag. Som differensiering fortsetter, cellene deler seg og ekspandere ut fra sentrum av kolonien, vokser i en ytre retning (dager 3-5, figur 1B). Den ytre del av kolonien inneholder større celler sammenlignet med than celler i sentrum av kolonien. De forskjellige cellene blir mørkere og flatere enn pluripotente stamceller dyrket på ekstracellulære matrise; endringer i celle lysstyrke er mer tydelig når man ser på cellene med en oppreist mikroskop benyttet for rutinemessig cellekultur. De individuelle kolonier vokse sammen ved differensiering dag 5 (figur 1B), med celler som vokser på toppen av hverandre. Etter differensiering dag 4-5, celler som inneholder flere kjerner er til stede (ikke vist) (figur 1B).
BMP4 / A / P Induserer Differensiering og Expression of trophoblast? Trophoblast Markers
Vi undersøkte genuttrykk endringer i løpet av de tre første dagene av BMP4 / A / P differensiering ved hjelp av kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR). RNA ble isolert ved differensiering dagene 1, 2, og 3 og omdannet til cDNA. Forsvinningen av pluripotente stamceller kan bli vurdert både by morfologi, visuelt ved hjelp av et mikroskop, og ved QRT-PCR, ved anvendelse av primere for pluripotency gener. De relative ekspresjonsnivåer av Nanog, en markør av pluripotente stamceller, reduseres med ~ 75% etter en dag av differensiering når celler dyrkes med BMP4, og nivåene redusert med ~ 90% i nærvær av BMP4 / A / P ( Figur 2). Ved differensiering dag 2, nivåene av Nanog er svært lav for celler dyrket i BMP4 alene eller i BMP4 / A / P forhold til de i hESC CM medium (som inneholder B-FGF). Dette er et forventet resultat, fordi vi ikke observere udifferensierte celler etter to dager med differensiering (figur 1B), som er lysere og mindre i størrelse sammenlignet med differensierte celler. Effektiviteten av BMP4-mediert differensiering til trofoblastisk celler kan være direkte vurderes ved QRT-PCR ved hjelp av primere spesifikke for to trophoblast markører: KRT7 og CDX2. Begge disse genene er ikke uttrykkes i human flerpotent stammenceller, og deres ekspresjon øker etter 2-3 dagers BMP4 behandling (figur 2). Ved hjelp av forholdene beskrevet her, KRT7 transkripsjonsnivåer øker på differensiering dag 1 i BMP4 / A / P medium og forblir konstant de første 3 dagene av differensiering (figur 2). KRT7 uttrykk når du bruker BMP4 alene har en forsinket økning av dag 2, i samsvar med tidligere observasjoner som activin / node hemmere øke differensieringen frekvensen av hESCs 9. En annen måte å vurdere effektiviteten ved bruk av disse inhibitorer er for å bestemme steady-state overflod av CDX2 og KRT7 transkripter i celler behandlet med BMP4 alene. CDX2 nivåene er lik for differensiering dager 1-3 når du bruker enten BMP4 alene eller BMP4 sammen med activin / nodal hemmere. Imidlertid KRT7 transkripter er mer rikelig etter en dag av differensiering i nærvær av disse inhibitorene, noe som antyder en merrask differensiering (figur 2). CDX2 uttrykk vanligvis topper på differensiering dag 2 for begge forholdene og avtar etter dag 3 (figur 2). Udifferensiert hESCs uttrykker ikke enten KRT7 eller CDX2 (figur 2), som forventet. I konklusjonen, BMP4 / A / P forhold raskt skille hESCs, og morkake markør uttrykk kan oppdages så tidlig som differensiering dag 3.
Transfections sirnas og Plasmid DNA og virusinfeksjoner Bruke In Vitro avledede trophoblastic Cells
In vitro avledede humane trofoblastisk celler kan bli transfektert med sirnas å forstyrre genekspresjon av enten koding eller ikke-kodende RNA. Vi innledet differensiering av hESCs bruker BMP4 / A / P, utført to runder med siRNA transfections (med 75 pmol av siRNAs) på differensiering dag 1 og 2,og samles i cellene for RNA-isolering. Kvantitativ RT-PCR er en effektiv metode for å bestemme knockdown effektivitet for enten koding eller ikke-kodende gener. Ved hjelp av to sirnas komplementære til forskjellige regioner av den lange, ikke-kodende RNA lncRHOXF1 19, fikk vi 80% knockdown av lncRHOXF1 transkripsjoner (figur 3A). Deretter transfiserte vi en siRNA (25 pmol) av den proteinkodende gen hnRNP U, også på differensiering dagene 1 og 2. Det ble observert en 80% reduksjon i hnRNP U transkripter følgende to påfølgende transfeksjoner. In vitro differensiert trophoblast stamceller kan også brukes til å undersøke medfødte immunresponser. Vi utførte infeksjoner av differensiering dag 2 celler ved anvendelse av Sendai-virus ved en MOI på 1 og oppsamles cellene etter 8 timers inkubasjon av viral. Bruke QRT-PCR, vi har oppdaget rikelig viral protein transkripsjoner (Sev-NP) i infiserte celler (Figur 3B), som tyder på aktiv viral proForplantningen i trophoblastic celler. Viktigere, infiserte celler (ved hjelp MOI = 1) ikke endres i utseende og er levedyktige (data ikke vist). In vitro avledet trofoblastisk celler kan også bli transfektert med plasmid-DNA. Vi utførte transfections ved hjelp av en GFP plasmid og introduserte denne bygge inn BMP4 / A / P-behandlede celler på differensiering dag 1 og dag 3 og avbildes for GFP påfølgende dag (figur 4). Vi vanligvis oppnås 30-50% transfeksjon effektivitet på 24 timer etter transfeksjon. Som konklusjon, in vitro avledede trofoblastisk celler kan utnyttes for gevinst-og tap-av-funksjon eksperimenter.
Figur 1: In vitro differensiering av menneskelige pluripotent stamceller til tidlig trofoblastisk celler ved hjelp BMP4 / A / P. (A) Skjematisk av BMP4 differensiering av hPSCs til trofoblastisk celler ved hjelp BMP4 / A / P. (B) Representative lyse-feltet bilder av HUES9 celler under d0, d2 og d6 av BMP4 / A / P differensiering. Scale bar = 50 mikrometer. Pilene angir encellede hESCs som ikke er differensiert. Pilene markere morfologiske egenskaper under differensiering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: BMP4 / A / P differensiering nedregulerer raskt pluripotency markør Nanog og oppregulerer trophoblast gener CDX2 og KRT7. QRT-PCR-analyse for Nanog (pluripotency markør), CDX2, og KRT7 (trophoblast markører). Verdiene er gjennomsnitt fra tredoble tiltak. //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Gene avbrudd og virusinfeksjon bruker in vitro differensiert menneskelige trophoblastic celler. (A) QRT-PCR-analyse av hESCs (HUES9) differensiert og deretter transfektert med sirnas spesifikke for den lange, ikke-kodende RNA lncRHOXF1 (venstre) eller protein-kodende gen hnRNP U (til høyre) i to påfølgende dager. Knockdown effektivitet (KD) er vanligvis 70-80%, og resultatene fra en transfeksjon eksperimentet er vist. (B) QRT-PCR analyse av Sendai viral protein transkripsjon av differensiering dag 2 trofoblastisk celler infisert med Sendai virus (MOI = 1) i 8 timer. Feilstolpene betegne SEM."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Innføring av plasmid DNA inn i in vitro differensierte humane celler trophoblastic. Transfeksjon av GFP plasmid DNA i differensiering dag 1 og dag 3 trophectoderm stamceller, visualisert den påfølgende dagen. Scale bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterte de grunnleggende trinnene for å differensiere hESCs inn trophoblast stamfedre. Denne protokollen har nylig blitt optimalisert for å raskt skille hESCs med tillegg av aktivin / knutepunktet signale inhibitorer, øke differensieringen til trofoblastisk celler og å unngå generering av mesoderm stamceller, som typisk observeres med BMP4 behandling alene. Den BMP4 modellsystem åpner for undersøkelse av de tidligste stadiene av menneskelig trophoblast avstamning spesifikasjon og ekspansjon. I tillegg er denne BMP4 modellsystemet også nyttige for undersøkelse av differensiering av trofoblastisk celler til spesifikke underslektsnavn, som ikke er mulig ved hjelp av choriocarcinoma-cellelinjer og extravillous trophoblast cellelinjer. In vitro avledet trofoblastisk celler kan også brukes til tap-av-funksjon forsøk ved anvendelse sirnas 19. I tillegg kan hESCs eller hiPSCs modifiseres genetisk for den induserbare ekspresjon av transgen es 19 eller for innføring av rapportørgener ved endogene loci 20, og disse cellene kan bli differensiert i trofoblastisk celler ved bruk av betingelsene beskrevet her.
Kritiske trinn i protokollen
Det er viktig å utelate B-FGF (FGF2) fra CM differensiering medium for å få trofoblastisk stamceller fra hESCs. Tilstedeværelsen av b-FGF sammen med BMP4 i kulturmediet øker ekspresjonen av mesoderm og endoderm forløpere 16. Inkludering av B-FGF i trophoblast differensiering medium antas å forklare hvorfor en fersk studie fant at BMP4-mediert differensiering genererer mesoderm og endoderm celler i stedet for trophoblasts 21. Det er godt etablert at B-FGF sammen med activin A og BMP4 fremmer endoderm og mesoderm differensiering på en doseavhengig måte 22,s = "xref"> 23. I mus, utvikling av epiblast, trophectoderm, og primitive endoderm linjer er avhengig av FGF-24 signalveier. I differensierende hESCs, er b-FGF-induserte signalering som er nødvendig for mesoderm dannelse når BMP4 blir brukt til å indusere differensiering 21, 25. I motsetning til inhibering av både FGF og aktivin / nodale signalveier, sammen med BMP4, favoriserer SYN dannelse i hESC-avledet trophoblast progenitorceller og hindrer dannelse av mesoderm og primitive stamceller endoderm 26.
Begrensninger av teknikken
Den mest typiske problemet med denne protokollen hPSC differensiering til trophoblast stamfedre er forbundet med å starte med en overveiende udifferensiert befolkning på hESCs eller hiPSCs på MEFs. Fordi hPSCs akkumulere differensierte celler på begge de indre og ytre kanterav koloniene, er det viktig å overvåke mengden av differensiering daglig, og for å fjerne differensierte kolonier (eller deler av kolonier). Tilstedeværelsen av differensierte celler kan komplisere differensieringsprosessen, spesielt når cellene blir overført til den ekstracellulære matriks. De differensierte celler raskt vil spre seg på den ekstracellulære matriks i nærvær av CM, og disse cellene vil raskt ta over kulturen og utkonkurrere de hPSCs. Derfor er det ideelt å begynne med sunn, udifferensierte kolonier av hPSCs dyrket på MEFs før de overføres cellene til den ekstracellulære matrise.
Betydningen av Technique For eksisterende / alternative metoder
Ved bruk av denne differensiering protokollen, den resulterende trophoblast stamceller er en heterogen blanding av celletyper. Trophoblasts består av villous cytotrophoblasts, syncytiotrophoblasts (Syns) og extravillous cytotrophoblasts(EVTs) 27. Villous cytotrophoblasts er forfedrene som genererer EVTs og Syns. BMP4 differensiert hPSCs vil generere en blanding av villous cytotrophoblasts, Syns og EVTs 9, 15, som har blitt definert av genet eller proteinet ekspresjon av placental-spesifikke markører. Den distinkte differensiering trasé kan være preget av utskillelsen av HLA-G (karakteristisk for EVTs) eller humant choriongonadotropin (fra Syns) 28, 29. Nylig er det blitt vist at inhibering av aktivin / knutepunktet signale favoriserer EVT differensiering fra hESCs, og fjerningen av denne hemming favoriserer differensiering til SYN 17. Faktisk, en tidligere publikasjon funnet at bruk BMP4 alene for å skille hESCs genererer mest SYN celler 26. Dataene som bruker BMP4 / A / P og kondisjonert medium (mangler B-FGF) tyder på at deter både EVT og SYN celler tilstede ved differensiering dag 5. Dersom en ren EVT eller SYN populasjoner er ønskelig med ytterligere rensing ved hjelp av celleoverflatemarkører, for eksempel HLA-G konjugert til perler for isolering av EVTs, er mulig 29. Konklusjonen er at den dyrkningsmetode som er beskrevet her er en effektiv måte å generere betydelige mengder trofoblastisk celler fra hPSCs som kan brukes for en rekke anvendelser. Fordi denne protokollen genererer både Syns og EVTs, er det et passende modellsystem for å undersøke den tidlige human placenta. Disse cellene kan brukes til en rekke applikasjoner, inkludert medisiner og genteknologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 µm syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
References
- Rugg-Gunn, P. J.
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
- Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
- Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
- Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
- Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
- Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
- Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
- Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
- Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
- Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
- Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
- Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be? Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
- Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
- Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
- Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082 (2009).
- Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
- Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
- Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
- Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
- Cole, L. A.
- Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
