Name: Um sistema de cultura 3D baseado em Inserir Filtro Rápido para próstata primário Diferenciação Celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprenda um sistema de cultura 3D baseado em inserção de filtro para diferenciação rápida de células epiteliais prostáticas primárias humanas, permitindo isolamento eficiente de RNA, DNA e proteína para pesquisa em câncer de próstata.

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Esta pesquisa foi apoiada por T32 (CA 9686-18) e TL1 (TL1TR001431) concessão de verbas de formação de pós-doutorado (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA), bem como U01 PAR-12-095 (Kumar) e CA051008-21 P30 (Weiner). a fixação da amostra, corte e coloração foi realizada no Lombardi Comprehensive Cancer Center Histologia e Tecidos de recursos partilhada. Agradecemos Richard Schlegel para discussões úteis. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Câncer ou o National Institutes of Health.

1. Criação do celular 3D Cultura Inserir Sistema <ol><li> Coloque inserções de cultura de células 2 de policarbonato com uma orientação invertida (lado do filtro para cima) para baixo em uma placa de 6 poços (Figura 1A). </li><li> Aplicar uma camada fina de 0,1% de gelatina em água, para o lado inferior da peça inserta e deixar secar (10-20 min) numa câmara de segurança biológica para manter a esterilidade. </li><li> Repetir o passo 1.2 mais duas vezes para um total de 3 aplicações de 0,1% de gelatina sobre os insertos. NOTA: O revestimento de gelatina vai ajudar a difusão limite entre as câmaras. </li><li> Para recolher os CRCs primários de condições de cultura padrão, adicionar 5 mL de PBS para lavar o frasco de cultura. <ol><li> Tripsinizar as células utilizando (1 mL para um T-25 e 2 ml de uma T-75) 0,25% de tripsina-EDTA durante 5 minutos a 37 ° C. Bater levemente a parede lateral do balão para ajudar a desalojar as células. Em seguida, proceder para parar a reacção de tripsina e recolher as células por adição de 5 mL de DMEM completo. </li><li> coletar<html> as células num tubo de 15 mL. Centrifuga-se o tubo a 4 ° C e 188 xg e contagem usando um contador de células automatizado ou um hemocitómetro. </li><li> Re-suspender 600.000 CRCs em 250 mL de mídia (CM) condicionado e adicionar ao orientada corretamente (lado do filtro para baixo) inserção de cultura (Figura 1B). Isto é referido como a câmara interna. Nota: CM é F-meios condicionados por células J2 irradiados e contém 10 um Y-27632, como descrito anteriormente 7, 8, 9, 11. </li></ol></li><li> Aplicar 2 mL de CM para a câmara exterior da placa de 6 poços e incuba-se a 37 ° C durante a noite (durante pelo menos 18 h). </li><li> Cuidadosamente remover a CM na câmara interior com uma pipeta de 1 mL ou 200 mL e adiciona-se lentamente meios de diferenciação (DM) para a câmara interior com uma pipeta de 1 mL até completa. Tenha cuidado para não perturbar a camada de células. </li></ol>le &quot;&gt; 2. Manutenção de Culturas em 3D <ol><li> Verifique as culturas a cada dia. As células saudáveis aparecer como mostrado na Figura 2. </li><li> Mudar o CM na câmara exterior todos os dias ou cada dois dias, dependendo do metabolismo das células. </li><li> Quando a mídia da cor mudanças câmara interna (amarelo), retire cuidadosamente a mídia na câmara de filtro interno com um 1 mL ou 200 mL pipeta. </li><li> Aspirar a mídia na câmara de placa de 6 exterior com uma ponta de aspiração. </li><li> Usando uma pipeta de 1 mL, aplicam-se lentamente DM fresco para a câmara interna até integral. Tenha cuidado para não raspar ou não desalojar a camada de células. </li><li> Substitua o material na câmara exterior com 2 mL de CM fresco. </li><li> Manter as culturas durante 2 semanas, e então proceder ao processamento para o isolamento bimolecular desejado. NOTA: Cada linha na placa de 6 poços, num total de seis inserções (Figura 1B), deve ser processado por experiência para adquirir células suficientes para DNUm, ARN ou proteína para análise. </li><li> Aspirar meios na câmara exterior e lavar com 2 ml de tampão fosfato salino (PBS). </li><li> Retire cuidadosamente a mídia da câmara interna com um 1 mL ou 200 mL pipeta e adicionar 500 mL PBS. Evitar ou de outro modo raspando perturbar as células sobre a membrana. </li><li> Aspirar PBS a partir da câmara exterior e cuidadosamente remover PBS a partir da câmara interior com um 1 ml ou 200 ul pipeta. Uma vez que o PBS foi removido, prossiga diretamente para o aplicativo apropriado detalhado abaixo. Não permitir que a membrana a secar. A cultura pode ser mantido brevemente na PBS até que o aplicativo está pronto para começar. </li></ol> 3. Processamento dos Filtros para Pellet Banking <ol><li> Adicionar 100 mL de 0,25% de tripsina-EDTA a cada câmara interior e incubar durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Resumidamente e agitar cuidadosamente / raspar as células sobre a superfície da membrana com uma pipeta 200 uL enquanto pipetando para cima e para baixo (evitar punctruturação a membrana). Incubar durante 1 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 250 ul de CM para a primeira câmara interior e pipetar para cima e para baixo para lavar suavemente o filtro. </li><li> Transferência de células ressuspensas para a câmara de filtro adjacente que contém as mesmas condições de meios e repetir pipetando para cima e para baixo. </li><li> Repetir este procedimento para cada uma das inserções de um único estado. Recolha e transferir as células para um tubo de centrífuga de 1,5 ml. </li><li> Lavar cada câmara interna com um adicional de 100-200 mL de CM para coletar as células restantes. Adicionar ao tubo de centrífuga de 1,5 mL no passo 3.5. </li><li> Rodar as células a 423 xg numa microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e lava-se a pelete celular uma vez com 1000 mL de PBS. </li><li> Girar novamente a 423 xg numa microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Aspirar PBS e congelamento a -80 ° C para uso posterior. </li></ol> 4. Processamento dos Filtros de RNA ou DNA Isolation <ol&gt; <li> Adicionar 200 mL de tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio ou o reagente de extracção semelhante à da câmara interior e agita-se brevemente as células sobre a superfície da membrana por pipetagem para cima e para baixo. </li><li> Incubar no reagente de extracção durante 5 min à temperatura ambiente com a câmara exterior a seco. <ol><li> À medida que o filtro pode dissociar-se do inserto, lava-se a membrana de filtro dissociado por pipetagem da solução de extracção para cima e para baixo. Recolher o máximo de o reagente de extracção quanto possível, através da inclinação da placa de 6 poços e aspirando qualquer líquido residual. </li></ol></li><li> Seguir o protocolo do fabricante para purificação e recuperação de ADN, ARN ou proteína. </li></ol> 5. Processamento de Filtros para isolamento de proteínas <ol><li> Coloque a inserção do filtro na placa de 6 poços em gelo. Para a câmara interior, adicionam-se 10 mL de tampão de lise proteína suplementado com 1 mM de fluoreto de sódio (NaF), 1 mM de vanadato de sódio (NAV), 100 mM de dithiothreitol (DTT) e 100 mL de cocktail anti-protease. </li><li> Agitar / raspar as células sobre a superfície da membrana com uma pipeta de 20 mL, enquanto pipetando para cima e para baixo. Evitar a geração de bolhas no tampão de lise. </li><li> Incubar a placa de 6 poços com inserções de filtro em gelo durante 10 min. </li><li> Repetir raspagem e depois enxaguar a superfície da membrana com o tampão de lise. </li><li> Recolher os lisados ​​das inserções 6 e transferir para um tubo de centrífuga de 1,5 ml em gelo. </li><li> Enxaguar o primeiro membrana com um adicional de 10 mL de tampão de lise e transferência para o próximo filtro. </li><li> Repita o passo 5.6 para todas as inserções, recolhendo qualquer solução tampão de lise residual e adicionar a 1,5 tubo mL (passo 5.5). </li><li> Incubar a amostra em gelo durante um adicional de 5 min. </li><li> Rotação em velocidade máxima (16873 xg numa centrífuga de topo de mesa) durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Pipeta lisado sobrenadante para um tubo de 1.5 ml fresco. </li><li> Proceder à análise da concentração de proteína ou store lisados ​​a -80 ° C. </li></ol> 6. Tratamento para a H &amp; E e Imuno-coloração <ol><li> Adicionar 500 uL e 1 mL de NBF a 10% (formalina tamponada neutra) para a câmara interior e exterior e deixar incubar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Aspirar o NBF da câmara exterior e adicionar 1 mL de agarose hidroxietil (HEA) processando gel para um mL de centrífuga de 1,5. Lentamente derreter a agarose no microondas usando baixa potência e repetido 10-20 s pulsos até que a agarose é derretido. </li><li> Mantenha o HEA em um banho quente 37 ° C para evitar a solidificação até estar pronto para usar. </li><li> Remover o NBF a partir da câmara interior e aplicar 25 ul de HEA fundido para o interior da câmara e permitir que a agarose solidificar durante 2-5 min. </li><li> Wet 2 espuma almofadas de histologia em 10% NBF e coloque uma almofada em uma cassete de incorporação (veja a Figura 3D). </li><li> Use a # 11 bisturi com lâmina (que tem, uma lâmina fina pontas muito afiadas) para marcar o filtro do lado inferior do insertocâmara, liberando-o parcialmente da câmara de inserção de plástico. </li><li> Colocar uma pequena quantidade (100-200 uL) de NBF numa placa de Petri e imergir o filtro parcialmente desalojado no NBF (Figura 3A). </li><li> Com uma lâmina de bisturi # 10, exercendo uma ligeira pressão contra o meio do filtro, a partir do interior da câmara de inserção, para desalojar completamente o filtro a partir do barril de inserção (Figura 3B). Se não houver qualquer parte do filtro que está ainda ligado ao cano, cortá-la com o bisturi. </li><li> Cortar o filtro de HEA-revestidas em meio com a lâmina de bisturi # 10 (Figura 3C). </li><li> Colocar cada metade do filtro sobre a almofada de espuma na cassete histologia preparado no passo 6.4 (Figura 3D). </li><li> Adicionar a segunda esponja embebida NBF a 10% para a cassete, ensanduichando o filtro. </li><li> Snap selar a cassete, coloque em NBF, e incubar durante a noite. </li><li> filtros de processo em blocos de parafina para seccionamento e coloração comoanteriormente descrito 12. </li></ol>

<ol><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li>
<li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reprogrammed+cells+to+identify+therapy+for+respiratory+papillomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis.</a> N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).</li>
<li>Signoretti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+is+a+prostate+basal+cell+marker+and+is+required+for+prostate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development.</a> Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).</li>
<li>Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).</li>
<li>Ringer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+the+p53+tumor+suppressor+protein+bridges+the+apoptotic+and+autophagic+signaling+pathways+to+regulate+cell+death+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).</li>
<li>Pollock, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strigolactone+analogues+induce+apoptosis+through+activation+of+p38+and+the+stress+response+pathway+in+cancer+cell+lines+and+in+conditionally+reprogrammed+primary+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).</li>
<li>Crogliom, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26910887">Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Drug+Testing+of+Patient-derived+Conditionally+Reprogrammed+Cells+from+Castration-resistant+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer.</a> Eur Urol. , (2016).</li>
<li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor%28s%29+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li>
<li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> J Vis Exp. (99), e52868(2015).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

linhas de células primárias são uma plataforma importante e em rápido desenvolvimento para a investigação do cancro. O sistema de cultura 3D baseado em inserção de cultura apoia a diferenciação da CRCs próstata primários dentro de um prazo de duas semanas. O método do filtro CRC representa, um método de transferência novo meio para a investigação de próstata. Modelos existentes rato PDX são demorados e extremamente caro, e muitas das amostras PDX não podem ser cultivadas em cultura, o que limita a experimentação iniciad...

A identificação e uso de terapias contra o câncer, que são personalizadas para os indivíduos são um objetivo principal na pesquisa do câncer. Recentemente, novas abordagens têm sido desenvolvidos para permitir uma maior facilidade no estabelecimento de culturas de células primárias, potencialmente proporcionando tanto meios de identificar e testar terapias personalizadas. Por exemplo, o da próstata com base em R-espondina abordagem organï¿½de 1 permite tridimensional de cultura (3D) de células normais e metastáticas de cancro da próstata em uma matriz extracelular comercial (por exemplo, Matrigel), enquanto que o método da condicionalmente reprogramação das células (CRC) desenvolvido em Georgetown 2, 3 utiliza mais condições de cultura 2D padrão. Especificamente, a combinação de um inibidor da Rho cinase (Y-27632) e células alimentadoras de fibroblastos murinos J2 irradiadas conduzir à cultura indefinido de CRCs queratinócitos 2. A metodologia é CRCextremamente robusta, com linhas de células primárias estabelecidas e mantidas indefinidamente a partir da próstata e muitos outros tecidos epiteliais normais e malignas 3 com sucesso. Importante, a nossa tecnologia de CRC permitido para a rápida identificação da base etiológica de papilomatose respiratória recorrente num doente que não tinha um número de tratamentos com drogas anteriores. Além disso, utilizando os CRCs normais e derivadas de tumores, a identificação bem sucedida de um fármaco aprovado pela FDA, vorinostat, foi feita no prazo de duas semanas de biópsia de tecido inicial. O paciente foi colocado na vorinostat, resultando no sucesso do tratamento da doença 4. A próstata normal é composta de luminal, basal e as raras células neuroendócrinas 5. As células luminais formar a camada epitelial colunar da glândula e expressar o receptor de androgénio (AR), bem como outros marcadores tais como citoqueratinas luminais 8 e 18 e próantígeno específico de estado (PSA) 6. Por outro lado, as células basais está localizada por baixo da camada luminal e expressa citoqueratinas 5 e p63, mas níveis baixos de AR 5. Nós 7, 8, 9 e outros 10 têm usado com sucesso CRCs próstata em investigações sensibilidade a drogas mecanicistas pré-clínicos. No entanto, quando cultivada sob condições padrão de cultura de tecidos 2D, estas células não totalmente engatam AR sinalização 10. Importantemente, quando colocada sob a cápsula renal de ratos imunodeficientes, o CRCs recuperou próstata arquitectura glandular normal e função, indicando que CRCs próstata conservam a sua linhagem compromisso quando colocado num ambiente permissivo. O desenvolvimento do sistema de cultura de células à base de inserção do filtro aqui descrito permite a rápida (2 semanas) a diferenciação in vitro de CRCs próstata como evidenciado by o aumento da expressão dos genes alvo de Ar e Ar, bem como uma diminuição dos níveis de p63. Os elementos filtrantes utilizados contêm membranas de policarbonato (tamanho de poro, 0,4 uM) que podem suportar a cultura de células de mamíferos. O sistema, tal como desenvolvido, faz uso de CRCs próstata normais e malignas, 6 bem pratos de cultura e as inserções de filtro. Meios de cultura celular condicionado por células J2 11 é colocado na mídia de câmara e de próstata diferenciação de fundo na câmara superior. As técnicas descritas aqui apoiar diferenciação celular luminal de próstata dentro de um prazo duas semanas, de acordo com os objetivos da medicina personalizada. Foi também imperativo desenvolver as metodologias que permitem a caracterização molecular, genética e celular abrangente das culturas. Abordagens para isolamento de ADN, ARN e proteína de células libertadas a partir da superfície do filtro foram desenvolvidos e simplificado para o processamento de amostras de repetição exacta. Finally, a metodologia necessária para remover o filtro para permitir a incorporação, de corte e para a H &amp; E, imuno-histoquímica e coloração de imunofluorescência, é totalmente descrito.

<table><tbody><tr><td>Inserções de Cultura Corning Costar Snapwell Inserções de Cultura de</td> Células <td>Corning</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>Millicell</td><td>Millipore</td><td>PIHP01250</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6 Poços</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina 0.1% em água</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>Esterilize Saftey Scapel 10 Blade</td><td>Integra Miltex</td><td>4-510</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi Padrão Estéril 11 Lâminas</td><td>Integra Miltex</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lise e Tampão de Extração</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de Sódio</td><td>Fishcer</td><td>Scientific S299-100</td><td></td></tr><tr><td>Vanadato de Sódio</td><td>Fishcer Scientific</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483123</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel Inibidor de Protease (AEBSF, Aprotinina, Bestatina, E-64, Leupeptina e Pepstatina A)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030081& nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Meio de mistura de nutrientes</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato Inibidor de rocha</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-333-M025</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>PHG0315</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Toxina da cólera</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3012</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264550</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Histogel Gel de Processamento de Espécimes ( hidroxietilagarose (HEA))</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Curativo não aderente</td><td>Telfa</td><td>KDL2132Z</td><td></td></tr> placa <tr><td>de cultura de células</td><td>Sigma</td><td>SIAL0167</td><td></td></tr><tr><td>HISTOSETTE II Processamento de tecidos / de incorporação</td><td>Crystalgen</td><td>CG-M492</td><td></td></tr></tbody></table>

um sistema de cultura 3d baseado em inserir filtro rápido para próstata primário diferenciação celular

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

células condicionalmente reprogramadas (CRCs) fornecer um método sustentável para a cultura de células primária e a capacidade de desenvolver extensas &quot;biobancos viva&quot; do paciente derivadas linhas celulares. Para muitos tipos de células epiteliais, várias abordagens de cultura tridimensionais (3D) foram descritos que suporta um estado diferenciado melhorada. Enquanto CRCs mantêm a sua linhagem compromisso para o tecido a partir do qual eles são isolados, eles não conseguem expressar muitos dos marcadores de diferenciação associados com o tecido de origem, quando cultivada sob duas condições de cultura dimensional (2D) normais. Para melhorar a aplicação dos CRCs derivadas de pacientes para pesquisa do câncer de próstata, um formato de cultura 3D foi definido que permite uma diferenciação celular rápida (2 semanas total) luminal em ambas as células epiteliais da próstata normais e derivadas de tumores. Nisto, um formato baseado no elemento filtrante é descrito para a cultura e a diferenciação dos dois CRCs normais e malignas da próstata. Um deA inscrição cauda dos procedimentos necessários para a coleta de células e processamento de coloração imuno-histoquímica e imunofluorescência são fornecidos. Colectivamente o formato de cultura 3D descrito, combinados com as linhas CRC primárias, proporciona um médio importante destacar sistema modelo baseado em serviços para a pesquisa de próstata baseada biospecimen.

O sistema de inserção de cultura de células com base é um procedimento relativamente simples e rápido para a produção de culturas em 3D de CRCs próstata que apoia a diferenciação celular luminal. Um diagrama esquemático do sistema é mostrado (Figura 1A) destacando a aplicação do revestimento de gelatina, para a superfície do fundo do elemento filtrante. As inserções são apenas virado para a aplicação da gelatina. Na Figura 1B, os filtros são na orientaçã...

Aqui, apresentamos um método para o estabelecimento de um sistema in vitro rápido que suporta a cultura tridimensional e subsequente diferenciação luminal de células epiteliais primárias da próstata.

Um sistema de cultura 3D baseado em Inserir Filtro Rápido para próstata primário Diferenciação Celular

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

O objetivo geral deste sistema de cultura 3D baseado em insertos de filtro para células primárias derivadas de pacientes é estabelecer um sistema de modelo in vitro mais biologicamente relevante para a pesquisa do câncer de próstata. Ao utilizar células humanas primárias, este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia do desenvolvimento da próstata, bem como no câncer de próstata. A principal vantagem desta técnica é que ela representa uma metodologia in vitro relativamente rápida para o estabelecimento de células primárias da próstata diferenciadas, além de permitir o isolamento rápido de biomoléculas, como RNA, DNA e proteínas.A demonstração visual desses métodos é fundamental, pois o processamento de células no inserto de filtro para histologia ou para coleta de RNA e proteína é delicado e sensível ao tempo. Para ajudar a limitar a difusão entre as câmaras em uma cabine de segurança biológica, aplique uma camada fina de gelatina a 0,1% na face inferior dos insertos e deixe-os secar. Repita este procedimento mais duas vezes.Em seguida, aplique as células à câmara interna dos insertos revestidos com gelatina e cultive-as por até duas semanas. Após duas semanas, aplique diretamente os insertos com filtro cultivados a uma das aplicações a jusante apropriadas descritas a seguir. Para iniciar este procedimento, aspire o PBS da câmara externa e remova cuidadosamente o PBS da câmara interna.Os insertos cultivados podem ser mantidos temporariamente em PBS até que o procedimento esteja pronto para iniciar, mas não permita que a membrana seque. Em seguida, adicione 100 microlitros de tripsina EDTA 0,25% a cada câmara interna. Incube então por cinco minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, raspe brevemente e cuidadosamente as células na superfície da membrana com uma pipeta de 200 microlitros, pipetando para cima e para baixo. Incube então por um minuto a 37 graus Celsius. Após um minuto, adicione 250 microlitros de meio condicionado à primeira câmara interna e pipete suavemente para cima e para baixo para enxaguar o filtro.Após essa transferência, transfira as células re-suspensas para a câmara de filtro adjacente que contém as mesmas condições de meio e repita a pipetagem para cima e para baixo. Repita esse procedimento para cada um dos insertos de uma única condição. Em seguida, colete as células e transfira-as para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.Lave cada câmara interna com mais 100 a 200 microlitros de meio condicionado para recolher quaisquer células remanescentes e adicione-as ao tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugue as células em uma microcentrífuga a quatro graus Celsius durante cinco minutos. Depois disso, aspire o sobrenadante e lave o pellet celular uma vez com 1.000 microlitros de PBS.Centrifugue novamente as células em um microcentrífuga a quatro graus Celsius por cinco minutos. Após cinco minutos, aspire o PBS e congele a amostra a menos 80 graus Celsius para uso posterior. Neste procedimento, adicione 200 microlitros de tiocianato de guanidínio fenol clorofórmio ou reagente extrator semelhante à câmara interna e agite brevemente as células na superfície da membrana pipetando para cima e para baixo.Em seguida, incubar as células no reagente de extração por cinco minutos à temperatura ambiente e manter a câmara externa seca. Posteriormente, lavar a membrana de filtro pipetando a solução de extração para cima e para baixo. Coletar o máximo possível do reagente de extração inclinando a placa de seis poços e aspirando qualquer líquido residual.Observe que o filtro pode se dissociar do inserto. Lave a membrana do filtro dissociada, se estiver presa. Em seguida, colete o máximo possível do reagente de extração e siga o protocolo do fabricante para purificação e recuperação de DNA, RNA ou proteína.Deve-se ter cuidado ao lavar as células e o filtro com tiocianato de guanidínio, pois agitação excessiva pode resultar em RNA de baixa qualidade. Para isolamento de proteína a partir do inserto do filtro, coloque o inserto do filtro na placa de seis poços sobre gelo. Em seguida, adicione 10 microlitros de tampão de lise proteica à câmara interna.Agite e raspe as células na superfície da membrana com uma pipeta de 20 microlitros, pipetando para cima e para baixo, e evite gerar bolhas no tampão de lise. Em seguida, incube a placa de seis poços com inserts de filtro em gelo por dez minutos. Repita a raspagem e, então, enxágue a superfície da membrana com o tampão de lise.Colete os lisados dos seis insertos e transfira-os para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro em gelo. Em seguida, lave a primeira membrana com mais 10 microlitros de tampão de lise e transfira-a para o próximo filtro. Repita este procedimento para todos os insertos de uma determinada condição experimental, coletando qualquer solução residual de tampão de lise e adicionando ao tubo de 1,5 mililitro.Incube a amostra em gelo por mais cinco minutos. Em seguida, centrifugue-a em velocidade máxima por 15 minutos a quatro graus Celsius. Quando terminar, pipete o lisado para um tubo novo de 1,5 milímetro.Em seguida, prossiga para a análise da concentração de proteína ou armazene os lisados a menos 80 graus Celsius. Neste procedimento, adicione 500 microlitros e um mililitro de NBF 10% à câmara interna e externa, respectivamente. Incube-os durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte, aspire o NBF da câmara externa e adicione um mililitro de gel de processamento HEA a um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Derreta lentamente a agarose em um micro-ondas utilizando potência baixa e pulsos repetidos de 10 segundos até que a agarose esteja completamente derretida. Mantenha o HEA em banho-maria a 37 graus Celsius para evitar solidificação até o momento do uso.Em seguida, remova o NBF da câmara interna. Aplique 25 microlitros de HEA fundido na câmara interna e deixe a agarose solidificar por dois a cinco minutos. Em seguida, umedeça dois discos de espuma para histologia em NBF 10% e coloque um disco em um cassete de inclusão.Proteger a integridade das camadas celulares no inserto de filtro utilizando HistoGel é uma etapa crítica para a preservação da camada celular intacta para seccionamento histológico. Em seguida, use um bisturi número 11 para fazer cortes no filtro a partir do lado inferior da câmara de plástico, soltando-o parcialmente. Coloque 100–200 microlitros de FBN em uma placa de Petri e imerja o filtro parcialmente solto no FBN.Com uma lâmina de bisturi número 10, pressione suavemente contra o centro do filtro a partir do interior da câmara do insert para desprender completamente o filtro do corpo do insert. Se houver alguma parte do filtro ainda aderida ao corpo, corte-a com o bisturi. Em seguida, corte o filtro revestido com HEA ao meio.Coloque cada metade do filtro sobre a almofada de espuma no cassete de histologia preparado. Em seguida, adicione a segunda esponja embebida em NBF 10% ao cassete, formando um sanduíche com o filtro. A seguir, feche firmemente o cassete.Coloque-o em FBN e incube durante a noite. Esta imagem de campo claro mostra estratos celulares multicamadas sobre a membrana porosa. São apresentadas as imagens fluorescentes individuais para os núcleos, P63 e o receptor de andrógeno, bem como a sobreposição dos três marcadores de fluorescência.Finalmente, é mostrada uma sobreposição composta de campo claro e imunofluorescência, estabelecendo a localização do sinal fluorescente em relação às células e ao filtro. Aqui é apresentada uma imagem em seção transversal do nosso inserto de filtro, comparada às camadas epiteliais ductais de uma próstata intacta. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas semanas, com um isolamento final das células e do inserto de filtro ou da biomolécula desejada em menos de 30 minutos, se realizada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar sempre de ter cautela ao manipular os insertos de filtro, para que nenhum dano ocorra à camada celular ou ao filtro subjacente. Após este procedimento, outros métodos, como blotagens de Western, microarranjos de RNA e análises de proteoma podem ser realizados para responder perguntas adicionais relativas à análise de vias e células cancerígenas. Esta técnica ajudará a abrir caminho para pesquisadores na área do câncer de próstata explorarem melhor a biologia prostática, bem como os fundamentos do câncer de próstata, utilizando células prostáticas primárias.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma excelente compreensão de como configurar corretamente e recuperar células primárias de próstata cultivadas a partir deste sistema de cultura 3D.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Neste vídeo, demonstramos a cultura de células epiteliais isoladas da próstata de camundongo usando uma técnica de cultura baseada em anel de gel de matriz. Essa abordagem pode fornecer informações complementares sobre a capacidade de diferenciação das células epiteliais da próstata para formar estruturas glandulares 3D em resposta à manipulação genética ou farmacológica.

Ensaio de organoide de próstata: uma técnica de cultura ex vivo baseada em anel de gel de matriz para estudar a capacidade de diferenciação de células epiteliais da próstata

Adaptamos uma inserção de membrana microporosa permeável para mimetizar o microambiente tumoral (TME). O modelo consiste em uma cultura de células mistas, permite a geração simplificada de populações de células individuais altamente enriquecidas sem o uso de marcação fluorescente ou classificação de células e permite estudar a comunicação intercelular dentro do TME em condições normais ou de estresse.

A Mimic do microambiente do tumor: um método simples para geração de populações celulares enriquecidas e Investigando intercelular Comunicação

Este protocolo descreve como produzir células epiteliais de pigmento retinal (RPE) de células-tronco pluripotentes. O método usa uma combinação de fatores de crescimento e de pequenas moléculas para direcionar a diferenciação de células-tronco em RPE imaturo em catorze dias e RPE maduro e funcional, depois de três meses.

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

Camundongos geneticamente modificados são modelos úteis para investigar mecanismos de câncer de próstata. Aqui nós apresentamos um protocolo para identificar e dissecar os lobos da próstata de um sistema urogenital do rato, diferenciá-los com base em histologia e isolar e cultura primária de células da próstata em vitro como esferoides para análises a jusante.

Identificação, caracterização histológica e dissecação dos lobos da próstata do rato para em Vitro Spheroid 3D modelos de cultura

Aqui, apresentamos um protocolo para orientar a manipulação de organoides humano de próstata primário, em seguida, sugerir pontos de extremidade para avaliar o fenótipo. Semeadura, manutenção de cultura, recuperação de gel da matriz, quantificação morfológica, incorporação e seccionamento, FFPE seccionamento, toda a montagem coloração e aplicação de ensaios comerciais são descritos.

Manipulação e avaliação da cultura de organoides humano de próstata primário

Os organóides da próstata do rato representam um contexto prometedor para avaliar os mecanismos que regulam a diferenciação. Este artigo descreve uma abordagem melhorada para estabelecer organóides da próstata e introduz métodos para (1) coletar lysato de proteína de organóides e (2) corrigir e manchar organóides para microscopia confocal de montagem inteira.

Avaliando a capacidade de diferenciação das células epitelias da próstata do camundongo usando a cultura organóide

Apresentado aqui é um protocolo para estudar as respostas farmacológicas em organóides epitelia da próstata. Organóides se assemelham à biologia in vivo e recapitulam a genética do paciente, tornando-os sistemas modelo atraentes. Organóides da próstata podem ser estabelecidos a partir de próstatas wildtype, modelos de camundongos geneticamente modificados, tecido humano benigno, e câncer de próstata avançado.

Culturas organóides da próstata como ferramentas para traduzir genótipos e perfis mutacionais para respostas farmacológicas

Usando células epitelia de próstata primárias humanas, relatamos um novo método livre de biomarcadores de caracterização funcional de células semelhantes a troncos por um ensaio de retenção de rótulos à base de esferóides. Um protocolo passo a passo é descrito para a rotulagem de células BrdU, CFSE ou Far Red 2D; formação tridimensional de esferóides; identificação de células-tronco de retenção de rótulos por imunocitoquímica; e isolamento pela FACS.

Isolamento de células-tronco a partir de culturas esferóides tridimensionais

Este protocolo descreve um método para estabelecer um modelo in vitro de barreira hematoencefálica humana (BBB). As células endoteliais e os pericitos são semeados em cada lado de um filtro de inserção (compartimento sanguíneo), e os astrócitos são semeados no poço inferior (compartimento cerebral). O modelo caracterizado foi utilizado para experimentos de transporte de nanopartículas.

Um sistema celular de cultura tripla modelando a barreira hematoencefálica humana

Neste artigo, um novo inserto impresso em 3D é apresentado como um modelo de co-cultura e validado através do estudo da comunicação intercelular parácrina entre células endoteliais e queratinócitos.

Um inserto inovador impresso em 3D projetado para permitir culturas de células 2D e 3D diretas

Este protocolo fornece um procedimento abrangente para isolar, expandir e imortalizar fibroblastos de prostatectomias radicais. Além disso, descreve ensaios desenvolvidos para avaliar os efeitos funcionais da diafonia de células tumorais de fibroblastos, aproveitando tanto o tratamento com meio condicionado quanto a co-cultura.

Isolamento, cultura e caracterização de fibroblastos associados ao câncer de próstata

Aprenda um sistema de cultura 3D baseado em inserção de filtro para diferenciação rápida de células epiteliais prostáticas primárias humanas, permitindo isolamento eficiente de RNA, DNA e proteína para pesquisa em câncer de próstata.

Um sistema de cultura 3D baseado em Inserir Filtro Rápido para próstata primário Diferenciação Celular

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