Abstract
Şartlı yeniden programlanması hücreleri (CRC), birincil hücre kültürü ve hasta türevi hücre hatlarının geniş bir "canlı biyobankalar" geliştirilmesi yeteneğine için kalıcı bir yöntem sağlar. Epitel hücrelerinin pek çok türleri için, farklı üç boyutlu (3D) bir kültür yaklaşımları, geliştirilmiş bir farklılaşmış hallerinin destekleyen tarif edilmiştir. CRC de izole edildiği doku olarak soy kararlılığını muhafaza ederken, normal, iki boyutlu (2D) kültür koşulları altında yetiştirildiğinde kaynaklı doku ile ilişkili farklılaşma markörünü ifade etmiş başarısız olur. prostat kanseri araştırması için, hasta türevi CRC uygulama geliştirmek için, 3D kültür formatı, normal ve tümör türetilmiş prostat epitelial hücreleri hem de hızlı bir şekilde (2 gün toplam) lümen hücre farklılaşması sağlayan tanımlanmıştır. Burada, bir filtre elemanı tabanlı formatı, normal ve habis prostat CRC hem kültür ve farklılaşması için tarif edilmiştir. bir deimmünohistokimyasal ve immunofluorescent boyama hücre toplama ve işleme için gerekli prosedürlerin kuyruklu açıklaması verilmektedir. Topluca ilköğretim CRC hatları ile kombine tarif 3D kültür biçimi, biospecimen tabanlı prostat araştırma için verim model sistemi belirginleştirebilirsiniz önemli bir orta sağlar.
Introduction
bireylere kişiselleştirilmiş kimlik ve kanser tedavilerinin kullanımı kanser araştırmalarında bir birincil hedefi vardır. Son zamanlarda, yeni yaklaşımlar potansiyel olarak her iki belirleme ve kişiye özel tedavilerin test yolları sağlayan primer hücre kültürlerinde kurulmasında daha kolay izin geliştirilmiştir. Örneğin, R-spondin bazlı prostat organoid yaklaşım 1 bir ticari hücre dışı matris içinde normal ve metastatik prostat kanseri hücrelerinin üç boyutlu (3D) kültür (ör Matrigel) için Hücrelerin Şartlı yeniden programlanması (CRC) yöntemi ise Georgetown 2 geliştirilen, 3 daha fazla standart 2D kültür koşulları kullanır. Spesifik olarak, Rho kinaz inhibitörü (Y-27632) ve ışınlanmış J2 fare fibroblast besleyici hücreler kombinasyonu keratinosit CRC 2 belirsiz kültür yol açar. CRC metodolojiSon derece sağlam, birincil hücre hatları başarıyla kuruldu ve prostat ve diğer birçok normal ve malign epitelyal dokuların 3 süresiz muhafaza ile. Önemlisi, bizim CRC teknolojisi önceki ilaç tedavileri bir dizi başarısız olan bir hastada tekrarlayan solunum papillomatozis için etyolojik temeli hızla tanımlanması için izin verdi. Buna ek olarak, normal ve tümör kaynaklı Literatürde KRK kullanılarak bir FDA başarılı kimlik ilk doku biyopsisi iki hafta içinde yapıldı, vorinostat ilaç onaylanmıştır. Hastalar, hastalıkları 4 başarılı bir şekilde tedavi ile sonuçlanan vorinostat yerleştirildi.
Normal prostat bezi luminal, bazal ve nadir nöroendokrin hücrelerden 5 oluşmaktadır. Luminal hücrelerin bezinin kolon epitel tabakasının oluşturulması ve androjen reseptörü (AR), hem de bu sitokeratin 8 ve 18 ve ön ve diğer lümen belirteçlerdevlet-spesifik antijen (PSA) 6. Tersine, bazal hücre lümen tabakasının altında lokalize ve sitokeratinin 5 ve p63, ama AR 5 düşük seviyelerde ifade edilir. Biz 7, 8, 9 ve diğerleri 10 başarılı bir şekilde klinik öncesi mekanik ilaç duyarlılığı araştırmalarda prostat Literatürde KRK kullandık. Standart 2D doku kültürü koşullarında yetiştirilen Ancak, bu hücrelerin tam 10 sinyalizasyon AR kavrayana başarısız. bağışıklık yetersizliği olan farelerde böbrek kapsülü altına En önemlisi, CRC permisif ortamına yerleştirildiklerinde prostat CRC kendi soy kararlılığını muhafaza belirten normal prostat glandüler mimarinin ve fonksiyonu geri kazanılmaz. Burada açıklanan Filtre elemanı dayalı hücre kültür sisteminin gelişimi hızlı (2 hafta) kanıtlandığı b prostat CRC in vitro farklılaşmasını sağlarY, artan Ar ve Ar, hedef genlerin ekspresyonu da azaldıkça p63 seviyeleri.
Kullanılan filtre ekler memeli hücrelerinin kültürlenmesini destekleyebilir polikarbonat zarları (gözenek boyutu, 0.4 mikron) ihtiva ederler. Sistem, geliştirilmiş olarak normal ve habis prostat CRC, 6 oyuklu kültür tabaklarında ve filtre insertlerin kullanımını sağlar. J2 hücreleri 11 ile belirlenen hücre kültür ortamı, üst bölme alt bölmesi ve prostat ayırt ortam yerleştirilir. teknikler, burada kişiselleştirilmiş tıp hedefleriyle uyumlu bir 2 hafta süre içinde prostat lümen hücre farklılaşmasını destekleyen tarif. Kültürlerin kapsamlı, moleküler genetik ve hücresel profil izin metodolojiler geliştirilmesi de zorunluluk oldu. Filtre yüzeyinden salınan hücrelerden DNA, RNA ve protein izole edilmesine yönelik yaklaşımlar geliştirilmiş ve doğru tekrar numune işleme için aerodinamik edilmiştir. FinaLly, metodoloji H & E, immünohistokimyasal ve immunofluorescent boyama, gömme etkinleştirmek için filtreyi kaldırma kesit için ve gerekli, tam bir şekilde anlatılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
3D Hücre 1. Kuruluş Kültür takın Sistemi
- Aşağı 6 kuyu plaka (Şekil 1A) bir ters yönde (yukarı filtre tarafı) 2 polikarbonat hücre kültürü ekler yerleştirin.
- parçanın alt tarafına su içinde% 0.1 jelatin, ince bir tabaka halinde yayılır ve sterilliği korumak için, biyolojik bir güvenlik kabini (10-20 dakika) kurutun.
- Adımı tekrar 1.2 insert% 0.1 jelatin 3 uygulama toplam iki kere daha.
NOT: Jelatin kaplama odacıkları arasındaki sınır difüzyon yardımcı olacaktır. - kültür şişesi yıkamak için 5 ml PBS ekleyin standart kültür koşullarında birincil Literatürde KRK toplamak için.
- 37 ° C'de 5 dakika süreyle% 0.25 tripsin-EDTA (T-75 T-25 ve 2 mL için 1 mL) kullanılarak hücreler tripsinize. Yavaşça hücreleri yerinden çıkarılmasına yardımcı olmak için balonun yan dokunun. Sonra tripsin reaksiyonu durdurmak ve tam DMEM 5 ml ekleyerek hücreleri toplamak için devam edin.
- Toplamak 15 ml bir tüp içinde hücreleri. 4 ° C ve 188 x g'de tüpü santrifüjünde ve otomatik bir hücre sayacı ya hemasitometre kullanarak sayın.
- Medya (CM) klimalı 250 uL 600.000 Literatürde KRK yeniden askıya ve düzgün odaklı (filtre tarafı aşağı) kültür insert (Şekil 1B) ekleyin. Bu iç hazne olarak adlandırılır.
Not: CM ışınlanmış J2 hücreleri şartlandırılmış F ortamı ve daha önce 7, 8, 9, 11 tarif edilen şekilde 10 um Y-27632 içerir.
- 6 plaka dış haznesine CM 2 mL uygulayın ve (en azından 18 saat için) gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Dikkatlice 1 ml veya 200 uL pipet ile iç odasının CM kaldırmak ve yavaş yavaş tam kadar 1 ml pipet ile iç odaya farklılaşma medya (DM) ekleyin. Hücre tabakası rahatsız için dikkatli olun.
- Her gün kültürleri kontrol edin. Şekil 2'de gösterildiği gibi, sağlıklı hücreler görünür.
- Dış odasında CM her gün ya da hücrelerin metabolizması bağlı olarak her geçen gün değiştirin.
- (Sarı), iç bölme değişiklikleri renk medya, dikkatli bir 1 ml veya 200 uL pipet ile iç filtre odasının medya kaldırdığınızda.
- Bir aspirasyon ucu ile dış 6 kuyu plaka odasında medya aspire.
- 1 ml pipet kullanarak, yavaşça tam kadar iç odaya taze DM uygulayın. kazımak veya başka hücre tabakası çıkarmak için dikkatli olun.
- Taze CM 2 mL dış odasının ortamı değiştirin.
- 2 hafta kültürleri korumak ve daha sonra istenen bimolecular izolasyonu için işleme devam edin.
NOT: 6 plaka her satır, altı ekler (Şekil 1B) toplam, DN için yeterli hücre elde etmek için deney başına işleme tabi tutulmalıdırAnaliz için bir RNA ya da protein. - dış odanın aspire ortam ve 2 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ile durulayın.
- Dikkatlice 1 ml veya 200 uL pipet ile iç odasından ortamı çıkarın ve 500 uL PBS ekleyin. kazıma veya başka membran üzerinde hücrelerin rahatsız etmemek.
- Aspire dış odasından PBS ve dikkatli bir 1 ml veya 200 uL pipet ile iç odasından PBS kaldırmak. PBS çıkarıldı sonra, aşağıda ayrıntılı olarak uygun bir uygulama direkt olarak devam edin. Membran kurumasına izin vermeyin. Uygulama başlamaya hazır olana kadar kültür PBS kısaca tutulabilir.
3. Pelet Bankacılık için filtreler İşleme
- her bir iç bölmeye 100 uL% 0.25 tripsin-EDTA ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edilir.
- aşağı yukarı pipetleme ve süre Kısaca ve özenle / ajitasyon 200 uL pipet ile membran yüzeyinde hücreleri kazıyın (Punc önlemek) Membran açmadan. 37 ° C'de 1 dakika süreyle inkübe edilir.
- Filtreyi durulama yavaşça ilk iç odaya CM 250 uL ekleyin ve yukarı pipet ve.
- Transferi Aynı medya koşullarını içerir ve aşağı yukarı pipetleme tekrarlayın ve komşu filtre odasına hücreleri yeniden süspanse.
- Tek bir durumun ekler her biri için bu işlemi tekrarlayın. Toplamak ve 1.5 ml santrifüj tüpüne hücreleri transferi.
- kalan hücreleri toplamak için CM ek 100-200 uL her bir iç bölmeyi durulayın. Aşama 3.5, 1.5 ml santrifüj tüpüne ekleyin.
- 5 dakika boyunca 4 ° C'de bir mikrosantrifüj içinde 423 xg'de hücreleri dönerler.
- Süpernatantı aspire ve 1000 uL PBS ile bir kez hücre pelet yıkayın.
- 5 dakika boyunca 4 ° C'de bir mikrosantrifüj içinde 423 x g hızında tekrar Spin.
- PBS aspire ve daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C'de dondurularak.
4. RNA veya DNA İzolasyon için filtreler İşleme
- filtre elemanından ayırmak gibi, yukarı ve aşağı çekme çözüm pipetleme kopuk filtre membran yıkayın. 6 plaka devirme ve herhangi bir kalıntı sıvıyı aspire mümkün olduğunca çıkarma reaktif kadar toplayın.
5. Protein İzolasyonu için filtreler İşleme
- Buz üzerinde 6 plaka filtre koyunuz. İç bölmeye, 10 ul 1 mM sodyum florit (NAF), 1 mM sodyum vanadat (NAV), 100 mM dithiothre ile takviye edilmiş bir protein liziz tamponu ilaveinositol (DTT) ve anti-proteaz kokteyli 100 uL.
- / Çalkalamak yukarı ve aşağı pipetleme ise 20 uL pipet ile membran yüzeyinde hücreleri kazıyın. lizis tamponunda kabarcıkları üreten kaçının.
- 10 dakika boyunca buz üzerinde filtre eklenmiş 6 yuvalı plaka inkübe edin.
- kazıma Tekrar sonra lizis tamponu ile membran yüzeyin durulanması.
- 6 uçlar arasında lisatlan toplayın ve buz üzerinde 1.5 ml santrifüj tüpüne aktarılır.
- Bir sonraki filtreye liziz tamponu ve transfer ek olarak 10 uL ilk membran durulayın.
- Tüm ekler için yineleyin 5.6, herhangi bir kalıntı lizis tampon çözeltisi toplama ve 1.5 mL tüp (adım 5.5) ekleyin.
- ilave bir 5 dakika boyunca buz üzerinde örnek inkübe edin.
- 4 ° C'de 15 dakika maksimum hızda (bir masa üstü santrifüjü içinde 16.873 xg) dönerler.
- Taze 1.5 ml tüp içine Pipet lizat süpernatant.
- protein konsantrasyonu ya da taştan analizine devam edin-80 ° C'de lizatları Re.
H & E ve Immuno-boyama 6. İşleme
- İç ve dış bölmeye 500 uL% 10 1 ml NBF (nötr tamponlu formalin) ilave edin ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
- Dış odasından NBF aspire ve 1 mL hidroksietil agaroz (HEA), 1.5 mL santrifüj işleme jeli ilave edin. Yavaş yavaş düşük güç kullanan bir mikrodalga agaroz eritebilir ve erimiş agaroz kadar 10-20 s darbeleri tekrarladı.
- Kullanıma hazır olana kadar katılaşmasını önlemek için, 37 ° C sıcak bir banyoda HEA tutun.
- iç odanın NBF çıkarın ve iç bölme erimiş HEA 25 uL uygulanır ve agaroz 2-5 dakika boyunca katılaşmaya sağlar.
- % 10 NBF Islak 2 köpük histoloji yastıkları ve (Şekil 3D bakınız) gömme kaset bir ped yerleştirin.
- parçanın alt tarafında filtreyi skor (çok keskin, ince uçlu bir bıçak olan) bir 11. bıçak neşter kullanabilirsinizodası kısmen plastik uç haznesinden bırakmadan.
- Bir Petri kabındaki NBF küçük bir miktar (100-200 ul) yerleştirin ve NBF (Şekil 3A) kısmen yerinden filtreyi batırmayın.
- Bir # 10 bıçak neşter ile hafifçe tam uç haznenin (Şekil 3B) filtre çıkarmak için, uç bölmenin içinden, filtre ortasında karşı baskı. hala hazne takılı filtrenin bir kısmı olması durumunda, neşter ile sever.
- 10. bıçak neşter (Şekil 3C) ile ikiye HEA kaplı filtre kesin.
- Aşama 6.4 (Şekil 3D) 'de hazırlanan histolojik kaset köpük ped üzerine, filtrenin her yarım yerleştirin.
- Filtreyi sandviç, kaset ikinci% 10 NBF batırılmış sünger ekleyin.
- Yapış NBF kaseti, yer mühür ve gece inkübe edin.
- kesit ve boyama olarak parafin bloklar halinde süreç filtreleriDaha önce 12 tarif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücre kültürü uç tabanlı sistem lümen hücre farklılaşmasını destekleyen prostat CRC 3D kültürleri üretmek için göreceli olarak basit ve hızlı bir yöntemdir. Sistemin şematik bir filtre elemanının alt yüzeyine jelatin kaplama uygulamasını öne (Şekil 1A) gösterilmektedir. dolgular yalnızca jelatin uygulanması için devrilmiştir. Şekil 1B filtreler kültürlenmesi için uygun doğrultuda bulunmaktadır. Şeffaf bir hücre ekleme kullanarak, sağlıklı bir 3D prostat CRC kültürünün bir temsilcisi görüntü (10X) (Şekil 2) gösterilmektedir. gösterdi sağlıklı CRClerin yoğun katman kurulmasından sonra tipik ve standart ışık mikroskobu kullanılarak görüntülendi olabilir. Başlangıç kurulması sırasında, yöntem, belirli bir hücre hattı ile uyumlu olmasını sağlamak için kurulan hücre tabakasının ve uygun ek ve la görselleştirmek için önemlidirhücrelerin Yering meydana gelmiştir.
Yukarıda belirtildiği gibi HEA ucun içine uygulanır. Ek parçası (Şekil 3A, 3B) çıkarmak için bir filtre puanlama zaman HEA uygulanmasından sonra, dikkat edilmelidir. Tüm adımları (Şekil 3A-3D) olarak bakımı da hücreleri ile filtre üzerinde HEA tabakasının gereksiz hareketini en aza indirmek için dikkatli olunmalıdır. CRC tabaka kolayca bozulur ve H & E kaset (Şekil 3B) transferi sırasında zarar görebilir. Plastik varil (Şekil 3A-3C) den HEA kaplı filtre eksizyonu sonra, filtre yarıya olabilir ve kesit ve standart katıştırma kasetleri (Şekil 3D) kullanarak boyanarak için işlenmiş. devre filtresi bölme H & E ve IF çapraz kesit için uygun olan yüzey maksimize etmek önemlidir.
immünofloresan boyamaayrıca parlak saha (BF) ve filtre tabakası üzerinde kültür hücreleri Çıkan DSU (disk Tarama Birimi) döner diskli konfokal yetenekleri olan bir mikroskop kullanılarak toplanmıştır. Histoloji ve H & E boyama için Örnek sonuçlar filtre elemanının ve hücreler (20X) (Şekil 4) bir kesiti gösterilmektedir. Doğru bakım ile, doku histolojisi için standart bir uygulama olduğu gibi filtre ekler üzerinde bir CRC tabaka kesitli ve lekeli edilebilir olduğunu göstermektedir. Kesitlere ayırma esnasında (Şekil 4) görüldüğü gibi CRC hücrelerin dokunulmamış tabaka olarak filtreden müstakil olmak mümkündür. BF görüntü gözenekli membran (Şekil 5A) üzerinde çok katmanlı hücre tabakalarını göstermektedir. Her üç floresan belirteçleri (Şekil 5E) birleştirme gibi çekirdeklerin için bireysel floresan görüntüler (DAPI, Şekil 5B), p63 (Şekil 5C) ve AR (Şekil 5D), gösterilmiştir. Son olarak, kompozithücre ve filtreye floresan sinyali göreceli lokalizasyonu kurulması e BF ve bindirme gösterilir IF (Şekil 5F). p63 ile DAPI leke bindirme boyama açıkça proliferatif devlet hala bazı hücreleri gösterir IF. AR lokalizasyonu çekirdeğinde boyama prostat hücrelerinde AR fonksiyonel reaktivasyonu göstergesidir IF.
Bizim filtre elemanı sistemi olduğunda bir kesit prostat dokusu arasında bir karşılaştırma, prostat epitel edilene eden soğuk rulo uç tabakasının gelişmesinde benzerliği göstermek için (Şekiller 6a, 6b) de gösterilmiştir. Prostat kanalı prostat bazal hücreler ile tutarlı p63 ifadesini gösterir. p63 boyama, bir ek üzerine CRC görülür. hücrelerini tanımlayan Daha yüksek bir yüzde p63 sağlam doku kesiti ile karşılaştırıldığında bizim geçme gözlenmiştir. Buna ek olarak, nükleer ve sitoplazmik AR hem prostat tis görülür filtre elemanı göstermek daha az genel AR ifade nükleer AR ifade ve sitoplazmik boyanma hem CRC, bozulmamış prostat benzer görülürken bölümü dava ve.
Şekil 1: 3D Kültür sistemini içeren 6-kuyu Kültür Bulaşık ve Ekle Temsilcisi Görüntüler. Filtre (ok) alt tarafına jelatin kaplama uygulamak için (A) Ters ekler. insert ve filtrenin bir büyük resim gösterisi (ek) 'dir. (B) Düzgün yerleştirilmiş ekler. Sistemin dış ve iç odalar (oklar) görülmektedir. B kutulu satır belirli bir deneysel durum için elde nasıl birden örnekleri göstermektedir. 2 haftalık büyüme süresinin bitiminde, bu uçlar analiz için yeterli malzeme elde etmek için bir araya getirilmiş olabilir."Target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Şeffaf Filtre Membran üzerine Sağlıklı CRC numaralı seribaşı bir Katmanı bir Temsilci Görüntü Gösterildi edilir. Iç ve dış odalar koşullu ortam ihtiva etmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Filtre bir Temsilci resmi iki bölüme yarıya ve Gömme bir Parafin Kaset içine yerleştirilir. (A) Filtre puanlama sonra çıkarmadan önce HEA kaplama ile yerleştirin. (B) polikarbonat varil salınan filtresi elemanı. (
Şekil 4: Filtre Ekle ve Hücreleri A Temsilcisi H & E Lekeli Kesit (20X). Hem zar (altta) ve hücre tabakası (üst) gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Temsilcisi Parlak Field (BF) ve İmmünoflöresan (IF) A Serisi görüntüleriHücreler Filtre (40X) üzerine Parçal. filtre ve hücrelerin kesitleri gösterilmiştir. Filtre yüzey (5A) bir hücre lekelenmemiş BF görüntü iki farklı protein, p63 (5c) ve androjen reseptörü (AR, 5D) DAPI lekeli çekirdeğe (5B) ve imünoflöresan boyaması için görüntü eşlik eder. Hücre bölümlerine (5E, F) bir kompozit katlamalı hücreleri ve filtre bağlamında IF sinyallerinin lokalizasyonunu tanımlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: Doku Prostat Epitelinin bir bölüm (20X) karşı Filtre üzerinde Parçal Hücreleri Bir Temsilci İmmünoflöresan (IF) Görüntü.Bizim filtre elemanının bir kesit görüntüsü, sağlam bir prostat (Şekil 6B) duktal epitelyum tabakalarına kıyasla (Şekil 6A) gösterilmektedir. P63 boyanması, AR ve çekirdek, Şekil 5'te olduğu gibi gerçekleştirilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Primer hücre hatları kanser araştırmaları için önemli ve hızla gelişen bir platform vardır. kültür insert tabanlı 3D kültür sistemi bir iki haftalık süre içinde birincil prostat CRClerin farklılaşmasını desteklemektedir. CRC filtre yöntemi prostat araştırma için yeni bir orta hacimli yöntemi temsil eder. Mevcut fare PDX modelleri zaman alıcı ve son derece pahalıdır ve PDX örneklerin birçok araştırmacı tarafından başlatılan deney ve kullanımını sınırlayan, kültür içinde yetiştirilen edilemez. PDX kurma başarı oranları büyük ölçüde 13 değişebilir Buna ek olarak, CRC yöntemi hücre hatları 3 kurulmasında yüksek bir başarı oranına sahiptir. Bizim sistem R-spondin tabanlı prostat organoid yaklaşımın tamamlayıcı olarak düşünün; Bununla birlikte, birincil prostat kanserinden organoids kurulması ile ilgili olarak başarı eksikliği 14 bildirilmiştir. Ayrıca, medya, kuruluş yöntemleri,ve CRClerin bakım R-spondin tabanlı prostat organoid yaklaşıma göre önemli ölçüde basittir. Ek bir avantaj olarak, CRC kurulan ve doğrudan moleküler karşılaştırmalar için eşleştirilmiş normal ve tümör kültürleri test etmek için kullanılır.
Bazı teknik sorunlar bu sistemi kurarken ele alınması gerekmektedir. İlk olarak, jelatin kaplama uç yardımcı filtrenin alt tarafına uygulanabilir ancak, zarından medya difüzyonunu ortadan kaldırmaz. Sık ortam değişiklikleri (hücrelerin daha düşük ya da taban tabakası) bölme içinde koşulları büyüme vs farklılaşması (üst ya da apikal hücre tabakası) ilgili gradyanı sürdürmek için kullanılır. İkinci olarak, başarılı 3D CRC kültürleri nispeten yüksek bir hücre ekim yoğunluğu gereklidir. Alt tohumlama yoğunlukları filtre yüzeyinde gelişen hücre tabakasının bütünlüğü açısından kötü sonuçlar vermiştir. Literatürde KRK kültürleme Bu bir bakımı yapıldığında en çok şiddetle büyüdükçe, ortak bir hususturt yüksek hücre yoğunlukları. Son olarak, uygun bir çıkarma ve sağlam hücre tabakasını parafine gömme hücre farklılaşması ölçüde tanımlamak için çok önemliydi. hidroksietil agaroz (HEA) eklenmesi her iki hücre kaybına da yol açmaktadır ve gömülü olmayan filtrelerle karşılaştırıldığında hücrelerin genel morfolojisi geliştirilmiş (gösterilmemiştir). düzgün bir şekilde yerleşik sonra, filtreler kesitli ve tipik hücre ve doku örneklerinin farksız bir şekilde işlenmiştir.
Biz sadece bu filtre yöntemi kullanılarak prostat epitel mimarisini taklit başlıyor. medyaya ve alt tabakaya kültür koşullarına ek değişiklikler, kolaylıkla ele alınabileceğini, hangi garanti altındadır. Örneğin, daha iyi bazal farklılaşma vs luminal teşvik edebilir yeniden formüle farklılaşma ortamlarının hızla test edilebilir. CRClerin lentiviral enfeksiyonu ticari kanser hücrelerinin 7 ve 2D CRC ile olduğu kadar kolay uygulanabilir beri al varböylece kalıcı bir şekilde hücre genomu (veriler gösterilmemiştir), mutasyona uğramış silinmiş veya tamir genlerin etkisi test edilebilir değiştirmek için CAS9 / CRISPR gen düzenleme teknolojisi vektörleri ile transfekte edilmiş. Benzer bir şekilde, soy izleme soyu, özgül raportör genleri ile mümkün olabilir.
ortam veya hücre değiştirmeye ek olarak, filtre yüzeyine değişiklikler de test edilebilir. Farklı filtre zarı substratlar ticari olarak temin edilebilir. Buna ek olarak, filtrenin içine uygulandığında, ticari hücre dışı matris uygun bir büyüme ortamı sağlar bulmuşlardır. insert sisteminin amaçlarından biri daha prostat mikro modeli olduğu için, belki de en ilginç değişiklikler, normal veya tümör kaynaklı stromal hücrelerin giriş olması ya ucun sınırları içinde veya CRClerin ile ko-kültür olabilir alt bölmede büyüme ortamı koşulu. o bölümleri ile iyi insert değiştirmef Decellularized prostat dokusu da mümkündür. Bu yaklaşımda, stromal / epitelyal etkileşimler birincil hücreler büyüme için bir iskele olarak decellularized doku kullanmak için izin verebilir.
birincil hücreler kurmak ve daha sonra onların farklılaşması için koşulları sağlamak için yeteneği, normal glandüler gelişme içine ve kanser araştırmaları için daha biyolojik ilgili araştırma için ideal bir formattır. Bu tarifnamede anlatılan sistem, hücre tipleri ve modifikasyonlar sınırsız sayıda ayrı ayrı deney ihtiyaçlarına sistemi oluşturmak için ve güvenilir analiz için numune toplamak için kombine edilebildiği, bir platform sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu araştırma T32 (CA 9686-18) ve 1 TL (TL1TR001431) doktora sonrası eğitim bursu ödülleri (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA) yanı sıra tarafından desteklenmiştir U01 PAR-12-095 (Kumar) ve P30 CA051008-21 (Weiner). Örnek sabitleme, kesit ve boyama Lombardi Kapsamlı Kanser Merkezi Histoloji ve Doku Paylaşılan Kaynak gerçekleştirildi. Biz yararlı tartışmalar için Richard Schlegel teşekkür ederiz. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Kanser Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 | |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 | |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 | |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 | |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 | |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 | |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 | |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 | |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 | |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z | |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 | |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
References
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Yuan, H., et al. Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).
- Signoretti, S., et al. p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).
- Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T.
- Ringer, L., et al. The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).
- Pollock, C. B., et al. Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).
- Crogliom, M., et al. Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair. Oncotarget. , (2016).
- Saeed, K., et al. Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer. Eur Urol. , (2016).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. J Vis Exp. (99), e52868 (2015).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
