Reconstituição de Nucleosomes com Histones irmã diferencialmente Isotope-rotulados

Resumo

Este protocolo descreve a reconstituição de nucleossomas contendo histonas irmã isotopicamente marcados diferencialmente. Ao mesmo tempo, nucleossomas assimetricamente pós-translacionalmente modificados pode ser gerado após o uso de uma cópia da histona premodified. Estas preparações podem ser prontamente usadas para estudar os mecanismos de modificação de diafonia, simultaneamente em ambas as histonas irmã, utilizando espectroscopia de RMN de alta resolução.

Resumo

nucleossomos assimetricamente modificados contêm as duas cópias de uma histona (histonas irmã) decorados com conjuntos distintos de modificações pós-traducionais (PTMS). Eles são recém-espécie identificada com meios desconhecidos de estabelecimento e implicações funcionais. métodos analíticos correntes são insuficientes para detectar a ocorrência específica contra cópia de PTMs sobre as histonas nucleossomais irmã. Este protocolo apresenta um método bioquímico para a reconstituição in vitro de nucleossomas contendo histonas irmã isotopicamente marcados diferencialmente. O complexo gerado também pode ser assimetricamente modificada, após a inclusão de uma piscina histona premodified durante a redobragem de subcomplexos histonas. Estas preparações nucleossomos assimétricos podem estar prontamente reagiu com enzimas modificadoras de histonas para estudar modificação mecanismos de cross-talk impostas pela PTM assimetricamente pré-incorporados usando espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Em particular, as reacções de modificaçãoEm tempo real pode ser mapeado de forma independente nas duas histonas irmã através da realização de diferentes tipos de experiências de correlação de RMN, adaptados para o respectivo tipo de isótopos. Esta metodologia proporciona os meios para estudar os mecanismos de diafonia que contribuem para a formação e propagação de padrões PTM assimétricos em complexos nucleossomais.

Introdução

ADN eucariótico está firmemente embalados dentro de núcleos celulares em cromatina. O bloco de construção fundamental da cromatina é a partícula de núcleo que contém nucleossoma ~ 147 pb de ADN envolvida em torno de um complexo octam�ica constituído por duas cópias de cada um dos quatro histonas nucleares (H3, H4 e H2A, H2B). proteínas histona abrigar uma variedade de modificações pós-traducionais (PTMs). Estas substituições covalentes induzir alterações na estrutura da cromatina, tanto directamente ao afectar a química física do sistema e, indirectamente, através do recrutamento de actividades de remodelação da cromatina ^1,

Protocolo

1. Reconstituição de Nucleosomes com diferencialmente Isotope marcado (e assimetricamente Modificada) Irmã Histones

NOTA: O protocolo atual descreve a reconstituição dos nucleossomos com diferencialmente H3 histona marcada com isótopos. Para este fim, foram utilizados dois conjuntos de histona H3; um ^N-15 foi rotulado e continha uma 6xHis-tag no terminal-N e a segunda foi de ¹³ C-rotulado e continha o péptido Strep (WSHPQFEK) fundido na extremidade N-terminal. Ambas as marcas foram separados a partir da sequência nativa H3 com um local de reconhecimento para proteases do tabaco Etch Vírus (TEV). Para preparar nu....

Resultados

Octam�ica espécies correctamente redobradas são isolados após uma corrida de reconstituição a mistura através de uma coluna de filtração em gel (Figura 2). A piscina octam�ica reconstituído contendo os três tipos diferentes de octâmeros é submetido ao esquema de purificação por afinidade em tandem. As amostras são recolhidas a partir de todas as etapas e analisadas por SDS-PAGE e subsequentemente WB. A verificação da correcta execução do protocolo que resulta no isol.......

Discussão

Para a reconstituição nucleossomo, o protocolo atual utiliza um modelo de DNA longo de 165 pb contendo o 601-Widom sequência posicionamento nucleosome ^20, mas o desempenho semelhante é esperado usando vários comprimentos de modelos de DNA. O protocolo foi projetado e ao serviço que utilizam tipos assimétricos de histona H3. Com o mesmo princípio, o método pode ser aplicado também a outras histonas nucleares e, adicionalmente, pode ser utilizado para reconstituir os complexos que transportam duas .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Aplicação de HCl de Guanidínio		A14199	Gu-HCl de alta qualidade
	Roth	4855.2
DTT	Applichem	A1101
NaCl	VWR produtos químicos	27810.364
EDTA	Roth	8043.2
Na2H2PO4	Applichem	A1046
NaH2PO4	Applichem	A3902
Imidazol	Applichem	A1073
d-Desthiobiotin	Sigma	D1411
Ni-NTA Superflow	Qiagen	1034557
Strep-Tactin Superflow	IBA	2-1207-001
Anticorpo de sonda His	Santa Cruz	sc-8036
HRP conjugado com estreptococo	IBA	2-1502-001
Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg	GE Healthcare	28-9893-35
6 - 8 kDa membrana de diálise	Spectrumlabs	spectra/por 1, 132650
50 kDa membrana de diálise	Spectrumlabs	spectra/por 7, 132129
10 kDa unidade de filtro centrífugo	Merck Millipore	UFC901024
30 kDa filtro centrífugo unidade	Merck Millipore	UFC903024
Espectrômetro de RMN em estado de solução			frequência de operação de pelo menos 500 MHz, equipada com uma criossonda de ressonância tripla
Nome do tampão	Componente
Tampão de desdobramento	7 M Guanidínio HCl
	20 mM Tris, pH 7,5
	10 mM Tampão
	10 mM Tris, pH 7,5
	2 M NaCl
	1 mM EDTA
	2 mM DTT
Tampão de ensaio	25 mM Na2H2PO4, pH 6,8
	25 mM NaCl
	2 mM DTT

Use Tris  de redobramento DTT