Um sistema de cultura 3D baseado em Inserir Filtro Rápido para próstata primário Diferenciação Celular

Resumo

Aqui, apresentamos um método para o estabelecimento de um sistema in vitro rápido que suporta a cultura tridimensional e subsequente diferenciação luminal de células epiteliais primárias da próstata.

Resumo

células condicionalmente reprogramadas (CRCs) fornecer um método sustentável para a cultura de células primária e a capacidade de desenvolver extensas "biobancos viva" do paciente derivadas linhas celulares. Para muitos tipos de células epiteliais, várias abordagens de cultura tridimensionais (3D) foram descritos que suporta um estado diferenciado melhorada. Enquanto CRCs mantêm a sua linhagem compromisso para o tecido a partir do qual eles são isolados, eles não conseguem expressar muitos dos marcadores de diferenciação associados com o tecido de origem, quando cultivada sob duas condições de cultura dimensional (2D) normais. Para melhorar a aplicação dos CRCs derivadas de pacientes para pesquisa do câncer de próstata, um formato de cultura 3D foi definido que permite uma diferenciação celular rápida (2 semanas total) luminal em ambas as células epiteliais da próstata normais e derivadas de tumores. Nisto, um formato baseado no elemento filtrante é descrito para a cultura e a diferenciação dos dois CRCs normais e malignas da próstata. Um deA inscrição cauda dos procedimentos necessários para a coleta de células e processamento de coloração imuno-histoquímica e imunofluorescência são fornecidos. Colectivamente o formato de cultura 3D descrito, combinados com as linhas CRC primárias, proporciona um médio importante destacar sistema modelo baseado em serviços para a pesquisa de próstata baseada biospecimen.

Introdução

A identificação e uso de terapias contra o câncer, que são personalizadas para os indivíduos são um objetivo principal na pesquisa do câncer. Recentemente, novas abordagens têm sido desenvolvidos para permitir uma maior facilidade no estabelecimento de culturas de células primárias, potencialmente proporcionando tanto meios de identificar e testar terapias personalizadas. Por exemplo, o da próstata com base em R-espondina abordagem organ�de ¹ permite tridimensional de cultura (3D) de células normais e metastáticas de cancro da próstata em uma matriz extracelular comercial (por exemplo, Matrigel), enquanto que o método da condicionalmente reprogramação das células (CRC) desenvolvido em Georgetown ^{2, 3} utiliza mais condições de cultura 2D padrão. Especificamente, a combinação de um inibidor da Rho cinase (Y-27632) e células alimentadoras de fibroblastos murinos J2 irradiadas conduzir à cultura indefinido de CRCs queratinócitos ^2. A metodologia é CRCextremamente robusta, com linhas de células primárias estabelecidas e mantidas indefinidamente a partir da próstata e muitos outros tecidos epiteliais normais e malignas ³ com sucesso. Importante, a nossa tecnologia de CRC permitido para a rápida identificação da base etiológica de papilomatose respiratória recorrente num doente que não tinha um número de tratamentos com drogas anteriores. Além disso, utilizando os CRCs normais e derivadas de tumores, a identificação bem sucedida de um fármaco aprovado pela FDA, vorinostat, foi feita no prazo de duas semanas de biópsia de tecido inicial. O paciente foi colocado na vorinostat, resultando no sucesso do tratamento da doença ^4.

A próstata normal é composta de luminal, basal e as raras células neuroendócrinas ^5. As células luminais formar a camada epitelial colunar da glândula e expressar o receptor de androgénio (AR), bem como outros marcadores tais como citoqueratinas luminais 8 e 18 e próantígeno específico de estado (PSA) ^6. Por outro lado, as células basais está localizada por baixo da camada luminal e expressa citoqueratinas 5 e p63, mas níveis baixos de AR ^5. Nós ^{7, 8, 9} e outros ¹⁰ têm usado com sucesso CRCs próstata em investigações sensibilidade a drogas mecanicistas pré-clínicos. No entanto, quando cultivada sob condições padrão de cultura de tecidos 2D, estas células não totalmente engatam AR sinalização ^10. Importantemente, quando colocada sob a cápsula renal de ratos imunodeficientes, o CRCs recuperou próstata arquitectura glandular normal e função, indicando que CRCs próstata conservam a sua linhagem compromisso quando colocado num ambiente permissivo. O desenvolvimento do sistema de cultura de células à base de inserção do filtro aqui descrito permite a rápida (2 semanas) a diferenciação in vitro de CRCs próstata como evidenciado by o aumento da expressão dos genes alvo de Ar e Ar, bem como uma diminuição dos níveis de p63.

Os elementos filtrantes utilizados contêm membranas de policarbonato (tamanho de poro, 0,4 uM) que podem suportar a cultura de células de mamíferos. O sistema, tal como desenvolvido, faz uso de CRCs próstata normais e malignas, 6 bem pratos de cultura e as inserções de filtro. Meios de cultura celular condicionado por células J2 ¹¹ é colocado na mídia de câmara e de próstata diferenciação de fundo na câmara superior. As técnicas descritas aqui apoiar diferenciação celular luminal de próstata dentro de um prazo duas semanas, de acordo com os objetivos da medicina personalizada. Foi também imperativo desenvolver as metodologias que permitem a caracterização molecular, genética e celular abrangente das culturas. Abordagens para isolamento de ADN, ARN e proteína de células libertadas a partir da superfície do filtro foram desenvolvidos e simplificado para o processamento de amostras de repetição exacta. Finally, a metodologia necessária para remover o filtro para permitir a incorporação, de corte e para a H & E, imuno-histoquímica e coloração de imunofluorescência, é totalmente descrito.

Protocolo

1. Criação do celular 3D Cultura Inserir Sistema

1. Coloque inserções de cultura de células 2 de policarbonato com uma orientação invertida (lado do filtro para cima) para baixo em uma placa de 6 poços (Figura 1A).
2. Aplicar uma camada fina de 0,1% de gelatina em água, para o lado inferior da peça inserta e deixar secar (10-20 min) numa câmara de segurança biológica para manter a esterilidade.
3. Repetir o passo 1.2 mais duas vezes para um total de 3 aplicações de 0,1% de gelatina sobre os insertos.
   NOTA: O revestimento de gelatina vai ajudar a difusão limite entre as câmaras.
4. Para recolher os CRCs primários de condições de cultura padrão, adicionar 5 mL de PBS para lavar o frasco de cultura.
   1. Tripsinizar as células utilizando (1 mL para um T-25 e 2 ml de uma T-75) 0,25% de tripsina-EDTA durante 5 minutos a 37 ° C. Bater levemente a parede lateral do balão para ajudar a desalojar as células. Em seguida, proceder para parar a reacção de tripsina e recolher as células por adição de 5 mL de DMEM completo.
   2. coletar as células num tubo de 15 mL. Centrifuga-se o tubo a 4 ° C e 188 xg e contagem usando um contador de células automatizado ou um hemocitómetro.
   3. Re-suspender 600.000 CRCs em 250 mL de mídia (CM) condicionado e adicionar ao orientada corretamente (lado do filtro para baixo) inserção de cultura (Figura 1B). Isto é referido como a câmara interna.
      Nota: CM é F-meios condicionados por células J2 irradiados e contém 10 um Y-27632, como descrito anteriormente ^{7, 8, 9, 11.}
5. Aplicar 2 mL de CM para a câmara exterior da placa de 6 poços e incuba-se a 37 ° C durante a noite (durante pelo menos 18 h).
6. Cuidadosamente remover a CM na câmara interior com uma pipeta de 1 mL ou 200 mL e adiciona-se lentamente meios de diferenciação (DM) para a câmara interior com uma pipeta de 1 mL até completa. Tenha cuidado para não perturbar a camada de células.

le "> 2. Manutenção de Culturas em 3D

1. Verifique as culturas a cada dia. As células saudáveis aparecer como mostrado na Figura 2.
2. Mudar o CM na câmara exterior todos os dias ou cada dois dias, dependendo do metabolismo das células.
3. Quando a mídia da cor mudanças câmara interna (amarelo), retire cuidadosamente a mídia na câmara de filtro interno com um 1 mL ou 200 mL pipeta.
4. Aspirar a mídia na câmara de placa de 6 exterior com uma ponta de aspiração.
5. Usando uma pipeta de 1 mL, aplicam-se lentamente DM fresco para a câmara interna até integral. Tenha cuidado para não raspar ou não desalojar a camada de células.
6. Substitua o material na câmara exterior com 2 mL de CM fresco.
7. Manter as culturas durante 2 semanas, e então proceder ao processamento para o isolamento bimolecular desejado.
   NOTA: Cada linha na placa de 6 poços, num total de seis inserções (Figura 1B), deve ser processado por experiência para adquirir células suficientes para DNUm, ARN ou proteína para análise.
8. Aspirar meios na câmara exterior e lavar com 2 ml de tampão fosfato salino (PBS).
9. Retire cuidadosamente a mídia da câmara interna com um 1 mL ou 200 mL pipeta e adicionar 500 mL PBS. Evitar ou de outro modo raspando perturbar as células sobre a membrana.
10. Aspirar PBS a partir da câmara exterior e cuidadosamente remover PBS a partir da câmara interior com um 1 ml ou 200 ul pipeta. Uma vez que o PBS foi removido, prossiga diretamente para o aplicativo apropriado detalhado abaixo. Não permitir que a membrana a secar. A cultura pode ser mantido brevemente na PBS até que o aplicativo está pronto para começar.

3. Processamento dos Filtros para Pellet Banking

1. Adicionar 100 mL de 0,25% de tripsina-EDTA a cada câmara interior e incubar durante 5 min a 37 ° C.
2. Resumidamente e agitar cuidadosamente / raspar as células sobre a superfície da membrana com uma pipeta 200 uL enquanto pipetando para cima e para baixo (evitar punctruturação a membrana). Incubar durante 1 min a 37 ° C.
3. Adicionar 250 ul de CM para a primeira câmara interior e pipetar para cima e para baixo para lavar suavemente o filtro.
4. Transferência de células ressuspensas para a câmara de filtro adjacente que contém as mesmas condições de meios e repetir pipetando para cima e para baixo.
5. Repetir este procedimento para cada uma das inserções de um único estado. Recolha e transferir as células para um tubo de centrífuga de 1,5 ml.
6. Lavar cada câmara interna com um adicional de 100-200 mL de CM para coletar as células restantes. Adicionar ao tubo de centrífuga de 1,5 mL no passo 3.5.
7. Rodar as células a 423 xg numa microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min.
8. Aspirar o sobrenadante e lava-se a pelete celular uma vez com 1000 mL de PBS.
9. Girar novamente a 423 xg numa microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min.
10. Aspirar PBS e congelamento a -80 ° C para uso posterior.

4. Processamento dos Filtros de RNA ou DNA Isolation

1. Adicionar 200 mL de tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio ou o reagente de extracção semelhante à da câmara interior e agita-se brevemente as células sobre a superfície da membrana por pipetagem para cima e para baixo.
2. Incubar no reagente de extracção durante 5 min à temperatura ambiente com a câmara exterior a seco.
   1. À medida que o filtro pode dissociar-se do inserto, lava-se a membrana de filtro dissociado por pipetagem da solução de extracção para cima e para baixo. Recolher o máximo de o reagente de extracção quanto possível, através da inclinação da placa de 6 poços e aspirando qualquer líquido residual.
3. Seguir o protocolo do fabricante para purificação e recuperação de ADN, ARN ou proteína.

5. Processamento de Filtros para isolamento de proteínas

1. Coloque a inserção do filtro na placa de 6 poços em gelo. Para a câmara interior, adicionam-se 10 mL de tampão de lise proteína suplementado com 1 mM de fluoreto de sódio (NaF), 1 mM de vanadato de sódio (NAV), 100 mM de dithiothreitol (DTT) e 100 mL de cocktail anti-protease.
2. Agitar / raspar as células sobre a superfície da membrana com uma pipeta de 20 mL, enquanto pipetando para cima e para baixo. Evitar a geração de bolhas no tampão de lise.
3. Incubar a placa de 6 poços com inserções de filtro em gelo durante 10 min.
4. Repetir raspagem e depois enxaguar a superfície da membrana com o tampão de lise.
5. Recolher os lisados ​​das inserções 6 e transferir para um tubo de centrífuga de 1,5 ml em gelo.
6. Enxaguar o primeiro membrana com um adicional de 10 mL de tampão de lise e transferência para o próximo filtro.
7. Repita o passo 5.6 para todas as inserções, recolhendo qualquer solução tampão de lise residual e adicionar a 1,5 tubo mL (passo 5.5).
8. Incubar a amostra em gelo durante um adicional de 5 min.
9. Rotação em velocidade máxima (16873 xg numa centrífuga de topo de mesa) durante 15 min a 4 ° C.
10. Pipeta lisado sobrenadante para um tubo de 1.5 ml fresco.
11. Proceder à análise da concentração de proteína ou store lisados ​​a -80 ° C.

6. Tratamento para a H & E e Imuno-coloração

1. Adicionar 500 uL e 1 mL de NBF a 10% (formalina tamponada neutra) para a câmara interior e exterior e deixar incubar durante a noite a 4 ° C.
2. Aspirar o NBF da câmara exterior e adicionar 1 mL de agarose hidroxietil (HEA) processando gel para um mL de centrífuga de 1,5. Lentamente derreter a agarose no microondas usando baixa potência e repetido 10-20 s pulsos até que a agarose é derretido.
3. Mantenha o HEA em um banho quente 37 ° C para evitar a solidificação até estar pronto para usar.
4. Remover o NBF a partir da câmara interior e aplicar 25 ul de HEA fundido para o interior da câmara e permitir que a agarose solidificar durante 2-5 min.
5. Wet 2 espuma almofadas de histologia em 10% NBF e coloque uma almofada em uma cassete de incorporação (veja a Figura 3D).
6. Use a # 11 bisturi com lâmina (que tem, uma lâmina fina pontas muito afiadas) para marcar o filtro do lado inferior do insertocâmara, liberando-o parcialmente da câmara de inserção de plástico.
7. Colocar uma pequena quantidade (100-200 uL) de NBF numa placa de Petri e imergir o filtro parcialmente desalojado no NBF (Figura 3A).
8. Com uma lâmina de bisturi # 10, exercendo uma ligeira pressão contra o meio do filtro, a partir do interior da câmara de inserção, para desalojar completamente o filtro a partir do barril de inserção (Figura 3B). Se não houver qualquer parte do filtro que está ainda ligado ao cano, cortá-la com o bisturi.
9. Cortar o filtro de HEA-revestidas em meio com a lâmina de bisturi # 10 (Figura 3C).
10. Colocar cada metade do filtro sobre a almofada de espuma na cassete histologia preparado no passo 6.4 (Figura 3D).
11. Adicionar a segunda esponja embebida NBF a 10% para a cassete, ensanduichando o filtro.
12. Snap selar a cassete, coloque em NBF, e incubar durante a noite.
13. filtros de processo em blocos de parafina para seccionamento e coloração comoanteriormente descrito ^12.

Resultados

O sistema de inserção de cultura de células com base é um procedimento relativamente simples e rápido para a produção de culturas em 3D de CRCs próstata que apoia a diferenciação celular luminal. Um diagrama esquemático do sistema é mostrado (Figura 1A) destacando a aplicação do revestimento de gelatina, para a superfície do fundo do elemento filtrante. As inserções são apenas virado para a aplicação da gelatina. Na Figura 1B, os filtros são na orientaçã...

Discussão

linhas de células primárias são uma plataforma importante e em rápido desenvolvimento para a investigação do cancro. O sistema de cultura 3D baseado em inserção de cultura apoia a diferenciação da CRCs próstata primários dentro de um prazo de duas semanas. O método do filtro CRC representa, um método de transferência novo meio para a investigação de próstata. Modelos existentes rato PDX são demorados e extremamente caro, e muitas das amostras PDX não podem ser cultivadas em cultura, o que limita a experimentação iniciad...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Inserções de Cultura Corning Costar Snapwell Inserções de Cultura de	Corning	3801
Millicell	Millipore	PIHP01250
Multiwell 6 Poços	Falcon	353046
Gelatina 0.1% em água	Stemcell Technologies	7903
Esterilize Saftey Scapel 10 Blade	Integra Miltex	4-510
Bisturi Padrão Estéril 11 Lâminas	Integra Miltex	4411
RIPA Lise e Tampão de Extração	Thermofisher Scientific	89900
Fluoreto de Sódio	Fishcer	Scientific S299-100
Vanadato de Sódio	Fishcer Scientific	13721-39-6
Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	3483123
Coquetel Inibidor de Protease (AEBSF, Aprotinina, Bestatina, E-64, Leupeptina e Pepstatina A)	Sigma-Aldrich	P8340
0.25% Tripsina-EDTA (1x)	Thermofisher Scientific	25200-056
DMEM	Thermofisher Scientific	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamina	Thermofisher Scientific	25030081& nbsp;
Penicilina Estreptomicina	Thermofisher Scientific	15140-122
F-12 Meio de mistura de nutrientes	Thermofisher Scientific	11765054
Y-27632 dicloridrato Inibidor de rocha	Enzo	ALX-270-333-M025
Hidrocortisona	Sigma-Aldrich	H0888
EGF	Thermofisher Scientific	PHG0315
Insulina	Thermofisher Scientific	12585-014
Toxina da cólera	Sigma-Aldrich	C3012
Gentamicina	Thermofisher Scientific	15710-064
Fungizone	Fisher Scientific	BP264550
Trizol Reagente	Invitrogen	15596026
Histogel Gel de Processamento de Espécimes ( hidroxietilagarose (HEA))	Thermo Scientific	HG-4000-012
Curativo não aderente	Telfa	KDL2132Z
de cultura de células	Sigma	SIAL0167
HISTOSETTE II Processamento de tecidos / de incorporação	Crystalgen	CG-M492