Um sistema de cultura 3D baseado em Inserir Filtro Rápido para próstata primário Diferenciação Celular

O objetivo geral deste sistema de cultura 3D baseado em inserção de filtro para células primárias derivadas de pacientes é estabelecer um sistema modelo in vitro mais biologicamente relevante para a pesquisa do câncer de próstata. Ao usar células humanas primárias, esse método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia do desenvolvimento da próstata, bem como no câncer de próstata. A principal vantagem desta técnica é que é uma metodologia in vitro relativamente rápida para o estabelecimento de células primárias da próstata diferenciadas que também permite o rápido isolamento de biomoléculas como RNA, DNA e proteína.

A demonstração visual desses métodos é crítica, pois o processamento de células no inserto do filtro para histologia ou para coleta de RNA e proteínas é delicado e sensível ao tempo. Para ajudar a limitar a difusão entre as câmaras em um gabinete de segurança biológica, aplique uma fina camada de gelatina a 0,1% na parte inferior das inserções e deixe-as secar. Repita este procedimento mais duas vezes.

Em seguida, aplique as células na câmara interna das inserções revestidas de gelatina e cultive-as por até duas semanas. Após duas semanas, aplique os insertos de filtro cultivados diretamente em uma das aplicações apropriadas a jusante detalhadas a seguir. Para iniciar este procedimento, aspire o PBS da câmara externa e remova cuidadosamente o PBS da câmara interna.

As inserções cultivadas podem ser mantidas brevemente em PBS até que a aplicação esteja pronta para começar, mas não permita que a membrana seque. Em seguida, adicione 100 microlitros de 0,25% de tripsina EDTA a cada câmara interna. Em seguida, incube-os por cinco minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, raspe breve e cuidadosamente as células na superfície da membrana com uma pipeta de 200 microlitros enquanto pipeta para cima e para baixo. Em seguida, incube-os por um minuto a 37 graus Celsius. Após um minuto, adicione 250 microlitros de meio condicionado à primeira câmara interna e pipete para cima e para baixo suavemente para enxaguar o filtro.

Em seguida, transfira as células ressuspensas para a câmara de filtro adjacente que contém as mesmas condições de meio e repita a pipetagem para cima e para baixo. Repita este procedimento para cada uma das inserções de uma única condição. Em seguida, colete as células e transfira-as para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.

Enxágue cada câmara interna com mais 100 a 200 microlitros de meio condicionado para coletar as células restantes e adicione-as ao tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, gire as células em uma microcentrífuga a quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, aspire o sobrenadante e lave o pellet celular uma vez com 1.000 microlitros de PBS.

Gire as células novamente em uma microcentrífuga a quatro graus Celsius por cinco minutos. Após cinco minutos, aspirar o PBS e congelar a amostra a 80 graus Celsius negativos para utilização posterior. Neste procedimento, adicione 200 microlitros de guanidínio, tiocianato, fenol, clorofórmio ou reagente de extração semelhante à câmara interna e agite brevemente as células na superfície da membrana pipetando para cima e para baixo.

Em seguida, incubar as células no reagente de extracção durante cinco minutos à temperatura ambiente e deixar a câmara exterior seca. Em seguida, lave a membrana do filtro pipetando a solução de extração para cima e para baixo. Colete o máximo possível do reagente de extração inclinando a placa de seis poços e aspirando qualquer líquido residual.

Observe que o filtro pode se dissociar do inserto. Lave a membrana do filtro dissociada, se estiver conectada. Em seguida, colete o máximo possível do reagente de extração e siga o protocolo do fabricante para purificação e recuperação de DNA, RNA ou proteína.

Deve-se ter cuidado ao lavar as células e filtrar com tiocianato de guanidínio, pois a agitação excessiva pode produzir RNA de baixa qualidade. Para isolar a proteína do inserto do filtro, coloque o inserto do filtro na placa de seis poços no gelo. Em seguida, adicione 10 microlitros de tampão de lise de proteína à câmara interna.

Agite e raspe as células na superfície da membrana com uma pipeta de 20 microlitros enquanto pipeta para cima e para baixo e evite gerar bolhas no tampão de lise. Em seguida, incube a placa de seis poços com inserções de filtro no gelo por dez minutos. Repita a raspagem e depois enxágue a superfície da membrana com o tampão de lise.

Colete os lisados das seis inserções e transfira-os para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro no gelo. Em seguida, enxágue a primeira membrana com mais 10 microlitros de tampão de lise e transfira-a para o próximo filtro. Repita este procedimento para todas as inserções de uma determinada condição experimental, coletando qualquer solução tampão de lise residual e adicione ao tubo de 1,5 mililitro.

Incubar a amostra no gelo durante mais cinco minutos. Em seguida, gire-o na velocidade máxima por 15 minutos a quatro graus Celsius. Quando terminar, pipete o lisado em um novo tubo de 1,5 milímetro.

Em seguida, proceder à análise da concentração de proteínas ou armazenar os lisados a 80 graus Celsius negativos. Neste procedimento, adicione 500 microlitros e um mililitro de 10% NBF à câmara interna e externa, respectivamente. Incube-os durante a noite a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, aspire o NBF da câmara externa e adicione um mililitro de gel de processamento HEA a um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Derreta lentamente a agarose no micro-ondas usando baixa potência e repita os pulsos de 10 segundos até que a agarose derreta. Mantenha o HEA em um banho quente a 37 graus Celsius para evitar a solidificação até a hora de usar.

Em seguida, remova o NBF da câmara interna. Aplique 25 microlitros de HEA fundido na câmara interna e deixe a agarose solidificar por dois a cinco minutos. Em seguida, molhe duas almofadas de histologia de espuma em 10% NBF e coloque uma almofada em um de incorporação.

Proteger a integridade das camadas de células no inserto do filtro usando HistoGel é uma etapa crítica para a preservação da camada de células intacta para seccionamento histológico. Depois disso, use um bisturi de lâmina número 11 para marcar o filtro na parte inferior da câmara de inserção de plástico, soltando-o parcialmente. Coloque 100-200 microlitros de NBF em uma placa de Petri e mergulhe o filtro parcialmente desalojado no NBF.

Com um bisturi de lâmina número 10, pressione suavemente contra o meio do filtro de dentro da câmara de inserção para desalojar totalmente o filtro do cilindro de inserção. Se houver alguma parte do filtro que ainda esteja presa ao cano, corte-a com o bisturi. Em seguida, corte o filtro revestido com HEA ao meio.

Coloque cada metade do filtro na almofada de espuma no de histologia preparado. Em seguida, adicione a segunda esponja embebida em 10% NBF ao, imprensando o filtro. Em seguida, feche o.

Coloque-o em NBF e incube-o durante a noite. Esta imagem de campo brilhante mostra estratos celulares de várias camadas no topo da membrana porosa. As imagens fluorescentes individuais para núcleos, P63 e o receptor de andrógeno são mostradas, assim como a fusão de todos os três marcadores de fluorescência.

Finalmente, um campo brilhante composto e uma sobreposição de imunofluorescência são mostrados, estabelecendo a localização do sinal fluorescente em relação às células e ao filtro. Aqui é mostrada uma imagem transversal do nosso inserto de filtro, em comparação com as camadas epiteliais ductais de uma próstata intacta. Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em duas semanas, com um isolamento final das células e inserção do filtro ou da biomolécula desejada levando menos de 30 minutos, se realizada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante sempre lembrar de ter cuidado ao trabalhar com as inserções do filtro, para que não ocorram danos à camada celular ou ao filtro subjacente. Após este procedimento, outros métodos, como Western blots, microarray de RNA e análises de proteoma, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais relacionadas à análise de vias e células cancerígenas. Essa técnica ajudará a pavimentar o caminho para que os pesquisadores no campo do câncer de próstata explorem melhor a biologia da próstata, bem como os fundamentos do câncer de próstata usando células primárias da próstata.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma excelente compreensão de como configurar e recuperar adequadamente as células primárias da próstata cultivadas a partir deste sistema de cultura 3D.