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Artigo de método

Identificação de sequências de localização Plasmodesmal em proteínas em Planta

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DOI:

10.3791/55301

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15 de agosto de 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York, 2Department of Plant Pathology and Plant-Microbe Biology, Cornell University

Neste artigo

Resumo

Planta de conexões intercelulares, os dictiossomos (Pd), desempenham um papel central na planta de interações planta-vírus e fisiologia. Crítica para o transporte de Pd está classificando os sinais que dirigem proteínas à polícia. No entanto, nosso conhecimento sobre estas sequências é ainda em sua infância. Nós descrevemos uma estratégia para identificar sinais de localização de Pd em proteínas Pd-alvo.

Resumo

Dictiossomos (Pd) são ligações de celular para celular que funcionam como gateways através do qual moléculas pequenas e grandes são transportadas entre células vegetais. Considerando que o transporte de Pd de pequenas moléculas, como íons e água, presume-se ocorrer passivamente, célula a célula transporte de macromoléculas biológicas, tais proteínas, provavelmente ocorre através de um mecanismo ativo que envolve os sinais de direcionamentos específicos sobre o molécula transportada. A escassez de sinais de localização de dictiossomos identificados (Pd) (PLSs) restringiu severamente o entendimento de proteína-classificação vias envolvidas na planta transporte macromolecular de célula para célula e comunicação. De uma riqueza de planta endógenas e virais proteínas conhecidas para o tráfego por meio de Pd, PLSs apenas três foram relatados até à data, todos eles de proteínas vegetais endógenos. Assim, é importante desenvolver uma estratégia experimental sistemática e confiável para identificar uma sequência PLS funcional, que é necessário e suficiente para o direcionamento de Pd, diretamente no vivo células vegetais. Aqui, descrevemos uma tal estratégia usando como um paradigma da proteína de célula para célula de movimento (MP) do vírus do mosaico do tabaco (TMV). Estas experiências, que identificaram e caracterizam a primeira planta PLS viral, pode ser adaptadas para descoberta de PLS sequências em proteínas mais Pd-alvo.

Introdução

Dictiossomos (Pd) funcionam como condutos para transporte intercelular dos reguladores chaves do desenvolvimento da planta e morfogênese, variando de fatores de transcrição de mRNA e pequenas moléculas de RNA. Além disso, esta capacidade de transporte macromolecular da DP é utilizada pela maioria dos vírus de planta para sua propagação intercelular durante a infecção; para mover-se através de Pd, vírus de plantas evoluíram proteínas especializadas, denominadas proteínas de movimento (MPs), que visam especificamente a Pd1,2,3,4,5,6 , 7. vias moleculares de transporte Pd provavelmente estão intimamente interligadas com as sequências específicas que visam as proteínas transportadas para essas vias. Assim, a identificação destes sinais de localização do Pd (PLSs) pode ser diagnóstica da via de transporte correspondente do Pd. Isto é por analogia de Pd transporte8, por exemplo, a importação nuclear diferentes vias, que podem ser específicas para diferentes localização nuclear (NLS) de sinal sequências9,10. Conceitualmente, tanto NLSs e PLSs representam não-cleavable subcellular direcionamentos sequências que são necessárias e suficientes para o direcionamento. No entanto, ao contrário de NLSs11, as informações de sequência sobre PLSs são severamente limitadas. Especificamente, somente quatro sequências de proteínas envolvidas no direcionamento de Pd têm sido relatadas, com todos eles derivados de proteínas vegetais endógenos. O primeiro deles é representado por um domínio homeobox KN112 – um factor de transcrição que se move de camadas celulares interna a epiderme da planta folha13 – e sua KNOX homologs14. O segundo também é de um fator de transcrição, Dof, que contém um putativo PLS descrito como o tráfico intercelular (IT) motivo15. A terceira sequência é da proteína de membrana PDLP1 residente dictiossomos tipo 1, e é representado por um domínio transmembrana16. Finalmente, o quarto Pd segmentação sequência foi relatado recentemente para glicosilfostidilinosiol (GPI)-proteínas ancoradas e é representado por glicosilfostidilinosiol (GPI) modificação sinal17.

Curiosamente, até muito recentemente, nenhum PLSs têm sido relatados para MPs virais. Estudos anteriores indicaram a presença de sequências de PLS putativos em planta viral MPs18,19, mas não PLS verdadeiro, ou seja, uma sequência de aminoácidos mínima necessária e suficiente para o Pd direcionamento de uma carga independentes molécula ( ex., PCP) foi identificada em um MP viral. Ainda uma destas proteínas, MP do vírus do mosaico do tabaco (TMV), foi o primeiro para que a polícia de localização e transporte tem sido demonstrada20.

Para resolver esta lacuna, desenvolvemos uma estratégia experimental para identificar TMV MP PLS. Esta estratégia foi baseada em três conceitos. (i) definimos PLS como uma sequência de aminoácidos mínima necessária e suficiente para o direcionamento de proteína para Pd21. (ii) porque TMV MP visa primeiro Pd e translocates então através destes canais,22, que visa desatrelar essas duas atividades e identificando o PLS bona fide, que funciona apenas para o direcionamento de Pd e não para o transporte subsequente. (iii) foram analisados o PLS identificado por resíduos de aminoácidos importantes para a sua polícia visando a atividade, seja estrutural ou funcionalmente. Usando essa abordagem, nós delineado uma sequência de 50 amino ácido resíduos no amino-terminal do TMV MP que atua como PLS bona fide. Isto foi feito por produzir uma série de fragmentos de TMV MP que saturado de todo o comprimento da proteína, etiquetando seus carboxila-termini com PCP e transitoriamente expressá-los em tecidos vegetais. Localização de PD de cada um dos fragmentos testados foi determinada por coexpressing-los com uma proteína de marcador de Pd, PDCB1 (Pd callose proteína 1)23. O fragmento menor que ainda localizada, Pd, mas não atravessar Pd, considerou-se para representar o PLS. Finalmente, o PLS era alanina-digitalizadas para determinar os resíduos de aminoácidos chave necessários para sua estrutura e/ou função.

Considerando que aqui ilustramos esta abordagem descrevendo a identificação de TMV MP PLS, podem ser empregada para descobrir PLSs em qualquer outras proteínas Pd-alvo, se codificado por patógenos vegetais ou pelas plantas Isso ocorre porque nosso método não leva vantagem de quaisquer características únicas de MPs virais com relação à sua capacidade de alvo para Pd.

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Protocolo

1. Material vegetal

  1. Escolha de espécies de plantas
  2. Use as espécies de plantas nativas à proteína de interesse, ou seja, um que codifica esta proteína para proteínas endógenas ou que representa o hospedeiro natural para o patógeno para proteínas virais. Além disso, as espécies de plantas selecionadas devem ser passíveis do método de escolha de transformação genética transitória.
    Nota: Os estudos empregam rotineiramente Nicotiana benthamiana, que representa um bom anfitrião para TMV e é transformado de forma eficiente pela técnica de transformação genética mediada por Agrobacterium, i.e., agroinfiltration (ver passo 3). Plantas de s. benthamiana também são facilmente cultivadas e tem folhas grandes, que são facilmente inoculadas por Agrobacterium e facilmente analisadas por microscopia confocal.
  3. Crescimento de planta
    1. Plante sementes de s. benthamiana em solo molhado em alta densidade. Mantê-los em uma câmara de ambiente controlado em 20-25 ˚ c Membros abaixo dos 16 h de luz em ~ 75 µmol fótons m-2 s-1 e 8 h de escuridão. Depois que o diâmetro de euphyll atinge 0,5 cm, cuidadosamente transferir as mudas para vasos maiores e continuar o crescimento da mesma Câmara nas mesmas condições.
    2. Manter as plantas até que eles cresçam para estágio 4-8-folha dentro de 4 semanas, quando as folhas maiores são 4-6 cm de diâmetro; neste momento, eles podem ser usados para agroinfiltration (ver passo 3).
      Nota: Importante, nunca use as plantas se começaram a flor porque, nesta fase do desenvolvimento, a arquitetura de folha varia frequentemente24,25, às vezes levando a resultados inconsistentes.

2. construção de vetor de expressão

  1. Escolha do sistema de expressão
    1. Escolha a expressão sistema, i.e., vetores e vetor método de entrega, mais adequado para a expressão da proteína de interesse nas espécies de plantas estudadas.
      Nota: Ocasionalmente, tais combinações específicas das espécies testadas proteína/planta podem exigir vetores específicos e vetor método de entrega para a expressão ideal e função da proteína de interesse. Para plantas dicotiledónias mais, no entanto, selecione binários plasmídeos como vetores de expressão e agroinfiltration como sistema de entrega.
  2. Marcação de proteínas fluorescentes
    1. Etiqueta fluorescente cada proteína expressa para análise de sua distribuição subcellular22, incluindo a localização do Pd.
      Nota: Empregar autofluorescent proteínas, tais como o PCP e DsRed2, como etiquetas. Tag da proteína testada com PCP e coexpress-lo com um DsRed2 livre. Funções de PCP como marca e como uma molécula de carga não relacionado a vírus. DsRed2 funções para calibrar a eficiência global da expressão transiente e, porque é célula autónomos, para identificar a célula inicialmente transformada; Esta última função é importante, ao avaliar o movimento de célula para célula de proteínas testadas potencialmente não-celular-autónomos. Para coexpression com o marcador de Pd PDCB1, que também é celular autónomos, marca a proteína testada com PCP e PDCB1 com DsRed2.
    2. Como regra geral, fundem-se a marca de autofluorescent para a carboxila-terminal da proteína expressa. No entanto, se as exposições de etiquetado proteína testado completos comprometida Pd direcionamento, transferi a tag para o amino-terminal da proteína.
    3. Clone as sequências de codificação das proteínas a ser testado em um vetor de expressão de instalações apropriadas.
      Nota: Existem muitos vetores de expressão de diferentes plantas que permitem a marcação fluorescente. Usamos uma série de pSAT plasmídeos26 ou alguns dos seus derivados27,28, que são apropriados para a clonagem da sequência de interesse diretamente no frame com as tags sugeridas autofluorescent (consulte a etapa 2.2.1) em ambos os amino- e orientações de carboxila-terminal.
    4. Transferi cada gaveta de expressão em um vetor binário de Agrobacterium.
      Nota: Embora baseado no pSAT construções são apropriadas para entrega de peroxidação direta nos tecidos vegetais, agroinfiltration, que é o método de transformação aqui recomendado (ver passo 3), exige que a gaveta de expressão a ser localizada entre o T-DNA as fronteiras de um binário vetor29.
      Nota: Todos os vetores de pSAT foram projetados para permitir essa transferência para o pPZP-RCS2 expressão multigene vetor binário26,30 clonando um passo a passo usando nucleases de corte raro ascos, PpoI-eu, eu-SceI, CeuI, PspI-PI e PI-TliI 26. pesquisadores que preferem utilizar a clonagem recombinatório, por exemplo, usando heteróloga salmão sites31, podem-se empregar pSAT vector variantes26,27.
    5. Para coexpression, transferir as duas fitas de expressão, por exemplo, proteína-PCP testado e DsRed2 ou proteína-PCP testado e PDCB1-DsRed2 (ver passo 2.1), para o mesmo vetor binário de pPZP-RCS2.
      Nota: Alternativamente, culturas de Agrobacterium abrigar construções binárias individuais podem ser misturadas juntos para infiltração de s. benthamiana (ver passo 3.1).

3. Agroinfiltration

  1. Adicionar 1 µ g de um plasmídeo baseados em pPZP-RCS2 de cultura de passo 2.2.5 para 100 µ l de células competentes da estirpe de Agrobacterium tumefaciens EHA105 ou GV3101 preparado como descrito32, incubar no gelo por 30 min, congelam em nitrogênio líquido por 1 min, e incube a 28 ° C por 15 min.
    1. Em seguida, adicionar 1 mL de meio LB (triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L e 10 g/L de NaCl) para a mistura de células competentes e incubar a 28 ° C, durante 2 h. Spin para baixo as células a 3.000 × g por 1 min, re-suspendê-las em 0,2 mL de LB e placa-los na LB ágar suplementado com antibióticos apropriados (por exemplo, espectinomicina 100 mg/L e rifampicin de 50 mg/L para pPZP RSC2-com base em vetores26,30). Cresce a 28 ° C, durante 48 h até colônias individuais são visíveis.
  2. Escolher e várias colónias individuais em uma placa de ágar LB fresca da placa (ver passo 3.1), crescer a 28 ° C, durante 48 h e tomar uma pequena quantidade de bactérias para análise por PCR de colônia33 para confirmar a presença das construções de binárias específicas.
  3. Cresce cada colônia de Agrobacterium com o construto de interesse durante a noite a 28 ° C em 5 mL de LB suplementado com antibióticos apropriados (ver passo 3.1.1). Centrifugar as células a 3.000 × g e re-suspendê-las a OD600= 0,5 no buffer agroinfiltration (10 mM MgCl2, 10mm MES (pH 5,6), 150 µM acetosyringone). Incube durante 2 h à temperatura ambiente.
    1. Se usar uma mistura de plasmídeos binários em vez de um plasmídeo de expressão multigene único para coexpression de proteína, misture as culturas de célula correspondente na proporção de 1:1 v/v antes de infiltração. Então Incube as células a 28 ° C, durante 2 h.
  4. Carrega o inóculo em uma seringa de plástico de 1 mL e pressione que o bico da seringa (sem agulha) contra a epiderme inferior (abaxial) da amadurecer N. benthamiana folhas. Segure a folha com um dedo protegido por luva a face adaxial34,35.
    1. Introduza o Agrobacterium médio de infiltração por injeção lenta. Para a significância estatística, se infiltre em diversas folhas em cada planta.
      Nota: Observe que as folhas mais antigas não são utilizadas, como eles não produzem níveis de expressão consistente.
    2. Vacinar todas as folhas em situ. Manter a planta infiltrada até observação conforme descrito no passo 1.2.

4. Confocal da microscopia

  1. Use uma lâmina para cortar cada folha em fragmentos entre as veias 24-48 h após a infiltração, (dependendo a eficiência da expressão transiente da proteína específica testada); o tamanho de cada fatia de tecido deve ser tal que a fatia é completamente coberta por vidro tampa (22 x 40 mm) usado para a microscopia.
  2. Lugar as fatias de folha no objeto deslize com a superfície abaxial da folha voltada para cima, coloque uma gota de água sobre a fatia de folha e cubra com o tampa de vidro. Imobilize o tampa de vidro com pequenos pedaços de fita em cada lado.
  3. Observar os tecidos agroinfiltrated sob um microscópio confocal de varredura de laser e gravar as imagens resultantes.
    1. Primeiro, use uma lente de objetiva X 10 para identificar células com o sinal e use 63 x objectiva para observações mais detalhadas.
    2. Comprimento de onda do uso do 458 nm de um laser de íon argônio para excitar o PCP e 543 nm para excitar o DsRed2. Manter todas as configurações para aquisição de imagem, ou seja, a intensidade do laser e configurações de photomultiplier tubo (PMT), entre as experiências. Em média, examine células de 100-120 para cada condição experimental.

5. identificação dos PLS

  1. Diagnosticar a localização da proteína testada usando microscópio confocal (secção 4). Verifique se a proteína testada tem o padrão característico de punctate periférica25,36,37,38,39,40,41 e colocalizes com o marcador Pd PDCB123. Isto indica que a proteína testada provavelmente contém sequências PLS.
  2. Após confirmação da atividade da proteína testada, PLS progressivamente subdividir o quadro de leitura aberta (ORF) (número de adesão genbank BAF93925.1) em fragmentos menores, autofluorescently, (por exemplo, PCP,) marca cada um deles e analisar suas Localização subcellular conforme descrito na etapa 4. Inicialmente, recomenda-se o tamanho de 100 resíduos de aminoácidos para cada fragmento subdividido.
  3. Subdividir mais truncados fragmentos que têm a atividade PLS e verificar sua localização subcellular conforme descrito na etapa 4, até o menor fragmento que localiza ainda à polícia, ou seja, é suficiente para transportar a carga de marca autofluorescent para a polícia, é identificado. Este fragmento, presume-se para representar a sequência PLS.
  4. Excluir o putativo PLS da proteína testada completo, ou seja, fundir a parte restante da proteína teste sem putativo PLS a tag autofluorescent e determinar a Localização subcellular da proteína mutante resultante, conforme descrito na etapa 4. se esta proteína mutante que carece o putativo PLS falhar localizar à polícia, isso indicará que o identificado PLS não é apenas suficiente (ver passo 5.3), mas também é necessário para o transporte de Pd da proteína testado.
  5. Agroinfiltrate as folhas com uma mistura de culturas de Agrobacterium, abrigando a expressão constroem para o PCP-tag PLS e DsRed2 livre (ver passo 3.3). Observe o tecido infiltrado usando microscópio confocal com lente objetiva de 10x usando as mesmas configurações como no passo 4.3.
  6. Marca as células que contêm sinais tanto PCP e DsRed2 como células inicialmente infiltrados e marcar as células adjacentes que continha apenas o sinal de PCP como aqueles que mostra o movimento.
    Nota: Este passo examina o PLS identificado por sua potencial capacidade de movimento de célula a célula; Isto é porque muitas proteínas que destino Pd (incluindo a maioria planta virais MPs) também se move Pd para as células vizinhas. A concentração de Agrobacterium usado para infiltração depende da eficiência de expressão de diferentes estruturas, respectivamente. Para agroinfiltration, certifique-se de usar a diluição de cultura de células que garante que (i) a transformação de células únicas, deixando as células adjacentes unlit, (ii) alcança eficiência semelhante de expressão. Por exemplo, nossos experimentos utilizam OD600 de 0,01 e 0,005 por expressão de PCP-tag PLS e livre DsRed2, respectivamente.

6. identificação da chave PLS resíduos usando alanina digitalização42

  1. Usar padrão protocolos PCR para amplificar o PLS sequência empregando um par de primers destinados a conter a mutação desejada, isto é, substituição do resíduo de aminoácido alvo com a alanina, em torno da região central de cada primer, conforme descrito de código 21. realizar o projeto da primeira demão e uso o kit mutagenesis local-dirigido para o mutagenesis local-dirigido de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Purificar os produtos resultantes do PCR usando qualquer padrão kit de purificação de DNA e digeri-los a 37 ° C com DpnI para eliminar o parental (ou seja, não-mutante) misturado e hemimethylated o DNA. Isto esfrie por 5 min à temperatura ambiente (não gelo). Em seguida, transformar a mistura diretamente em células competentes de Escherichia coli 43e identificar colônias com as construções de mutante desejadas, conforme descrito no passo 3.2.
  3. Introduzir o mutante constrói o vetor binário, conforme descrito na etapa 2.2.4, execute agroinfiltration, conforme descrito na etapa 3 e avaliar Pd direcionamento conforme descrito nas etapas 4 e 5.1.

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Resultados

Dados do representante, que fielmente ilustram os resultados esperados dos protocolos descritos e identificam o TMV MP PLS, adaptam-se de Yuan et al . 21. figura 1A primeiro resume grandes construções expressando o MP TMV completos (1-268), TMV MP PLS (compreendendo os primeiros 50 resíduos de aminoácidos da proteína, 1-50), e sua digitalização V4A derivados de alanina fundido ao CFP (gerado como descrito em etapas 2.2, 5.2 e 6) Consideran...

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Discussão

Este protocolo tem quatro componentes principais: o conceito de identificar uma sequência que é necessário e suficiente para o direcionamento de Pd, divisão sistemática da proteína de interesse em fragmentos que são progressivamente reduzidos em comprimento, fundindo o testado fragmentos de uma proteína autofluorescent que serve como marca e como carga macromolecular e ensaio funcional para Pd direcionamento na vida da planta tecidos seguindo a expressão transiente das proteínas de fusão testado. Observe que a expressão ...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

A falta de espaço, nós citados principalmente artigos de revisão, e pedimos desculpas aos nossos colegas, cuja obra original não foi citada. O trabalho no laboratório V.C. é suportado por concessões do NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD e BSF para V.C., e o laboratório S.G.L. é suportado pelo NIH e fundos do departamentos de Fitopatologia e biologia vegetal-micróbio para S.G.L.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microscópio confocal de varredura a laser (CLSM)ZeissLSM5Qualquer CLSM com capacidades semelhantes é apropriado
Software Zen para imagens de microscópio confocalZeissversão 2009O software deve ser compatível com o CLSM usado
Quickchange II kit de mutagênese dirigida ao local Agilent200523
AcetosiringonaSigma-AldrichD134406
MESSigma-Aldrich69892
Seringas sem agulhasBD309659
MgCl2FisherScientificM33-500
Spectinomicina Sigma-AldrichS4014
RifampicinaSigma-AldrichR3501
Ampicilina Sigma-AldrichA0166

Referências

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