Abstract
Bedingtes umprogrammiert Zellen (CRCs) eine nachhaltige Methode zur primären Zellkultur und die Fähigkeit, umfangreiche "living Biobanken" von Patienten abgeleiteten Zelllinien zu entwickeln. Für viele Typen von Epithelzellen, verschiedene dreidimensionale (3D) Kultur Ansätze beschrieben worden, die eine verbesserte differenzierten Zustand unterstützen. Während CRCs ihre Abstammung Engagement für das Gewebe zu halten, aus dem sie isoliert sind, versagen sie viele der Differenzierungsmarker mit dem Ursprungsgewebe assoziiert auszudrücken, wenn sie unter normalen zweidimensionalen (2D) Kulturbedingungen gezüchtet. Um die Anwendung von Patienten stamm CRCs für Prostatakrebs Forschung verbessern, ein 3D-Kultur-Format definiert wurde, die eine schnelle (2 Wochen insgesamt) luminalen Zelldifferenzierung in normalen und Tumor-abgeleitete Prostata-Epithelzellen ermöglicht. Hierbei wird ein Filtereinsatz basierten Format wird sowohl für die Kultivierung und Differenzierung von normalen und malignen Prostata CRCs beschrieben. A dedetaillierte Beschreibung der Zellenerfassung und -verarbeitung für immunhistochemischen und Immunfluoreszenzanfärbung erforderlichen Verfahren für vorgesehen sind. Zusammengefasst das 3D-Kultur-Format beschrieben, mit den primären CRC-Linien kombiniert wird, liefert einen wichtigen mittel- Durchsatz Modellsystem für High- Bioprobe-basierte Prostata Forschung.
Introduction
Die Identifizierung und Nutzung von Krebstherapien, die auf Einzelpersonen personalisiert sind ein vorrangiges Ziel in der Krebsforschung. Kürzlich wurden neue Konzepte entwickelt, die in die Einrichtung von primären Zellkulturen für größere Leichtigkeit ermöglichen, möglicherweise Weisen sowohl die Identifizierung und Prüfung personalisierten Therapien bieten. Zum Beispiel kann der R-spondin Basis Prostata organoiden Ansatz 1 für dreidimensionale (3D) Kultivierung von normalen und metastatischen Prostatakrebszellen in einer kommerziellen extrazellulären Matrix (beispielsweise Matrigel), während die Bedingter Reprogrammierung von Zellen (CRC) Verfahren an der Georgetown 2 entwickelt, nutzt 3 weitere Standard - 2D - Kulturbedingungen. Insbesondere führen die Kombination aus einem Rho - Kinase - Inhibitor (Y-27632) und bestrahlten J2 Maus - Fibroblasten - Feeder - Zellen auf unbestimmte Zeit Kultivierung von Keratinozyten CRCs 2. Die CRC-Methodik istextrem robust, mit primären Zelllinien erfolgreich etabliert und auf unbestimmte Zeit aus der Prostata und viele andere normalen und malignen epithelialen Geweben 3 gehalten. Wichtig ist, dass unsere CRC-Technologie für die schnelle Identifizierung der ursächlichen Basis für rezidivierende Atemwegs Papillomatose bei einem Patienten erlaubt, die eine Reihe von früheren medikamentösen Behandlungen versagt hatte. Darüber hinaus mit normalen und tumorabgeleiteten CRCs genehmigte die erfolgreiche Identifizierung eines FDA Droge, Vorinostat, wurde innerhalb von zwei Wochen nach der anfänglichen Gewebebiopsie gemacht. Der Patient wurde auf vorinostat platziert, in der erfolgreichen Behandlung ihrer Erkrankung 4 führt.
Die normale Prostata wird von Luminal, basal umfasste und den seltenen neuroendokrinen Zellen 5. Luminalen Zellen bilden die säulen Epithelschicht der Drüse und drücken den Androgen-Rezeptor (AR), sowie andere luminalen Marker wie Zytokeratine 8 und 18 und Prostate-spezifischen Antigens (PSA) 6. Im Gegensatz dazu sind die basale Zellen unterhalb der luminalen Schicht lokalisiert und Zytokeratin 5 und p63 exprimieren, aber geringe Mengen des AR 5. Wir haben 7, 8, 9 und andere 10 haben erfolgreich Prostata CRCs in präklinischen mechanistischen Arzneimittelempfindlichkeit Untersuchungen verwendet. Wenn jedoch unter Standard - 2D - Gewebekulturbedingungen gezüchtet, versagen diese Zellen vollständig AR Signalisierung 10 zu beteiligen. Wichtig ist gesetzt, wenn sie unter die Nierenkapsel von immungeschwächten Mäusen, gewann die CRCs normalen Prostatadrüsen Architektur und Funktion anzeigt, dass Prostata CRCs ihre Abstammung Engagement beibehalten, wenn sie in einer permissiven Umgebung platziert. Die Entwicklung des Filtereinsatzes basierenden Zellkultur hier beschriebene System ermöglicht eine schnelle (2 Wochen) in vitro Differenzierung von Prostata CRCs als belegt by die erhöhte Expression des AR und AR Zielgene sowie verringerte Mengen an p63.
Die Filtereinsätze verwendet werden, enthalten Polycarbonatmembranen (Porengröße 0,4 & mgr; m), die die Kultivierung von Säugetierzellen zu unterstützen. Das System, wie entwickelt, macht Gebrauch von normalen und malignen Prostata CRCs, 6-Well-Kulturschalen und die Filtereinsätze. Zellkulturmedien bedingt durch J2 - Zellen 11 ist in der unteren Kammer und der Prostata Differenzierungsmedien in der oberen Kammer angeordnet. Die hierin beschriebenen Techniken Prostata luminalen Zelldifferenzierung innerhalb einer 2-wöchigen Zeitraum, im Einklang mit den Zielen der personalisierten Medizin zu unterstützen. Es war auch zwingend notwendig, die Methoden zu entwickeln, die für die umfassende molekulare, genetische und zelluläre Profilierung der Kulturen ermöglichen. Ansätze zur Isolierung von DNA, RNA und Protein aus Zellen von der Filteroberfläche gelöst wurden für eine genaue Wiederholungsprobenverarbeitung entwickelt und rationalisiert. Finally, Einbettung zu ermöglichen, die Methode zum Entfernen des Filters erforderlich ist, Schneiden und für H & E, immunhistochemischen und Immunfluoreszenzfärbung wird vollständig beschrieben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Aufbau des 3D-Zellkultur Insert System
- Platzieren 2 Polycarbonat Zellkultureinsätze in einer umgekehrten Ausrichtung (Filterseite nach oben) nach unten in einer 6 - Well - Platte (1A).
- Tragen Sie eine dünne Schicht von 0,1% Gelatine in Wasser auf die Unterseite des Einsatzes und erlauben (10-20 min) in einem biologischen Sicherheitsschrank trocknen Sterilität aufrecht zu erhalten.
- Wiederholen Sie Schritt 1.2 zwei weitere Male für insgesamt 3-Anwendungen von 0,1% Gelatine auf die Einsätze.
HINWEIS: Die Gelatinebeschichtung Grenze Diffusion zwischen den Kammern helfen. - Um die primäre CRCs von Standardkulturbedingungen sammeln, 5 ml PBS, die Kulturflasche zu waschen.
- Trypsinize die Zellen unter Verwendung von (1 ml für eine T-25 und 2 ml für eine T-75) 0,25% Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C. Klopfen Sie leicht auf die Seite des Kolbens in Verdrängen der Zellen zu unterstützen. Dann gehen die Trypsin Reaktion zu stoppen und die Zellen zu sammeln, indem 5 ml komplettem DMEM.
- Sammeln die Zellen in ein 15 ml Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4 ° C und 188 xg und zählen eine automatisierte Zellzähler oder eine Zählkammer.
- Re-suspend 600.000 CRCs in 250 & mgr; l konditioniertes Medium (CM) und zu der richtig ausgerichtet (Filterseite nach unten) Kultureinsatz (Abbildung 1B). Dies wird bezeichnet als die innere Kammer.
Anmerkung: CM ist F-Medien durch bestrahlte J2 - Zellen konditioniert und enthält 10 & mgr; m Y-27632 , wie vorstehend beschrieben , 7, 8, 9, 11.
- Bewerben 2 ml CM in die äußere Kammer des 6-Well-Platte und Inkubation über Nacht bei 37 ° C (für mindestens 18 h).
- Entfernen Sie vorsichtig die CM auf der inneren Kammer mit einer 1 ml oder 200 & mgr; l-Pipette und langsam Differenzierungsmedium (DM) in die innere Kammer mit einer 1-ml-Pipette bis zur vollständigen hinzuzufügen. Seien Sie vorsichtig, um nicht die Zellschicht stören.
- Überprüfen Sie jeden Tag die Kulturen. Gesunde Zellen erscheinen , wie in Abbildung 2 dargestellt.
- Ändern des CM in der äußeren Kammer jeden Tag oder jeden zweiten Tag in Abhängigkeit vom Stoffwechsel der Zellen.
- Wenn die Medien der inneren Kammer ändert sich die Farbe (gelb), sorgfältig die Medien auf der inneren Filterkammer zu entfernen mit einem 1 ml oder 200 & mgr; l-Pipette.
- Saugen Sie das Medium in der Kammeraußen 6-Well-Platte mit einem saugenden Spitze.
- Unter Verwendung einer 1 ml Pipette gelten langsam frisch DM in die innere Kammer bis zur vollständigen. Achten Sie darauf, nicht zu kratzen oder auf andere Weise die Zellschicht entfernen.
- Ersetzen Sie die Medien in die äußere Kammer mit 2 ml frischem CM.
- Pflegen die Kulturen für 2 Wochen und dann die Verarbeitung für die gewünschte Isolations bimolekularen fortzufahren.
HINWEIS: Jede Zeile in der 6 - Well - Platte, insgesamt sechs Einsätze (Abbildung 1B), sollte pro Experiment verarbeitet werden , um genügend Zellen für die DN zu erwerbenA, RNA oder Protein, für die Analyse. - Aspirat Medien in der äußeren Kammer und Spülen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Sorgfältig Medien aus der inneren Kammer mit einer 1 ml Pipette oder 200 & mgr; l zu entfernen und 500 & mgr; l PBS hinzu. Vermeiden Abkratzen oder anderweitig stören die Zellen auf der Membran.
- Aspirat PBS von der äußeren Kammer und vorsichtig PBS aus der inneren Kammer mit einer 1 ml oder 200 & mgr; l-Pipette entfernen. Sobald die PBS entfernt wurde, gehen direkt an die entsprechende Anwendung weiter unten beschrieben. Nicht in die Membran austrocknen. Die Kultur kann kurz in der PBS gehalten werden, bis die Anwendung bereit ist, zu beginnen.
3. Die Verarbeitung der Filter für die Pellet-Banking
- Füge 100 & mgr; l 0,25% Trypsin-EDTA zu jeder Innenkammer und Inkubieren bei 37 ° C für 5 min.
- Kurz und vorsichtig rühren / kratzen die Zellen auf der Membranoberfläche mit einer 200 & mgr; l Pipette beim Pipettieren nach oben und unten (vermeiden puncTuring die Membran). Inkubieren für 1 min bei 37 ° C.
- Fügen Sie 250 ul von CM zu der ersten inneren Kammer und Pipette nach oben und unten vorsichtig den Filter zu spülen.
- Transfer-Zellen zu der benachbarten Filterkammer resuspendiert, die dieselben Medienbedingungen enthält und wiederholen Auf- und Abpipettieren.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden der Einsätze aus einem einzigen Zustand. Sammeln und zu transferieren Zellen in ein 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen.
- Spülen jede innere Kammer mit einer zusätzlichen 100-200 uL CM alle verbleibenden Zellen zu sammeln. In den 1,5 ml Zentrifugenröhrchen in Schritt 3.5.
- Dreh die Zellen bei 423 · g in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 5 min.
- Den Überstand aspirieren und waschen einmal das Zellpellet mit 1000 ul PBS.
- Spin wieder bei 423 xg in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 5 min.
- Absaugen PBS und Einfrieren bei -80 ° C für die spätere Verwendung.
4. Die Verarbeitung der Filter für die RNA oder DNA-Isolierung
- Da der Filter aus dem Einsatz distanzieren kann, waschen Sie die distanzierte Filtermembran durch Auf- und Abpipettieren der Extraktionslösung. Sammeln Sie so viel des Extraktionsreagenz wie möglich durch die 6-Well-Platte Kippen und Restflüssigkeit abgesaugt.
5. Die Verarbeitung der Filter für die Proteinisolierung
- Setzen Sie den Filtereinsatz in der 6-Well-Platte auf Eis. Zu der inneren Kammer, mit 10 ul Puffer Protein Lyse, supplementiert mit 1 mM Natriumfluorid (NaF), 1 mM Natriumvanadat (NaV), 100 mM dithiothreITOL (DTT) und 100 & mgr; l anti-Protease-Cocktail.
- Rühre / kratzen die Zellen auf der Membranoberfläche mit einer Pipette 20 ul beim Pipettieren nach oben und unten. Vermeiden Blasen in dem Lysepuffer erzeugen.
- Inkubieren Sie die 6-Well-Platte mit Filtereinsätzen auf Eis für 10 min.
- Wiederholen Sie kratzen und dann spülen Sie die Membranoberfläche mit dem Lysepuffer.
- Sammeln Sie die Lysate aus den 6-Einsätze und Transfer in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis.
- Spülen der ersten Membran mit zusätzlichen 10 & mgr; l Lysepuffer und Transfer zum nächsten Filter.
- Wiederholen Sie Schritt 5.6 für alle Einsätze, restliche Lyse-Pufferlösung zu sammeln und zu der 1,5 ml-Röhrchen (Schritt 5.5).
- Inkubieren Sie die Probe auf Eis für weitere 5 min.
- Spin bei maximaler Geschwindigkeit (16.873 xg in einer Tischzentrifuge) für 15 min bei 4 ° C.
- Pipette Lysatüberstand in ein frisches 1,5 ml-Röhrchen.
- Fahren Sie mit der Analyse der Proteinkonzentration oder store Lysate bei -80 ° C.
6. Verarbeitung für H & E und Immuno-Färbung
- Fügen 500 ul und 1 ml 10% NBF (neutral gepuffertes Formalin) zu der inneren und der äußeren Kammer und ließ über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
- Absaugen NBF von der äußeren Kammer und 1 mL hydroxyethyl Agarose (HEA) Verarbeiten Gel auf eine 1,5-ml-Zentrifuge. Langsam schmelzen die Agarose in einem Mikrowellen niedriger Leistung mit und 10-20 s Impulse wiederholt, bis die Agarose geschmolzen ist.
- Halten Sie die HEA in einem 37 ° C warmen Bad Erstarrung zu verhindern, bis sofort einsatzbereit.
- Entfernen Sie die NBF aus der inneren Kammer und anzuwenden 25 ul geschmolzenes HEA in die innere Kammer und damit die Agarose für 2-5 min verfestigt.
- Wet 2 Schaum Histologie Pads in 10% NBF und legen Sie ein Pad in einer Einbettungskassette (siehe 3D).
- Verwenden Sie ein # 11 Klinge Skalpell (was eine sehr scharfe hat, fein spitzer Klinge), um den Filter von der Unterseite des Einsatzes zu punktenKammer, indem Sie sie teilweise aus der Kunststoffeinsatz Kammer.
- Legen Sie eine kleine Menge (100-200 ul) NBF in einer Petrischale und tauchen Sie den teilweise verdrängt Filter in der NBF (3A).
- Mit einem # 10 Skalpellklinge, drücken leicht gegen die Mitte des Filters, von der Innenseite des Einsatzkammer, um vollständig den Filter aus dem Einsatz barrel (3B) entfernen. Wenn es irgendein Teil des Filters ist, die noch an der Trommel angebracht ist, trennen sie mit dem Skalpell.
- Schneiden Sie die HEA-beschichteten Filter in der Hälfte mit dem # 10 Klinge Skalpell (3C).
- Platzieren Sie jede Hälfte des Filters auf das Schaumstoffpolster in der Kassette Histologie vorbereitet in Schritt 6.4 (3D).
- In den zweiten 10% NBF getränkten Schwamm in die Kassette, zwischen denen die Filter.
- Snap-Siegel der Kassette, in NBF und über Nacht inkubiert.
- Prozessfilter in Paraffinblöcke für das Schneiden und Färben alszuvor beschrieben 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der Zellkultureinsatz basiertes System ist ein relativ einfaches und schnelles Verfahren für die 3D-Kulturen von Prostata-CRCs produzieren, die luminale Zelldifferenzierung unterstützt. Eine schematische Darstellung des Systems gezeigt (Abbildung 1A) , die Anwendung der Gelatinebeschichtung an der unteren Oberfläche des Filtereinsatzes hervorhebt. Die Einsätze sind nur für die Anwendung der Gelatine umgeworfen. In 1B sind die Filter in der geeigneten Orientierung für die Kultivierung. Mit Hilfe einer transparenten Zelle einfügen, ein repräsentatives Bild einer gesunden Prostata 3D CRC Kultur gezeigt (10X) (Abbildung 2). Die dichte Schichtung von gesunden CRCs gezeigt ist typisch nach Einrichtung und können mit Standard-Lichtmikroskopie sichtbar gemacht werden. Während der anfänglichen Einrichtung, ist es entscheidend, um die Schicht von Zellen, um sicherzustellen, gebildet zu visualisieren, dass das Verfahren mit einer bestimmten Zelllinie kompatibel ist und dass geeignete Befestigung und laYering von Zellen aufgetreten sind.
HEA ist an der Innenseite des Einsatzes aufgebracht, wie oben beschrieben. Nach dem Aufbringen der HEA muss darauf geachtet werden , wenn die Filter scoring es aus dem Einsatz (3A, 3B) zu entfernen. In allen Schritten (3A-3D), muss darauf geachtet werden auch auf dem Filter mit Zellen zu minimieren unnötige Bewegung der HEA Schicht ausgeübt werden. Die CRC - Schicht kann leicht während der Übertragung auf die H & E - Kassette (3D) gestört und beschädigt werden. Nach Exzision des HEA beschichtete Filter aus dem Kunststoffgehäuse (3A-3C), kann der Filter halbiert und zur Sektionierung und Färbung unter Verwendung von Standardeinbettungs Kassetten (3D) verarbeitet werden. den Filter in zwei Hälften teilt ist wichtig, die zur Verfügung stehende Fläche für Querschliff auf H & E und IF zu maximieren.
Immunofluoreszenzfärbungsowie Hellfeld (BF) Bilder der kultivierten Zellen auf der Filterschicht wurden unter Verwendung eines Mikroskops mit DSU (Disk Scan Unit) Drehscheiben-konfokale Fähigkeiten gesammelt. Repräsentative Ergebnisse für die Histologie und H & E - Färbung sind in einem Querschnitt des Filtereinsatzes und Zellen (20X) (Figur 4) gezeigt ist . Mit der richtigen Pflege, zeigen wir, dass eine CRC-Schicht auf den Filtereinsätze geschnitten werden kann und fleckig, wie gängige Praxis für die Gewebe Histologie. Während des Schneidens ist es möglich , dass die CRCs aus dem Filter als intakte Schicht aus Zellen abgelöst zu werden , wie gezeigt (Figur 4). Das BF Bild zeigt mehrschichtige Zellschichten auf der Oberseite der porösen Membran (5A). Die einzelnen Fluoreszenzbilder für Kerne (DAPI, 5B), p63 (Figur 5C) und die AR (5D) gezeigt, wie die Zusammenführung aller drei Fluoreszenzmarker (5E). Schließlich ist ein composite BF und IF - Overlay (5f Bild) gezeigt wird , die Lokalisation des Fluoreszenzsignals relativ zu den Zellen und dem Filter herzustellen. Die Überlagerung der DAPI-Färbung mit dem p63 IF-Färbung zeigt deutlich einige Zellen noch in einem proliferativen Zustand. Die Lokalisierung von AR IF-Färbung im Zellkern ist ein Hinweis auf funktionelle Reaktivierung von AR in Prostatazellen.
Ein Vergleich zwischen der IF unserer Filtereinsatz System und einem Prostatagewebe geschnitten dargestellt (6A, 6B) , um die Ähnlichkeit in der Entwicklung unserer CRC Einsatzschicht zu der des Prostata - Epithel zu demonstrieren. Die Prostata Kanal zeigt die Expression von p63, im Einklang mit der Prostata basalen Zellen. p63-Färbung wird auch in den CRCs an dem Einsatz gesehen. Eine höhere p63 Prozentsatz Zellen exprimiert, wurde in unserem Einsatz im Vergleich zum intakten Gewebeschnitt beobachtet. Darüber hinaus sind sowohl Kern- und cytoplasmatische AR sind in der Prostata tis gesehen Abschnitt klagen und während die CRCs auf dem Filtereinsatz zeigen insgesamt weniger AR Ausdruck, sowohl nukleare als AR-Expression und zytoplasmatische Färbung ist zu sehen, ähnlich wie bei der intakten Prostata.
Abbildung 1: Repräsentative Bilder der 6-Well - Kulturschale und einfügen, um das 3D Culture System enthalten. (A) Inverted Einsätze zum Aufbringen der Gelatinebeschichtung auf die Unterseite des Filters (Pfeil). Ein größeres Bild des Einsatzes und Filter zeigen (kleines Bild). (B) richtig platziert Einsätze. Die inneren und äußeren Kammern des Systems gezeigt sind (Pfeile). Die boxed Reihe in B zeigt, wie mehrere Proben werden für einen bestimmten experimentellen Bedingungen erhalten. Am Ende der 2 Wochen Wachstumszeit diese Einsätze können gebündelt werden, um ausreichend Material für die Analyse zu erhalten."Target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: ein repräsentatives Bild von einer Schicht von gesunden CRCs Gesetzt auf eine transparente Filter Membrane gezeigt. Inneren und äußeren Kammern enthaltenen konditionierten Medien. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: ein repräsentatives Bild eines Filters Halbierte in zwei Abschnitte und in eine Paraffin Kassette für Embedding. (A) Filtereinsatz mit HEA Beschichtung nach dem Ritzen und vor dem Entfernen. (B) Das freigesetzte Filtereinsatz aus dem Polycarbonat barrel. (
Abbildung 4: Eine repräsentative H & E Stained Querschnitt des Filtereinsatzes und Zellen (20X). Sowohl die Membran (unten) und Zellschicht (oben) gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Eine Reihe von repräsentativen Hellfeld (BF) und Immunfluoreszenz (IF) BilderDie Zellen Teilte auf dem Filter (40X). Querschnitte der Filter und Zellen gezeigt. Eine ungefärbte BF Bild der Zellen auf der Filteroberfläche (5A) von Bildern für das DAPI gefärbt Kern (5B) und Immunfluoreszenzfärbung für zwei verschiedene Proteine, p63 (5C) und dem Androgen Rezeptor (AR, 5D) begleitet. Eine zusammengesetzte Überlagerung der Zellabschnitte (5E, F) definiert Lokalisierung der ZF - Signale im Zusammenhang mit den Zellen und Filter. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Eine repräsentative Immunfluoreszenz (IF) Bild von Zellen auf dem Filter im Vergleich zu einem Abschnitt von Prostata - Epithel von Gewebeteilte (20X).Ein Querschnittsbild der Filtereinsatz gezeigt (6A) im Vergleich zu den duktalen Epithel - Schichten einer intakten Prostata (6B). Die Färbung von p63, die AR und der Kern wurde wie in Figur 5 durchgeführt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Primäre Zelllinien sind ein wichtiges und sich schnell entwickelnde Plattform für die Krebsforschung. Die Kultureinsatz-basierte 3D-Kultursystem unterstützt die Differenzierung von primären Prostata CRCs innerhalb einer zweiwöchigen Frist. Der CRC-Filter-Methode stellt eine neue, mittlere Durchsatzverfahren für Prostata-Forschung. Bestehende Maus PDX-Modelle sind zeitaufwendig und extrem teuer, und viele der PDX Proben nicht in Kultur gezüchtet werden, Forschern initiierte Experimente und ihre Nützlichkeit begrenzen. Darüber hinaus, während die Erfolgsraten PDX der Einrichtung stark variieren 13 weist die CRC - Methode eine hohe Erfolgsrate in Zelllinien 3 herzustellen. Wir betrachten unser System mit dem R-spondin-basierten Prostata organoiden Ansatz ergänzen; jedoch ein Mangel an Erfolg im Hinblick auf die Einrichtung von Organoiden von primären Prostatakrebs wurde 14 berichtet. Zusätzlich ist die Medien, die Methoden der Einrichtung,und Wartung von CRCs sind wesentlich einfacher als die R-spondin-basierten Prostata organoiden Ansatz. Als zusätzlichen Vorteil können die CRCs etabliert und zur direkten molekularen Vergleiche Kulturen zu testen abgestimmt normalen und Tumor verwendet werden.
Einige technische Probleme müssen angegangen werden, wenn dieses System zu etablieren. Erste aufgebrachte Gelatinebeschichtung an der Unterseite des Filtereinsatzes hilft, aber nicht beseitigt, Diffusion der Medien über die Membran. Häufige Wechsel des Prüfmediums werden verwendet , um die jeweiligen Gradienten der Differenzierung (obere oder apikalen Zellschicht) vs Wachstum (untere oder basalen Zellschicht) die Bedingungen innerhalb der Kammer zu halten. Zweitens benötigt erfolgreiche 3D-CRC Kulturen eine relativ hohe Zellansiedlungsdichte. Niedrigere Einsaatdichten ergab schlechte Ergebnisse im Hinblick auf die Integrität der Zellschicht, die auf der Filteroberfläche entwickelt. Dies ist eine gemeinsame Überlegung bei der CRCs Kultivierung, wie sie am kräftigsten wachsen, wenn ein beibehaltent hohe Zelldichten. Schließlich wurde die richtige Entnahme und anschließende Paraffineinbettung der intakten Zellschicht entscheidend für das Ausmaß der Zelldifferenzierung zu definieren. Die Zugabe von hydroxyethyl Agarose (HEA) beide Zellenverlust verringert und verbessert die Gesamtmorphologie der verglichenen Zellen nicht eingebetteten Filter (nicht gezeigt). Einmal richtig eingebettet wurden die Filter geschnitten und in einer Art und Weise zu unterscheiden von typischen Zell- und Gewebeproben verarbeitet.
Wir beginnen gerade die Architektur des Prostata-Epithel-Methode, diesen Filter zu emulieren. Zusätzliche Modifikationen der Kulturbedingungen auf Medien und auf das Substrat sind gerechtfertigt, die leicht behandelt werden kann. Beispielsweise umformuliert Differenzierungsmedien, die besser luminalen vs basal Differenzierung fördern kann schnell überprüft werden kann. Seit lentivirale Infektion von CRCs ist so einfach wie mit kommerziellen Krebszellen 7 und der 2D - CRCs haben al durchgeführt worden istso wurden mit CAS9 / CRISPR Gen Bearbeitungstechnologie Vektoren transfiziert, um dauerhaft das Zellgenom (Daten nicht gezeigt) zu verändern, um die Wirkung von mutiertem, gelöscht oder repariert Gene getestet werden können. In ähnlicher Weise kann lineage Tracking möglich gemacht werden, indem Linie spezifische Reportergene einzuführen.
Zusätzlich zu den Medien zu verändern, oder die Zellen, Veränderungen an der Filteroberfläche auch getestet werden können. Verschiedene Filtermembran Substrate sind im Handel erhältlich. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die kommerzielle extrazelluläre Matrix eine geeignete Wachstumsumgebung bereitstellt, wenn an der Innenseite des Filters aufgetragen. Da eines der Ziele des Einsatzsystems besser ist, die Prostata-Mikroumgebung zu modellieren, vielleicht die interessantesten Modifikationen könnte die Einführung von normalen oder Tumor-abgeleiteten Stromazellen, entweder in Co-Kultur mit den CRCs innerhalb der Grenzen des Einsatzes oder in der unteren Kammer das Wachstumsmedium zu konditionieren. Ändern Sie den Einsatz auch mit Abschnitten of dezellularisierte Prostatagewebe ist ebenfalls möglich. Bei diesem Ansatz stromal / epithelialen Wechselwirkungen könnten die primären Zellen ermöglichen, die dezellularisierte Gewebe als ein Gerüst für das Wachstum zu verwenden.
Die Fähigkeit, Primärzellen herzustellen und anschließend die Bedingungen für ihre Differenzierung bieten ist ein ideales Format für biologisch relevante Forschung in normale Drüsenentwicklung und für die Krebsforschung. Das beschriebene System bietet hier eine Plattform, durch die eine unbegrenzte Anzahl von Zelltypen und Modifikationen kombiniert werden können, um das System auf individuelle experimentelle Bedürfnisse zuzuschneiden und um zuverlässig die Proben für Analysen sammeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von T32 (CA 9686-18) und TL1 (TL1TR001431) Postdoc-Stipendium Auszeichnungen (LT), DOD PC140268 (CA) unterstützt, W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA) sowie U01 PAR-12-095 (Kumar) und P30 CA051008-21 (Weiner). Beispiel Fixierung, Schneiden und Färben wurde in der Lombardi Comprehensive Cancer Center Histologie und Tissue Shared Resource ausgeführt. Wir danken Richard Schlegel für hilfreiche Diskussionen. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position des National Cancer Institute oder dem National Institutes of Health vertreten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 | |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 | |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 | |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 | |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 | |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 | |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 | |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 | |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 | |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z | |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 | |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
References
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Yuan, H., et al. Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).
- Signoretti, S., et al. p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).
- Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T.
- Ringer, L., et al. The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).
- Pollock, C. B., et al. Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).
- Crogliom, M., et al. Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair. Oncotarget. , (2016).
- Saeed, K., et al. Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer. Eur Urol. , (2016).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. J Vis Exp. (99), e52868 (2015).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
