Um sistema de cultura 3D baseado em Inserir Filtro Rápido para próstata primário Diferenciação Celular

A identificação e uso de terapias contra o câncer, que são personalizadas para os indivíduos são um objetivo principal na pesquisa do câncer. Recentemente, novas abordagens têm sido desenvolvidos para permitir uma maior facilidade no estabelecimento de culturas de células primárias, potencialmente proporcionando tanto meios de identificar e testar terapias personalizadas. Por exemplo, o da próstata com base em R-espondina abordagem organ�de ¹ permite tridimensional de cultura (3D) de células normais e metastáticas de cancro da próstata em uma matriz extracelular comercial (por exemplo, Matrigel), enquanto que o método da condicionalmente reprogramação das células (CRC) desenvolvido em Georgetown ^{2, 3} utiliza mais condições de cultura 2D padrão. Especificamente, a combinação de um inibidor da Rho cinase (Y-27632) e células alimentadoras de fibroblastos murinos J2 irradiadas conduzir à cultura indefinido de CRCs queratinócitos ^2. A metodologia é CRCextremamente robusta, com linhas de células primárias estabelecidas e mantidas indefinidamente a partir da próstata e muitos outros tecidos epiteliais normais e malignas ³ com sucesso. Importante, a nossa tecnologia de CRC permitido para a rápida identificação da base etiológica de papilomatose respiratória recorrente num doente que não tinha um número de tratamentos com drogas anteriores. Além disso, utilizando os CRCs normais e derivadas de tumores, a identificação bem sucedida de um fármaco aprovado pela FDA, vorinostat, foi feita no prazo de duas semanas de biópsia de tecido inicial. O paciente foi colocado na vorinostat, resultando no sucesso do tratamento da doença ^4.

A próstata normal é composta de luminal, basal e as raras células neuroendócrinas ^5. As células luminais formar a camada epitelial colunar da glândula e expressar o receptor de androgénio (AR), bem como outros marcadores tais como citoqueratinas luminais 8 e 18 e próantígeno específico de estado (PSA) ^6. Por outro lado, as células basais está localizada por baixo da camada luminal e expressa citoqueratinas 5 e p63, mas níveis baixos de AR ^5. Nós ^{7, 8, 9} e outros ¹⁰ têm usado com sucesso CRCs próstata em investigações sensibilidade a drogas mecanicistas pré-clínicos. No entanto, quando cultivada sob condições padrão de cultura de tecidos 2D, estas células não totalmente engatam AR sinalização ^10. Importantemente, quando colocada sob a cápsula renal de ratos imunodeficientes, o CRCs recuperou próstata arquitectura glandular normal e função, indicando que CRCs próstata conservam a sua linhagem compromisso quando colocado num ambiente permissivo. O desenvolvimento do sistema de cultura de células à base de inserção do filtro aqui descrito permite a rápida (2 semanas) a diferenciação in vitro de CRCs próstata como evidenciado by o aumento da expressão dos genes alvo de Ar e Ar, bem como uma diminuição dos níveis de p63.

Os elementos filtrantes utilizados contêm membranas de policarbonato (tamanho de poro, 0,4 uM) que podem suportar a cultura de células de mamíferos. O sistema, tal como desenvolvido, faz uso de CRCs próstata normais e malignas, 6 bem pratos de cultura e as inserções de filtro. Meios de cultura celular condicionado por células J2 ¹¹ é colocado na mídia de câmara e de próstata diferenciação de fundo na câmara superior. As técnicas descritas aqui apoiar diferenciação celular luminal de próstata dentro de um prazo duas semanas, de acordo com os objetivos da medicina personalizada. Foi também imperativo desenvolver as metodologias que permitem a caracterização molecular, genética e celular abrangente das culturas. Abordagens para isolamento de ADN, ARN e proteína de células libertadas a partir da superfície do filtro foram desenvolvidos e simplificado para o processamento de amostras de repetição exacta. Finally, a metodologia necessária para remover o filtro para permitir a incorporação, de corte e para a H & E, imuno-histoquímica e coloração de imunofluorescência, é totalmente descrito.

1. Criação do celular 3D Cultura Inserir Sistema

1. Coloque inserções de cultura de células 2 de policarbonato com uma orientação invertida (lado do filtro para cima) para baixo em uma placa de 6 poços (Figura 1A).
2. Aplicar uma camada fina de 0,1% de gelatina em água, para o lado inferior da peça inserta e deixar secar (10-20 min) numa câmara de segurança biológica para manter a esterilidade.
3. Repetir o passo 1.2 mais duas vezes para um total de 3 aplicações de 0,1% de gelatina sobre os insertos.
   NOTA: O revestimento de gelatina vai ajudar a difusão limite entre as câmaras.
4. Para recolher os CRCs primários de condições de cultura padrão, adicionar 5 mL de PBS para lavar o frasco de cultura.
   1. Tripsinizar as células utilizando (1 mL para um T-25 e 2 ml de uma T-75) 0,25% de tripsina-EDTA durante 5 minutos a 37 ° C. Bater levemente a parede lateral do balão para ajudar a desalojar as células. Em seguida, proceder para parar a reacção de tripsina e recolher as células por adição de 5 mL de DMEM completo.
   2. coletar as células num tubo de 15 mL. Centrifuga-se o tubo a 4 ° C e 188 xg e contagem usando um contador de células automatizado ou um hemocitómetro.
   3. Re-suspender 600.000 CRCs em 250 mL de mídia (CM) condicionado e adicionar ao orientada corretamente (lado do filtro para baixo) inserção de cultura (Figura 1B). Isto é referido como a câmara interna.
      Nota: CM é F-meios condicionados por células J2 irradiados e contém 10 um Y-27632, como descrito anteriormente ^{7, 8, 9, 11.}
5. Aplicar 2 mL de CM para a câmara exterior da placa de 6 poços e incuba-se a 37 ° C durante a noite (durante pelo menos 18 h).
6. Cuidadosamente remover a CM na câmara interior com uma pipeta de 1 mL ou 200 mL e adiciona-se lentamente meios de diferenciação (DM) para a câmara interior com uma pipeta de 1 mL até completa. Tenha cuidado para não perturbar a camada de células.

1. Verifique as culturas a cada dia. As células saudáveis aparecer como mostrado na Figura 2.
2. Mudar o CM na câmara exterior todos os dias ou cada dois dias, dependendo do metabolismo das células.
3. Quando a mídia da cor mudanças câmara interna (amarelo), retire cuidadosamente a mídia na câmara de filtro interno com um 1 mL ou 200 mL pipeta.
4. Aspirar a mídia na câmara de placa de 6 exterior com uma ponta de aspiração.
5. Usando uma pipeta de 1 mL, aplicam-se lentamente DM fresco para a câmara interna até integral. Tenha cuidado para não raspar ou não desalojar a camada de células.
6. Substitua o material na câmara exterior com 2 mL de CM fresco.
7. Manter as culturas durante 2 semanas, e então proceder ao processamento para o isolamento bimolecular desejado.
   NOTA: Cada linha na placa de 6 poços, num total de seis inserções (Figura 1B), deve ser processado por experiência para adquirir células suficientes para DNUm, ARN ou proteína para análise.
8. Aspirar meios na câmara exterior e lavar com 2 ml de tampão fosfato salino (PBS).
9. Retire cuidadosamente a mídia da câmara interna com um 1 mL ou 200 mL pipeta e adicionar 500 mL PBS. Evitar ou de outro modo raspando perturbar as células sobre a membrana.
10. Aspirar PBS a partir da câmara exterior e cuidadosamente remover PBS a partir da câmara interior com um 1 ml ou 200 ul pipeta. Uma vez que o PBS foi removido, prossiga diretamente para o aplicativo apropriado detalhado abaixo. Não permitir que a membrana a secar. A cultura pode ser mantido brevemente na PBS até que o aplicativo está pronto para começar.

3. Processamento dos Filtros para Pellet Banking

1. Adicionar 100 mL de 0,25% de tripsina-EDTA a cada câmara interior e incubar durante 5 min a 37 ° C.
2. Resumidamente e agitar cuidadosamente / raspar as células sobre a superfície da membrana com uma pipeta 200 uL enquanto pipetando para cima e para baixo (evitar punctruturação a membrana). Incubar durante 1 min a 37 ° C.
3. Adicionar 250 ul de CM para a primeira câmara interior e pipetar para cima e para baixo para lavar suavemente o filtro.
4. Transferência de células ressuspensas para a câmara de filtro adjacente que contém as mesmas condições de meios e repetir pipetando para cima e para baixo.
5. Repetir este procedimento para cada uma das inserções de um único estado. Recolha e transferir as células para um tubo de centrífuga de 1,5 ml.
6. Lavar cada câmara interna com um adicional de 100-200 mL de CM para coletar as células restantes. Adicionar ao tubo de centrífuga de 1,5 mL no passo 3.5.
7. Rodar as células a 423 xg numa microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min.
8. Aspirar o sobrenadante e lava-se a pelete celular uma vez com 1000 mL de PBS.
9. Girar novamente a 423 xg numa microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min.
10. Aspirar PBS e congelamento a -80 ° C para uso posterior.

4. Processamento dos Filtros de RNA ou DNA Isolation

O sistema de inserção de cultura de células com base é um procedimento relativamente simples e rápido para a produção de culturas em 3D de CRCs próstata que apoia a diferenciação celular luminal. Um diagrama esquemático do sistema é mostrado (Figura 1A) destacando a aplicação do revestimento de gelatina, para a superfície do fundo do elemento filtrante. As inserções são apenas virado para a aplicação da gelatina. Na Figura 1B, os filtros são na orientação adequada para cultura. Usando uma pastilha de célula transparente, uma imagem representativa de uma cultura saudável CRC próstata 3D é mostrado (10X) (Figura 2). As camadas densa de CRCs saudáveis ​​demonstrou é típico após o estabelecimento e pode ser visualizada utilizando microscopia de luz padrão. Durante o estabelecimento inicial, é crítico para visualizar a camada de células formadas a assegurar que o método é compatível com uma dada linha de células e que a ligação adequada e LaYering de células ter ocorrido.

HEA é aplicada ao interior do inserto como descrito acima. Após a aplicação do HEA, cuidados devem ser tomados quando marcou o filtro para removê-lo do (3A Figuras, 3B) de inserção. Em todas as etapas (Figuras 3A-3D), o cuidado também deve ser exercido para minimizar a movimentação desnecessária da camada de HEA no filtro com células. A camada de CRC pode ser facilmente rompido ou danificado durante a transferência para a H & E cassete (Figura 3D). Após a excisão do filtro de HEA-revestido do barril de plástico (Figuras 3A-3C), o filtro pode ser reduzida para metade e processados para seccionamento e coloração utilizando cassetes de embebimento padrão (Figura 3D). Dividindo o filtro ao meio é importante para maximizar a superfície disponível para seccionamento transversal em H & E e IF.

coloração de imunofluorescênciabem como de campo claro (BF) imagens das células cultivadas na camada de filtro foram coletados por meio de um microscópio com disco rotativo DSU (Disk Unidade Scan) capacidades confocal. Os resultados representativos para histologia e coloração com H @ E são mostrados numa secção transversal da pastilha de filtro e as células (20X) (Figura 4). Com os devidos cuidados, demonstramos que uma camada de CRC nas inserções de filtro pode ser seccionado e corado, como é prática padrão para a histologia do tecido. Durante o corte, é possível para o CRCs a desprender-se do filtro como uma camada intacta de células como demonstrado (Figura 4). A imagem mostra BF estratos de células multi-camadas na parte superior da membrana porosa (Figura 5A). As imagens fluorescentes individuais para núcleos (DAPI, Figura 5B), p63 (Figura 5C) e AR (Figura 5D) são mostrados, como é a fusão de todos os três marcadores de fluorescência (Figura 5E). Finalmente, um composite BF e se a sobreposição é mostrado (Figura 5F), que estabelece a localização do sinal de fluorescência em relação às células e o filtro. A sobreposição da mancha DAPI com a p63 se a coloração demonstra claramente algumas células ainda em estado proliferativa. A localização de AR se a coloração no núcleo é indicativo de reactivação funcional de AR nas células da próstata.

Uma comparação entre o IF de nosso sistema de inserção de um filtro e o tecido da próstata é mostrado em corte (Figuras 6A, 6B) para demonstrar a similaridade do desenvolvimento da nossa camada de CRC inserção para que o epitélio da próstata. A conduta de próstata mostra a expressão de p63, de acordo com as células basais da próstata. coloração p63 também é visto nas CRCs sobre a inserção. Uma percentagem mais elevada de p63 expressando células foi observada no nosso inserção em comparação com a secção de tecido intacto. Além disso, tanto nuclear e citoplasmática AR são vistos no tis próstata processar e secção enquanto as CRCs sobre o elemento filtrante mostram a expressão global menos AR, tanto a expressão de AR nuclear e coloração citoplasmática é vista, semelhante à da próstata intacta.

Figura 1: Imagens representativas da placa de cultura de 6 poços e Insert que compõem o Sistema de Cultura de 3D. (A) inserções invertido para a aplicação do revestimento de gelatina para o lado de baixo do filtro (seta). Uma imagem maior da inserção e do filtro é show (no detalhe). (B) inserções devidamente colocado. As câmaras interiores e exteriores do sistema estão apresentados (setas). A linha de caixas em B mostra como amostras de múltiplos são obtidos para uma determinada condição experimental. Na conclusão do período de crescimento duas semanas essas inserções podem ser combinadas para produzir material suficiente para análise."Target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: uma imagem representativa de uma camada de saudável CRCs semeadas sobre uma membrana de filtro é mostrada transparente. Ambas as câmaras internas e externas contidas meios condicionados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: uma imagem representativa de um filtro Halved em duas seções e colocado em uma cassete de parafina para a incorporação. (A) Filtro de inserção com revestimento HEA depois de marcar e antes da remoção. (B) O elemento filtrante libertado do tambor de policarbonato. ( (D) A colocação apropriada e a orientação das duas metades no interior da cassete de incorporação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: A Seção manchado Cruz Representante H & E do elemento filtrante e células (20X). Tanto a membrana (fundo) e a camada de células (de cima) são mostrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Uma Série de Representante Campo brilhante (BF) e de imunofluorescência (IF) Imagens deCélulas seccionada do filtro (40X). seções transversais do filtro e as células são mostrados. Uma imagem BF não coradas das células na superfície do filtro (5A) é acompanhada por imagens para o núcleo corado DAPI (5B) e coloração de imunofluorescência para duas proteínas diferentes, p63 (5C) e o receptor de androgénio (AR, 5D). Um composto de sobreposição das secções de células (5E, F) define a localização dos sinais IF no contexto de células e o filtro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Um representante de imunofluorescência (IF) de imagens de células seccionados sobre o filtro contra uma secção da próstata Epitélio a partir de tecido (20X).Uma imagem em corte transversal do nosso dispositivo de filtração é mostrado (Figura 6A), em comparação com as camadas epiteliais do ducto de uma próstata intacta (Figura 6B). A coloração de p63, o AR e o núcleo foi realizada como na Figura 5. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.