Identificação de sequências de localização Plasmodesmal em proteínas em Planta

Summary

Planta de conexões intercelulares, os dictiossomos (Pd), desempenham um papel central na planta de interações planta-vírus e fisiologia. Crítica para o transporte de Pd está classificando os sinais que dirigem proteínas à polícia. No entanto, nosso conhecimento sobre estas sequências é ainda em sua infância. Nós descrevemos uma estratégia para identificar sinais de localização de Pd em proteínas Pd-alvo.

Abstract

Dictiossomos (Pd) são ligações de celular para celular que funcionam como gateways através do qual moléculas pequenas e grandes são transportadas entre células vegetais. Considerando que o transporte de Pd de pequenas moléculas, como íons e água, presume-se ocorrer passivamente, célula a célula transporte de macromoléculas biológicas, tais proteínas, provavelmente ocorre através de um mecanismo ativo que envolve os sinais de direcionamentos específicos sobre o molécula transportada. A escassez de sinais de localização de dictiossomos identificados (Pd) (PLSs) restringiu severamente o entendimento de proteína-classificação vias envolvidas na planta transporte macromolecular de célula para célula e comunicação. De uma riqueza de planta endógenas e virais proteínas conhecidas para o tráfego por meio de Pd, PLSs apenas três foram relatados até à data, todos eles de proteínas vegetais endógenos. Assim, é importante desenvolver uma estratégia experimental sistemática e confiável para identificar uma sequência PLS funcional, que é necessário e suficiente para o direcionamento de Pd, diretamente no vivo células vegetais. Aqui, descrevemos uma tal estratégia usando como um paradigma da proteína de célula para célula de movimento (MP) do vírus do mosaico do tabaco (TMV). Estas experiências, que identificaram e caracterizam a primeira planta PLS viral, pode ser adaptadas para descoberta de PLS sequências em proteínas mais Pd-alvo.

Introduction

Dictiossomos (Pd) funcionam como condutos para transporte intercelular dos reguladores chaves do desenvolvimento da planta e morfogênese, variando de fatores de transcrição de mRNA e pequenas moléculas de RNA. Além disso, esta capacidade de transporte macromolecular da DP é utilizada pela maioria dos vírus de planta para sua propagação intercelular durante a infecção; para mover-se através de Pd, vírus de plantas evoluíram proteínas especializadas, denominadas proteínas de movimento (MPs), que visam especificamente a Pd^1,2,3,4,

Protocol

1. Material vegetal

1. Escolha de espécies de plantas
2. Use as espécies de plantas nativas à proteína de interesse, ou seja, um que codifica esta proteína para proteínas endógenas ou que representa o hospedeiro natural para o patógeno para proteínas virais. Além disso, as espécies de plantas selecionadas devem ser passíveis do método de escolha de transformação genética transitória.
   Nota: Os estudos empregam rotineiramente Nicotiana benthamiana, que representa um bom anfitrião para TMV e é transformado de forma eficiente pela técnica de transformação genética mediada por Agrobacterium, i.e., agroinfiltration (ver passo 3). ....

Results

Dados do representante, que fielmente ilustram os resultados esperados dos protocolos descritos e identificam o TMV MP PLS, adaptam-se de Yuan et al . ²¹. figura 1A primeiro resume grandes construções expressando o MP TMV completos (1-268), TMV MP PLS (compreendendo os primeiros 50 resíduos de aminoácidos da proteína, 1-50), e sua digitalização V4A derivados de alanina fundido ao CFP (gerado como descrito em etapas 2.2, 5.2 e 6) Consideran.......

Discussion

Este protocolo tem quatro componentes principais: o conceito de identificar uma sequência que é necessário e suficiente para o direcionamento de Pd, divisão sistemática da proteína de interesse em fragmentos que são progressivamente reduzidos em comprimento, fundindo o testado fragmentos de uma proteína autofluorescent que serve como marca e como carga macromolecular e ensaio funcional para Pd direcionamento na vida da planta tecidos seguindo a expressão transiente das proteínas de fusão testado. Observe que a expressão .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscópio confocal de varredura a laser (CLSM)	Zeiss	LSM5	Qualquer CLSM com capacidades semelhantes é apropriado
Software Zen para imagens de microscópio confocal	Zeiss	versão 2009	O software deve ser compatível com o CLSM usado
Quickchange II kit de mutagênese dirigida ao local	Agilent	200523
Acetosiringona	Sigma-Aldrich	D134406
MES	Sigma-Aldrich	69892
Seringas sem agulhas	BD	309659
MgCl2	FisherScientific	M33-500
Spectinomicina	Sigma-Aldrich	S4014
Rifampicina	Sigma-Aldrich	R3501
Ampicilina	Sigma-Aldrich	A0166