Summary
Этот протокол описывает воссоздание нуклеосом, содержащих дифференцированно меченого изотопом сестра гистоны. В то же время, асимметрично посттрансляционно модифицированные нуклеосом могут быть получены после того, как с помощью premodified гистонов копии. Эти препараты могут быть легко использованы для изучения механизмов изменения перекрестных помех, одновременно на обеих сестринских гистонов, с помощью высокого разрешения ЯМР-спектроскопии.
Abstract
Асимметрично модифицированные нуклеосомы содержат две копии гистонов (сестра гистонов), украшенные различными наборами посттрансляционных модификаций (PTMs). Они вновь выявленных видов с неизвестными средствами создания и функциональных последствий. Современные аналитические методы являются недостаточными для обнаружения копий конкретных появление PTMs на нуклеосомной сестра гистонов. Этот протокол представляет собой биохимический метод для восстановления в пробирке нуклеосом , содержащих дифференциально меченого изотопом сестра гистоны. Сформированный комплекс может быть также асимметрично изменен, после включения premodified гистонов бассейн во рефолдинга гистонов подкомплексах. Эти асимметричные нуклеосом препараты могут быть легко реагирует с гистонов модифицирующих ферментов для изучения механизмов Наводки модификации, налагаемых асимметрично предварительно включенного PTM с использованием ядерного магнитного резонанса (ЯМР). В частности, реакции модификации вв режиме реального времени могут быть отображены независимо друг от друга на двух сестринских гистонов, выполняя различные типы корреляции ЯМР-экспериментов, адаптированной для соответствующего типа изотопов. Эта методика обеспечивает средства для изучения переходных помех механизмы, которые способствуют образованию и распространению асимметричных моделей PTM на нуклеосомных комплексов.
Introduction
Эукариотической ДНК плотно упакована в ядрах клеток в хроматин. Фундаментальным строительным блоком хроматина является нуклеосомная ядро частицы, которая содержит ~ 147 п.н. ДНК, обернутой вокруг октамерной комплекса, состоящего из двух экземплярах, каждый из четырех основных гистонов (Н3, Н4, H2A, H2B). Гистонов белки питают множество посттрансляционных модификаций (PTMs). Эти ковалентные замены вызывают изменения в структуре хроматина, как непосредственно влияет на физическую химию системы , так и косвенно за счет привлечения хроматина ремоделирования деятельности 1, 2, 3. К этим средствам, гистонов PTMs контролировать доступность хроматина и, следовательно, регулировать все ДНК на основе клеточных функций 4.
PTMs устанавливаются гистонов модифицирующие ферментных систем в основном на неструктурированных N-концевых сегментов (хвостов) нуклеосом внедренной основной гистоуказанные в другом месте. Из - за многих модификаций участков на относительно короткой последовательности гистонов, PTMs влияют друг на друга за счет индукции или блокирования последующих реакций в модификации, эффект , известный как модификация перекрестных помех 5. Из-за общей симметричной архитектуры нуклеосомой, были мысли модификации реакции и механизмы перекрестных помех происходит аналогичным образом на двух копий каждого нуклеосомной гистона (сестра гистонов). Эта концепция была недавно оспорена и впоследствии опровергнуты. В частности, в пробирке ферментативные анализы на свободный гистонов H3 хвостовых пептидов и на нуклеосом показали , что множество Н3 киназ введена фосфорилирования в асимметричной форме 6. Кроме того, аффинно очистки на основе анализа ЖХ-МС / МС показали существование асимметрично H3-метилированных нуклеосом в нескольких типах эукариотических клеток 7. Таким образом, асимметрично модифицированные нуклеосом образуют новые виды, иинструменты необходимы, чтобы раскрыть механизмы, которые контролируют их формирование и анализ эффектов перекрестных помех, что эта асимметрия может оказывающие.
Как правило, вестерн-блоттинга (ВБ) и масс-спектрометрического анализа (МС), были использованы для обнаружения гистонов PTMs. Несмотря на легкое применение, ВБ страдает от проблем специфичности / перекрестной реактивности. Кроме того, он не способен выполнять одновременный анализ нескольких PTM и прямой количественной оценки реакций модификации 8. С другой стороны, анализ MS использует сложное оборудование , которое требует обучения на высоком уровне, но и обеспечивает высокую специфичность, а также одновременное отображение и количественной оценки множественных PTMs 9. Тем не менее, оба метода разрушительный и нуклеосомной комплексы диссоциируют перед проведением анализа, что приводит к смеси гистонов и / или гистонов производных пептидов. Эта манипуляция устраняет способность различать независимыйРеакции модификации, которые происходят на каждой из двух сестринских гистонов и сообщить о копии конкретного статус модификации нуклеосомной гистонов.
Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) эволюционировали в качестве альтернативного метода для сопоставления реакций PTM. ЯМР без нарушения и таким образом позволяет осуществлять мониторинг событий PTM в режиме реального времени способом , в разведенной смеси, и даже в интактных клетках 10, 11. Разработка процедур для быстрого сбора данных, а также для отображения с высокой разрешающей способностью на основе на 2D гетероолигомере ядерные методы корреляции меченого изотопом (15 Н и / или 13 С) образцов 12 позволило одновременное отображение различных типов PTMs, такие как серин / треонин / фосфорилирования тирозина, лизина ацетилирование / метилирования и аргинина метилирования 13. В зависимости от ПТМ под следствием, 15 N- или 13 C-мечение прotocols могут быть использованы, чтобы отметить функциональную группу белка, который служит в качестве модифицирующей репортера. Следовательно, отображение ПТМ может быть выполнена следующим характеристическую химического сдвига смещения соответствующей функциональной группы 'воспринимая' Чередование на химическую среду. В большинстве случаев, как NH и CH химические группы могут быть использованы, чтобы сообщить эволюцию PTM интереса.
Текущий протокол описывает генерацию нуклеосом, содержащих дифференцированно меченого изотопом сестра гистоны. Она сочетает в себе гибкость ЯМР - спектроскопии для отображения PTMs , используя как 1 Н- 15 N и 1 Н- 13 корреляции спектров C с использованием различных тегов сродства белка для очистки выбранных реконструированных гистонов комплексов. Следует отметить, что протокол использует два различных пулов определенного гистона для нуклеосомнои восстановления. Эти бассейны дифференцированно меченого изотопом (один с
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Воссоздание нуклеосом с Дифференциально меченый изотопом (и асимметрично Modified) Сестра Гистоны
ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий протокол описывает воссоздание нуклеосом с дифференцированно меченого изотопом гистона H3. С этой целью были использованы два бассейна гистона H3; один был 15 Н-меченых и содержал 6xHis-тег на N-конце , а второй был 13 С-меченого и содержал пептид Strep (WSHPQFEK) , слитый на N-концевом участке . Обе метки были отделены от нативной последовательности Н3 с сайтом распознавания протеазы табачный Etch Вирус (ТРВ). Для того, чтобы подготовить дополнительные асимметрично модифицированных нуклеосом, один из двух Н3 бассейнов входит в premodified форме. Premodification пула гистонов может быть осуществлено путем реакции меченного изотопом гистонов интерес с соответствующим гистона-модифицирующего фермента в присутствии необходимого для каждого типа кофакторов реакции / доноров PTM 16. Эффективное размещение соответствующего ПТМ может быть оценена с помощью ЯМР-спектроскопии или масс-спектрометрии. Количества гистоны / ДНК, используемые здесь, являются приближенными рекомендации, чтобы получить нуклеосом препарат с приблизительной концентрации 10 мкМ (измеренный как концентрации ДНК при 260 нм) .Этот конечный выход достаточна для записи спектров ЯМР хорошего качества с относительно коротким временем приобретения.
- Воссоздание гистонового октамером с дифференцированно меченого изотопом (и асимметрично модифицированный) гистона H3
Примечание: рекомбинантные белки гистона могут быть получены в количествах , в мг BL21 (DE3) plysS клеток 14. Для получения меченого изотопом гистоны, тот же протокол , выражение / очистка повторена за исключением использования для роста бактерий в минимальной среде , содержащей 15 NH 4 Cl и / или 13 С-глюкозой в качестве азота и углерода источников, в течение 15 или 13 N- C-маркировка respectiVely. Очищенные гистоны экстенсивно подвергали диализу против 5 мМ бета-меркаптоэтанола и хранили лиофилизировали перед использованием.- Растворить лиофилизированные гистонов аликвот, содержащий ~ 5 мг каждого гистона в 1 мл буфера разворачивания (7 М гуанидин-HCl, 20 мМ Трис рН 7,5, 10 мМ ДТТ). Включите оба типа гистона H3. Смешайте с помощью пипетки и не вихрь. Хранить трубы на льду в течение 30 мин, чтобы позволить полное раскрытие.
- Определить точную концентрацию каждого гистона путем измерения оптической плотности при 280 нм против разворачивания буфера и с использованием коэффициентов экстинкции, вычисленных с помощью инструмента ProtParam портала ExPASy. 15
- Смешайте основные гистонов в эквимолярных соотношениях, имея в виду, чтобы включать в себя 50% каждого из двух бассейнов гистона H3. Начните с использованием всего содержимого менее концентрированного гистона и добавить все остальные соответственно.
- Регулировка конечной концентрации белка до приблизительно 1 мг / мл с использованием разворачивания буфера.
- TransfeR смесь диализу мембрану 6 кДа-среза и диализ против 1-2 л охлажденного рефолдинга буфера (10 мМ Трис, рН 7,5, 2 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 2 мМ DTT) при 4 ° С. Изменение буфера, по меньшей мере один раз после того, как диализ проводили в течение минимум 3 часов. Выполните окончательную диализ O / N при 4 ° С.
- Сбор диализовали материала и удалить любые преципитаты центрифугированием в микроцентрифуге в течение 5 мин при 4 ° C на максимальной скорости (обычно осадков не должно соблюдаться). Определить концентрацию октамером путем измерения оптической плотности при 280 нм. В расчетах используются добавлены коэффициенты экстинкции гистонов, имея в виду, чтобы удвоить каждого значения.
- Концентрат до конечного объема ~ 2 мл с использованием 10 кДа-среза блока центробежного фильтра. Перерасчет октамером концентрации и потерь оценка. На данный момент, концентрацию октамер между 50 - должно быть получено 100 мкМ.
- Подключите колонку для гель - фильтрации (указанный в таблице материалов) доСистема FPLC и уравновешивают с 2 объемами колонки (CV) 0,22 мкм фильтровали и дегазировали рефолдинга буфером при скорости потока 1 мл / мин и пределом давлении 0,5 МПа.
Примечание: Фильтрация запустить гель должен быть выполнен в холодном помещении или в холодном кабинете. - Вводят концентрированного материала с использованием скорости потока 1 мл / мин и собирают 1,0 - 1,5 мл фракции.
- Следуйте хроматографический профиль и наблюдать гистонов октамером элюция при ~ 65 - 68 мл.
Примечание: Небольшое плечо пика элюирования и пик при ~ 80 мл свидетельствует о наличии свободных тетрамеров Н3-Н4 и H2A-H2B димеров, соответственно. - Выполните по 20 мкл каждой фракции, собранной в 18% геле с SDS-PAGE.
Примечание: Развести образцы с коэффициентом по крайней мере , 2 с водой перед их загрузкой на геле , чтобы уменьшить высокую концентрацию соли , и , таким образом, избежать искажений. То же самое относится и для последующих анализов SDS-PAGE образцов в рефолдинга буфера. - Бассейн отношение Фраctions, содержащие чистые октамеры судимы по равному распределению 4 гистонов на окрашенном геле и определяют концентрацию, как и прежде (этап 1.1.7).
- Подключение 1 мл Ni-NTA колонке (таблица материалов) к системе FPLC и уравновешивают с помощью 10 CV 0,22 мкм фильтровали и дегазировали рефолдинга буфером при скорости потока 1 мл / мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ni-NTA хроматографии следует проводить в холодном помещении или в холодном кабинете. - Проход очищенный октамером через Ni-NTA с использованием скорости потока 1 мл / мин.
- Собрать проточные и сохранить образцы для SDS-PAGE / ВБ анализа (20 мкл и 4 мкл, соответственно). Затем промойте колонку с 10 CV от рефолдинга не буфера или до тех пор, базовый уровень сигнала будет достигнут.
- Элюировать 10 CV от рефолдинга буфера, содержащего 250 мМ имидазола с использованием скорости потока 1 мл / мин. Хранить образцы для SDS-PAGE / ВБ анализа (20 мкл и 4 мкл, соответственно).
- Равновесие сродством колонку 1 мл переменного токаommercial стрептавидин (таблица материалов) с 10 CV рефолдинга буфера , содержащего 250 мМ имидазола с использованием установки потока партии / силы тяжести.
Примечание: Эта хроматографическая стадия должна быть выполнена в холодном помещении. - Pass Ni-NTA элюирование через коммерческий стрептавидин аффинной колонки.
- Собирают поток через и сохранить образцы для SDS-PAGE / ВБ анализа (20 мкл и 4 мкл, соответственно). Затем промывают 10 CV из буфера рефолдинга.
- Элюировать 10 CV из рефолдинга буфера, содержащего 2,5 мМ desthiobiotin. Хранить образцы для анализа SDS-PAGE / WB (20 и 4 мкл соответственно).
- Мера октамером концентрацию, добавьте в 10 раз меньше TEV протеазы и пусть РЕАКЦИЯ в течение ночи при 4 ° C в стандартной пластиковой центрифужной пробирке.
Примечание: Необходимое количество ТРВ для получения полного переваривания (удаление тегов сродства) зависит от происхождения (построить) и активности (свежеприготовленные, рекомбинантный ТРВ является болееактивным по сравнению с тем, что хранится в течение длительных периодов времени при - 80 ° С). Попробуйте изначально добавляющие в 10 раз меньше TEV по сравнению с октамером (по оценкам, как концентрации белка) и настроить соответствующим образом. - Проверка для эффективного пищеварения, выполнив 20 мкл смеси до и после того, как TEV дополнительно на 18% геле с SDS-PAGE. Если пищеварение не является полным, добавьте больше TEV протеазы и продолжают инкубацию еще на 3-4 часа.
- Диализировать образец против рефолдинга буфера с использованием диализной мембраны 50 кДа-обрезания для удаления TEV протеазы и корректировать состав буфера.
- Концентрат очищенный асимметричный октамером с использованием 10 кДа-среза центробежного блока фильтров (один и тот же блок фильтра из шага 1.1.7 может быть также использован) до объема 1,0-2,0 мл. Измеряют конечной концентрации. Либо использовать вскоре после того, как для нуклеосом восстановления или отрегулировать до 50% (об / об) глицерина для хранения при -20 ° С в течение более длительных периодов времени. В этот момент и ожидает потери по меньшей мере, 70% в течение предыдущих этапов, йе концентрация октамер должна быть в пределах от 20 - 50 мкМ.
- нуклеосом восстановление
- Если октамер хранили в 50% глицерине, диализ в течение ночи при 4 ° С против буфера рефолдинга перед продолжением нуклеосом восстановления.
- Отрегулировать ДНК (содержащий нуклеосома-позиционирования последовательности) концентрации соли до 2 М NaCl с помощью 5 М NaCl исходного раствора.
Примечание: Очищенную ДНК либо изолированы после очистки плазмиды, содержащей несколько копий требуемой последовательности или синтезированы с помощью ПЦР - амплификации следует хранить концентрировали до ~ 50 мкм , в воде или стандартный буфер Трис-ЭДТА. - Смешайте октамером и ДНК с использованием оптимального соотношения определяют из теста мелкосерийного. С помощью повторной укладки буфера для регулировки конечный объем до ~ 3,0 мл. Всегда добавляйте октамером последнего, чтобы предотвратить любую возможность смешивания октамером и ДНК в <2 М концентрации соли.
- Выполните начальную маленькую-SCЭлевые reconstitutions для определения октамер: соотношение ДНК, что приводит к оптимальной урожайности нуклеосом. Для этого, собрать три реакции 0,9: 1,0, 1,0: 1,0 и 1,1: 1,0: ДНК октамером соотношения в объеме между 50-100 мкл. Как правило, используют в концентрации 5 мкМ ДНК.
- Продолжайте восстановлением, как описано ниже (шаги 1.2.4-1.2.8) и в конце, оценить количество растворимого и хорошего качества реконструированной нуклеосомой путем измерения концентрации ДНК при 260 нм и с помощью разделяющий гель ДНК нативной PAGE 6% , окрашивали бромистым этидием, соответственно (рис 5А).
- Перенести смесь в диализной мембране 6 кДа-среза и диализ против 1 л рефолдинга буфера в течение ночи при температуре 4 ° С.
- Уменьшить концентрацию соли в буфере, диализом в ступенчатым образом от 2, до 0,85, 0,64, и 0,2 М NaCl соответственно. Хранить образец в каждом буфере в течение по крайней мере 3 ч. Иногда образуется осадок после последнего перехода. В этом случае сдиализ, как оказанию в плановых и удаления осадка путем центрифугирования микроцентрифуге в конце следующего шага.
- Передача диализной мембраны в химический стакан с 1 л буфера для анализа (25 мМ NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 рН 6,8, 25 мМ NaCl, 2 мМ DTT) и продолжают диализ O / N при температуре 4 ° С.
- Собирают пробу, удалить любой осадок, синтезированный при шаге 1.2.5 центрифугированием в микроцентрифуге в течение 5 мин при 4 ° С на максимальной скорости и концентрата с использованием 30 кДа-среза блока центробежного фильтра до конечного объема ~ 300 мкл.
- Измерение концентрации ДНК при 260 нм, запустить 18% SDS-PAGE гель белка (4 мкл образца) и 6% нативный-PAGE ДНК из геля (0,2 мкл образца) и хранить образца при температуре 4 ° С в течение нескольких недель. Конечная концентрация должна быть в пределах 10-20 мкМ.
2. Результаты анализа методом ЯМР модификации реакций на две сестры гистонов
Примечание: Назначение2D 1 H- 15 N корреляции спектров нуклеосомных гистонов можно найти в ссылках 16, 17, 18. Кроме того, задания СН х групп лизинов, серинам и треонина на 2D спектров корреляции 1 H- 13 C можно найти в ссылке 16.
- Установка ЯМР и запись эталонных спектров
Примечание: Ферментные анализы осуществляли с использованием 140 мкл нуклеосомнои образца в буфере для анализа в ЯМР пробирку 3 мм при 300 К. Различные ЯМР пробирки с другими объемами образца может быть также использован. Вышеупомянутая температура подходит для получения хорошего качества 1 Н- 15 N корреляции спектров нуклеосомных гистонов и хорошей ферментативной активностью. 2D-SOFAST-HMQC 1 Н- 15 N и 2D-HSQC спектров 1 H- 13 C были записаны соответственно с установки тшляпа дает аналогичные времена приобретения. Типичные параметры сбора 128 Переходные процессы с 1,024 (1 H) × 128 (15 N) комплексных точек и 32 переходных процессов с 1,024 (1 Н) х 64 (13 С) комплексные точки для двух различных типов корреляции спектров. Для обоих 2D спектров, время сбора составляла ~ 30 мин.- Набор 300 K в качестве температуры образца в спектрометре. Добавить 10% D 2 O (об / об) к образцу , который будет использоваться для блокировки частоты спектрометра.
- Поместите образец в спектрометр и выполнять основные операции (блокировка, настройка, подкладок). Кроме того, определить оптимальные длины импульса и общие параметры сбора данных.
- Запись 1D и 2D 1 H- 15 N и 1 H- 13 C эталонных спектров.
- Процесс эталонных спектров и гарантировать, что сигналы, которые будут использоваться для отображения реакций модификации хорошо разрешены и имеют хорошие интенсивности.
- Восстановление образца и передачи Iт в микроцентрифуге трубки.
- Настройка ферментативной реакции, ЯМР мониторинга и количественного анализа
- Копирование и организовать серию с чередованием 2D 1 H- 15 N и спектров 1 Н- 13 С. Цель в течение общего времени приобретения нескольких часов и регулировать соответствующим образом в новом выполнения на основе ферментативных ставок, полученных из первой реакции.
- Добавить в выборку необходимых кофакторов для соответствующего типа реакции модификации (1 мМ АТФ / 2 мМ MgCl 2 для фосфорилирования, 1 мМ ацетил-КоА для ацетилирования, 1 мМ SAM для метилирования и др.).
- Добавьте интерес фермент, перемешать с помощью пипетки, перенести образец обратно в трубке ЯМР, а затем в спектрометре (выполнять эти операции быстро).
Примечание: Если нет данных об ожидаемой ферментативной активности, регулировать субстрат-энзим молярном соотношении до 10: 1. Выполните первый пробный запуск и настроить соответствующим образом дляреальный пробег. - Выполните быструю автоматическую и использовать прокладок остальные параметры из эталонных спектров.
- Инициировать серию перемеженных 2D 1 H- 15 N и спектров 1 Н- 13 С.
- Последующие прогрессию реакции в режиме реального времени и остановки регистрации, когда реакция достигает завершения или желаемого уровня.
- Спектры процесса, как и раньше с точно такими же параметрами.
- Повторите весь прогон использовать другой порядок приобретения для двух типов корреляции спектров. Если в первом эксперименте 1 Н- 15 N корреляция была первой в серии, начните теперь с C корреляции 1 Н- 13. Этим и имеющие одинаковое время приобретения для обоих спектров, можно построить и сравнить реакции PTM на обоих дифференциально меченного изотопом гистонов на том же временном масштабе. Кроме того, можно рассчитать средние значения, а столбец ошибки участок.
ПРИМЕЧАНИЕ: thorougОписание ч методологий для анализа ЯМР сигнала и последующего количественного определения ферментативных реакций можно найти здесь 19. - Выберите сигналы ЯМР от каждого спектра ЯМР во времени, конечно, сообщающие прогрессирование реакции и рассчитать их относительные интенсивности сигнала с использованием визуализации и анализа программного обеспечения для спектров ЯМР. Сделайте это для сигналов, которые сообщают о немодифицированного, а также модифицированную состояние. Извлечение уровней модификации.
- Plot расчетные значения уровней модификации от времени реакции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Правильно подвергнутые рефолдингу октамерных виды изолированы после пробега восстанавливающей смеси через колонку для гель - фильтрации (рисунок 2). Реконструированный октамерных пул, содержащий три различных типа октамеры подвергают схеме аффинной очистки тандем. Пробы отбираются из всех этапов и анализировали с помощью SDS-PAGE и затем WB. Проверка правильного выполнения протокола , что приводит к выделению асимметричных видов достигается следующими наличие двух аффинных тегов (и септический ГИС - ) в различных образцах (рисунок 3). Впоследствии, метки сродства удаляются после того, как TEV протеазы пищеварения (рис 4). Асимметричные октамеры утилизируются аффинные метки используются для восстановления асимметричные нуклеосом. Первоначально небольшой тест масштаба восстановление используется для определения оптимального молярного соотношения ДНК: октамер, что приводит к высокойвыход формирование монодисперсному комплекса. Впоследствии, оптимизированное соотношение компонентов смеси используется для воссоздания нуклеосом в большом масштабе. Нуклеосомы reconstitutions анализируют с помощью белков / гелей ДНК и ЯМР - спектроскопии для правильной сборки и наличием Дифференциально меченного изотопом родственными H3 гистонов соответственно (рисунок 5). Пример приложения изображен на рисунке 6. В частности, дифференцированно меченого изотопом и асимметрично фосфорилируется на H3S10 нуклеосом реагируют с Gcn5 ацетилтрансферазы и ацетилирование H3K14 на обоих экземплярах H3 следуют в реальном времени с помощью ЯМР-спектроскопии. Анализ показывает , что H3S10 фосфорилирования стимулирует H3K14 ацетилирование путем Gcn5 в цис по сравнению с транс.
Рисунок 1: Блок - схема для подготовки ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО изотопно-лabeled (и асимметрично Modified) Нуклеосомы. (A) очистки и Воссоздание тандем сродство дифференциально меченого изотопом (и асимметрично модифицированный) гистонов октамеры. (Б) нуклеосом восстановление путем объединения очищенных асимметричные октамеры и последовательность ДНК нуклеосомы-позиционирования. (C) ЯМР мониторинг в-цис и транс-модификации перекрестных помех после смешивания асимметрично измененных и дифференцированно меченого изотопом нуклеосом с гистонов модифицирующих ферментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Воссоздание гистонов октамеры. Гель-фильтрации элюции профиль ренатурирован гистона смеси, Основной пик при ~ 70 мл соответствует гистонов октамеры. A 14 - 20% градиент SDS-PAGE гель (Кумасси синим окрашиванием) элюированных фракций, соответствующих пику октамера показывает правильный гистонов стехиометрии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Очистка асимметричных гистонов октамеры. 14-20% градиент SDS-PAGE гель (окрашивание кумасси) и ВБ против аффинных меток и септический ГИС-проб из различных стадий схемы аффинной очистки тандем. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Удаление сродства теги. 18% SDS-PAGE гель (окрашивание кумасси) очищенного асимметричный гистонов октамеры до и после смешивания с протеазы TEV. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Биохимические и ЯМР характеристика Дифференциально меченый изотопом нуклеосом. (A) 6% нативный-PAGE гель ДНК (этидийбромид окрашивание) небольшой тест-шкалы нуклеосомнои восстановления с использованием различных молярных соотношений ДНК: октамер (слева). 6% нативный-PAGE ДНК из геля (бромистый этидий окрашивания) из крупномасштабного нуклеосом восстановления с использованием оптимизированной ДНК: октамер молярное соотношение (справа). (Б) 18% SDS-PAGE гель - белок (окрашивание кумасси) водостойких нуклеосом показывает правильную стехиометрии четырех основных гистонов. (С) 1 Н- 15 N SOFAST-HMQC спектр 15 N-меченого H3 копией ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО меченного изотопом нуклеосом (только Н3 хвостовые остатки видны - ядерный белок невидима из - за медленной скорости барабанный). (D) 1 Н- 13 С HSQC - спектр C-меченого H3 копии ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО меченного изотопом нуклеосом 13. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Мониторинг ЯМР в цис и транс Модификация Перекрестные помехи налагаемого асимметричным фосфорилирования H3S10 на H3K14 ацетилирования активности Gcn5 ацетилтрансферазы. (А) Схематическое представление дифференцированно меченого изотопом и асимметрично фосфорилируется по H3S10 нуклеосомы взаимодействию с Gcn5 ацетилтрансферазы и картографирования ацетилирования H3K14, в цис и транс. (В) 1 Н- 15 N SOFAST-HMQC и 1 Н- 13 С HSQC - спектры (выбранных областей) асимметричных нуклеосом до и после реакции с Gcn5. (C) Времяразрешенная мониторинг ЯМР H3K14 ацетилирования по Gcn5 на асимметрично H3S10 фосфорилированных нуклеосом. Средние значения и вариации (столбики ошибок) от двух независимых экспериментов. Воспроизводится с разрешения 16. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версиюэта фигура.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для нуклеосомнои восстановления, текущий протокол использует шаблон ДНК длиной 165 пар оснований, содержащий 601-Видомом последовательность 20 нуклеосома позиционирования, но аналогичные показатели , как ожидается , с использованием различных длин ДНК - матриц. Протокол был разработан и использован с использованием асимметричных типов гистона H3. При том же принципе, способ может быть применен также для других основных гистонов и дополнительно могут быть использованы для восстановления комплексов, несущих два различных стержневых гистонов с различными изотопных меток. Протокол может быть также немного изменен, чтобы сначала восстановить гистонов суб-комплексы, а не непосредственно гистона октамеры. После этой модификации, асимметричные H3-H4 тетрамеры может быть восстановлен путем с использованием той же схемы очистки тандем. Последний смешивают с отдельно реконструированных H2A-H2B димеров и ДНК , чтобы собрать нуклеосом 16. Конечные выходы и общая производительность модифицированного protocола похожи на оригинал.
Протокол сильно зависит от способности двух аффинные колонки, чтобы эффективно связывать соответствующие виды и, таким образом, чтобы получить в конце высокочистые асимметричные комплексы. Это громоздко, чтобы обеспечить прямое и конкретное доказательство того, что конечный очищенный комплекс действительно является и только асимметричным. Тем не менее, ВБ анализ образцов из всех стадий очистки с соответствующими антителами обеспечивает надежные показания для успеха схемы очистки тандем (рисунок 3). Те же самые результаты, и , следовательно , дополнительное подтверждение того , были получены путем анализа тех же образцов на наличие тегов аффинности методами ЯМР 16. Тем не менее, если анализ ВБ указывает на загрязнение асимметричных видов с симметричными из них, небольшое изменение может быть принято на первом этапе очистки (Ni-NTA), которые могут улучшить результаты. В частности, вместо изократным элюированием имидазоловую gradien т элюирование (10-250 мМ) могут быть использованы, а затем, только первые Элюированные фракции, которые сильно обогащены в асимметричных видов, объединяют и пропускали через колонку аффинной. Это может быть оценена с помощью анализа WB из элюированных фракций на наличие стрептококковые аффинной метки.
Выбор изотопной метки по отношению к PTM интереса является достаточно гибкой , так как в большинстве случаев, ЯМР способен отображение той же PTM , используя как 1 Н- 15 N и 1 H- 13 спектров Ccorrelation. Тем не менее, для некоторых аминокислот, как и лизинов, дисперсия химического сдвига для боковой цепи 1 H- 13 С резонансов весьма ограничено. Кроме того, когда целевые участки фермента лизин-модификации неизвестны, сайт-специфический для чтения из лизина PTMs не является простым делом. В этих случаях альтернативные способы используют сайт-селективным 13 С-мечение, в сочетании с полусинтетической производства гистонов"> 21 или использование вновь созданных последовательностей импульсов ЯМР , что позволяет специфическое обнаружение модификации состояний путем селективного возбуждения подпрограммы 22. ЯМР - спектроскопии дает довольно низкую чувствительность. В связи с этим, относительно высокие количества нуклеосом (диапазон мкМ) необходимы для выполнения ферментативные реакции. Это предотвращает развитие метода к установке с высокой пропускной способностью.
Одновременно с этим , новый химический метод был введен для синтеза химически чистых, асимметрично модифицированных нуклеосом, с высокими выходами, выполняя определенные PTMs 23. Этот подход был использован в сочетании с флюорографии, для изучения механизмов перекрестных помех PTM. Из-за низкой разрешающей способности флюорографических методов обнаружения PTMs на выводы были получены косвенным образом путем сравнения общих ферментативные активности на множестве нуклеосом, несущих различные комбинации симметричных и асимметричных PTMs, ачем путем непосредственного наблюдения PTM реакций на соответствующих сайтах каждой сестры гистона. Однако введение меченных изотопами гистонов и использование ЯМР-спектроскопии для PTM считывания может представлять собой указанный выше способ, дополнительный инструмент для анализа ПТМ высокого разрешения несимметрично модифицированных нуклеосом.
В связи с выявлением новых типов асимметрично модифицированных нуклеосом в будущем, в настоящее время метод направлен , чтобы представлять инструмент высокого разрешения для анализа в цис и транс перекрестных помех реакций PTM на нуклеосомных субстратов. В частности, большое значение является расшифровка механизмов перекрестных помех , которые приводят к двухвалентным нуклеосом 24 , которые содержат асимметрично, как транскрипционно активные и репрессивные PTMs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Автор благодарит д-р Филипп Selenko (ФСМ-Берлин) для обеспечения влажной лабораторного пространства и инфраструктуры для проведения экспериментов и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) для финансирования работы через исследовательского гранта (LI 2402 / 2-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
| Tris | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2H2PO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
| Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6 - 8 kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
| 50 kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
| 10 kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30 kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe | ||
| Buffer name | Component | ||
| Unfolding Buffer | 7 M Guanidinium HCl | ||
| 20 mM Tris, pH 7.5 | |||
| 10 mM DTT | |||
| Refolding Buffer | 10 mM Tris, pH 7.5 | ||
| 2 M NaCl | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 2 mM DTT | |||
| Assay Buffer | 25 mM Na2H2PO4, pH 6.8 | ||
| 25 mM NaCl | |||
| 2 mM DTT |
References
- Hansen, J. C. Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R.
- Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications. Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A.
- Liokatis, S., et al. Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).
- Voigt, P., et al. Asymmetrically Modified Nucleosomes. Cell. 151 (1), 181-193 (2012).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications. Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).
- Binolfi, A., et al. Intracellular repair of oxidation-damaged α-synuclein fails to target C-terminal modification sites. Nat. Commun. 7, 10251 (2016).
- Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds. J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).
- Theillet, F. X., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA. Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).
- Artimo, P., et al. ExPASy :SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).
- Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).
- Stützer, A., et al. Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails. Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).
- Zhou, B. R., et al. Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome. J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).
- Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).
- Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).
- Bernstein, B. E., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125 (2), 315-326 (2006).
