Um sistema de cultura 3D baseado em Inserir Filtro Rápido para próstata primário Diferenciação Celular

Resumo

Aqui, apresentamos um método para o estabelecimento de um sistema in vitro rápido que suporta a cultura tridimensional e subsequente diferenciação luminal de células epiteliais primárias da próstata.

Resumo

células condicionalmente reprogramadas (CRCs) fornecer um método sustentável para a cultura de células primária e a capacidade de desenvolver extensas "biobancos viva" do paciente derivadas linhas celulares. Para muitos tipos de células epiteliais, várias abordagens de cultura tridimensionais (3D) foram descritos que suporta um estado diferenciado melhorada. Enquanto CRCs mantêm a sua linhagem compromisso para o tecido a partir do qual eles são isolados, eles não conseguem expressar muitos dos marcadores de diferenciação associados com o tecido de origem, quando cultivada sob duas condições de cultura dimensional (2D) normais. Para melhorar a aplicação dos CRCs derivadas de pacientes para pesquisa do câncer de próstata, um formato de cultura 3D foi definido que permite uma diferenciação celular rápida (2 semanas total) luminal em ambas as células epiteliais da próstata normais e derivadas de tumores. Nisto, um formato baseado no elemento filtrante é descrito para a cultura e a diferenciação dos dois CRCs normais e malignas da próstata. Um deA inscrição cauda dos procedimentos necessários para a coleta de células e processamento de coloração imuno-histoquímica e imunofluorescência são fornecidos. Colectivamente o formato de cultura 3D descrito, combinados com as linhas CRC primárias, proporciona um médio importante destacar sistema modelo baseado em serviços para a pesquisa de próstata baseada biospecimen.

Introdução

A identificação e uso de terapias contra o câncer, que são personalizadas para os indivíduos são um objetivo principal na pesquisa do câncer. Recentemente, novas abordagens têm sido desenvolvidos para permitir uma maior facilidade no estabelecimento de culturas de células primárias, potencialmente proporcionando tanto meios de identificar e testar terapias personalizadas. Por exemplo, o da próstata com base em R-espondina abordagem organ�de ¹ permite tridimensional de cultura (3D) de células normais e metastáticas de cancro da próstata em uma matriz extracelular comercial (por exemplo, Matrigel), enquanto que o método da condicional....

Protocolo

1. Criação do celular 3D Cultura Inserir Sistema

1. Coloque inserções de cultura de células 2 de policarbonato com uma orientação invertida (lado do filtro para cima) para baixo em uma placa de 6 poços (Figura 1A).
2. Aplicar uma camada fina de 0,1% de gelatina em água, para o lado inferior da peça inserta e deixar secar (10-20 min) numa câmara de segurança biológica para manter a esterilidade.
3. Repetir o passo 1.2 mais duas vezes para um total de 3 aplicações de 0,1% de gelatina sobre os insertos.
   NOTA: O revestimento de gelatina vai ajudar a difusão limite entre as câmaras.
4. Para recolher os CRCs primários de....

Resultados

O sistema de inserção de cultura de células com base é um procedimento relativamente simples e rápido para a produção de culturas em 3D de CRCs próstata que apoia a diferenciação celular luminal. Um diagrama esquemático do sistema é mostrado (Figura 1A) destacando a aplicação do revestimento de gelatina, para a superfície do fundo do elemento filtrante. As inserções são apenas virado para a aplicação da gelatina. Na Figura 1B, os filtros são na orientaçã.......

Discussão

linhas de células primárias são uma plataforma importante e em rápido desenvolvimento para a investigação do cancro. O sistema de cultura 3D baseado em inserção de cultura apoia a diferenciação da CRCs próstata primários dentro de um prazo de duas semanas. O método do filtro CRC representa, um método de transferência novo meio para a investigação de próstata. Modelos existentes rato PDX são demorados e extremamente caro, e muitas das amostras PDX não podem ser cultivadas em cultura, o que limita a experimentação iniciad.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Inserções de Cultura Corning Costar Snapwell Inserções de Cultura de	Corning	3801
Millicell	Millipore	PIHP01250
Multiwell 6 Poços	Falcon	353046
Gelatina 0.1% em água	Stemcell Technologies	7903
Esterilize Saftey Scapel 10 Blade	Integra Miltex	4-510
Bisturi Padrão Estéril 11 Lâminas	Integra Miltex	4411
RIPA Lise e Tampão de Extração	Thermofisher Scientific	89900
Fluoreto de Sódio	Fishcer	Scientific S299-100
Vanadato de Sódio	Fishcer Scientific	13721-39-6
Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	3483123
Coquetel Inibidor de Protease (AEBSF, Aprotinina, Bestatina, E-64, Leupeptina e Pepstatina A)	Sigma-Aldrich	P8340
0.25% Tripsina-EDTA (1x)	Thermofisher Scientific	25200-056
DMEM	Thermofisher Scientific	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamina	Thermofisher Scientific	25030081& nbsp;
Penicilina Estreptomicina	Thermofisher Scientific	15140-122
F-12 Meio de mistura de nutrientes	Thermofisher Scientific	11765054
Y-27632 dicloridrato Inibidor de rocha	Enzo	ALX-270-333-M025
Hidrocortisona	Sigma-Aldrich	H0888
EGF	Thermofisher Scientific	PHG0315
Insulina	Thermofisher Scientific	12585-014
Toxina da cólera	Sigma-Aldrich	C3012
Gentamicina	Thermofisher Scientific	15710-064
Fungizone	Fisher Scientific	BP264550
Trizol Reagente	Invitrogen	15596026
Histogel Gel de Processamento de Espécimes ( hidroxietilagarose (HEA))	Thermo Scientific	HG-4000-012
Curativo não aderente	Telfa	KDL2132Z
de cultura de células	Sigma	SIAL0167
HISTOSETTE II Processamento de tecidos / de incorporação	Crystalgen	CG-M492