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Artigo de método

Guiada por ultra-som intracardíaca injeção de células-tronco mesenquimais humanas para aumentar Homing para o intestino para uso em modelos murino de doenças intestinais inflamatórias Experimental

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DOI:

10.3791/55367

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1 de setembro de 2017

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1Division of Gastroenterology and Liver Disease, University Hospitals, Digestive Health Research Institute, Case Western Reserve University, 2Case Cardiovascular Research Institute, School of Medicine, Case Western Reserve University, 3Department of Medicine, Harrington Discovery Institute, Harrington Heart and Vascular Institute, University Hospitals Case Medical Center, 4Department of Radiology, University Hospitals Case Medical Center, 5Department of Biology - Skeletal Research Center, Case Western Reserve University

Neste artigo

Resumo

Murino estudos em modelos de inflamação do cólon têm demonstrado que uma pequena porcentagem (1-5%) de células-tronco mesenquimais (MSC) injetada por via intravenosa ou intraperitonealmente home ao cólon inflamado1,2. Este estudo mostra que guiada por ultra-som intracardíacos injeções de MSCs resultam em aumentada localização até o intestino.

Resumo

A doença de Crohn (CD) é uma doença inflamatória crônica comum do pequeno e o intestino. Murino e humanas tronco células mesenquimais (MSCs) têm potencial imunossupressor e foram mostradas para suprimir a inflamação em modelos do rato de inflamação intestinal, mesmo que a via de administração pode limitar sua homing e eficácia 1 , 3 , 4 , 5. aplicação local de MSCs para modelos de lesão do cólon tem demonstrado maior eficácia em atenuar a inflamação no cólon. No entanto, há escassez de dados sobre técnicas para melhorar a localização do MSCs de derivados da medula óssea humanas (hMSCs) para o intestino delgado, o local da inflamação no modelo da doença de Crohn experimental SAMP-1/YitFc (SAMP). Este trabalho descreve uma técnica nova para a injeção intracardíaca guiada por ultra-som de hMSCs em camundongos SAMP, um modelo bem caracterizado espontâneo de inflamação intestinal crônica. Sexo e idade-correspondência, livre de inflamação AKR/J (AKR) os ratos foram usados como controles. Para analisar a biodistribuição e a localização, hMSCs foram transfectadas com um lentivirus contendo um repórter triplo. O repórter triplo consistia de luciferase de vaga-lume (fl), para a imagem latente bioluminescente; proteína monomérica vermelha fluorescente (mrfp), para a classificação de célula; e truncado herpes simplex vírus timidina quinase (ttk), para tratamento de imagens de tomografia por emissão de pósitrons (PET). Os resultados deste estudo mostram que 24 h após a administração intracardíaca, hMSCs localizar-se no intestino delgado de ratos SAMP ao invés de ratos AKR livre de inflamação. Neste romance, guiada por ultra-som de injeção de hMSCs no ventrículo esquerdo de ratos SAMP garante uma elevada taxa de sucesso de entrega de celular, permitindo a recuperação rápida de ratos com mínima morbidade e mortalidade. Esta técnica pode ser um método útil para a localização avançada do MSCs em outros modelos de inflamação intestinal-pequeno, como TNFΔRE6. Estudos futuros determinará se a localização de aumentada do hMSCs pela entrega intra-arterial pode levar à maior eficácia terapêutica.

Introdução

A doença de Crohn (CD) é uma doença inflamatória crônica comum do pequeno e intestino e é pensada para resultar de uma resposta inadequada do sistema imunológico do host para micróbios intestinais7,8. Estudos recentes têm mostrado que murino e humanas tronco células mesenquimais (MSCs) podem suprimir a inflamação em modelos do rato de inflamação intestinal1,3,4,5. Existem vários ensaios clínicos em curso que usam MSCs humanas derivadas da medula óssea ou tecido adiposo para tratar pacientes com doença inflamatória intestinal (IBD), que inclui CD9. Duas rotas para a terapia MSC têm sido utilizadas nestes ensaios clínicos: uma envolve a infusão sistêmica (ou seja, por via intravenosa) de MSCs para IBD luminal (incluindo CD) e o outro envolve a aplicação/injeção localizada de células-tronco na fístula trato de pacientes com CD perianal. Em uma recente meta-análise da terapia MSC para IBD, sistêmica (ou seja, por via venosa) terapia MSC para IBD luminal (incluindo CD) foi eficaz em até 40% (95% CI: 7-79%) dos pacientes, Considerando que a eficácia era muito maior, em 61% (95% CI: 36-85%), quando os MSCs foram injetados localmente os doentes de fístula CD9. Um multicêntrico III fase recente randomizado placebo controlado de células-tronco adiposas alogênico injetado diretamente a fístula perianal de CD pacientes mostrou estatisticamente significativa evidência clínica e radiológica de fístula perianal, cura, corroborando os achados da meta-análise10. As razões para a baixa eficácia da terapia MSC administrada por via intravenosa para CD luminal foi investigado inadequadamente, mas uma razão pode ser a orientação inadequada do MSCs para o local da inflamação. Murino estudos em modelos de inflamação do cólon têm demonstrado que apenas uma pequena percentagem de MSCs (1-5%) injetada por via intravenosa alcançar o cólon inflamado; os MSCs restantes são filtrados pelos pulmões (efeito de primeira passagem)1,2 ,5,11,12. Vários estudos murino, portanto, tem usado a via intraperitoneal (i.p.) para administração de MSC em modelos animais de colite4. No entanto, eles também têm demonstrado que somente uma pequena fração das células alcançar e engraft do cólon e que a eficácia é relacionado com a secreção de fatores solúveis parácrina, como a proteína do gene fator de necrose tumoral-inducible 6 (TSG-6)2. O mecanismo MSC de imunossupressão e cura envolve uma abordagem de várias frentes que envolve parácrina; fatores de proximidade-independente de célula, como TSG-6; e celular fatores dependentes de proximidade, como programado morte-ligante 1 (PD-L1); ou 1 irregulares. Portanto, localização de MSC para o site da inflamação pode resultar em maior eficácia9,13. De fato, um estudo recente mostrou que MSCs implantados diretamente no local da lesão do cólon resultaram na cura através da secreção de promover a angiogênese vascular fator de crescimento endotelial (VEGF). Por outro lado, observou-se um efeito de cura mínimo após injeção intravenosa5. Para aumentar a sua localização para o site da inflamação (ou seja, o intestino delgado em ratos SAMP), foi desenvolvida esta técnica de Injeção intracardíaca guiada por ultra-som para administração de MSC no ventrículo esquerdo. Guiada por imagem injeção garante uma injeção exata, o que leva a uma maior taxa de sucesso e a diminuição da morbidade e mortalidade. Além disso, a injeção de MSCs no ventrículo esquerdo distribui-las para circulação arterial, onde eles podem alcançar o intestino inflamado antes de tornar-se preso nos pulmões.

Neste estudo, MSCs derivadas da medula óssea humanas (hMSCs) foram usados para injeção no modelo murino de CD14SAMP-1/YitFc (SAMP). Totem é um modelo murino espontâneo bem caracterizado de inflamação crônica que se desenvolve a inflamação intestinal-pequeno com cerca de 100% de penetrância14. A inflamação se desenvolve em resposta a microflora na ausência de qualquer manipulação genética, química ou imunológica e muito semelhante à humana CD11. Sexo e idade-correspondente livre de inflamação AKR/J (AKR) ratos, os ratos de controlo parental da SAMP, foram utilizados neste estudo.

Os hMSCs foram isoladas e expandidas em laboratório de amostras de medula óssea (BM) obtidos de doadores normais, não identificados, após consentimento informado usando validado e publicado anteriormente protocolos15,16. Após isolamento e expansão, a capacidade MSC em osteogênica, adipogenic, e chondrogenic diferenciação foi avaliada em laboratório por vários ensaios15. Realizou-se o ensaio funcional osteogênico implantando cubos de cerâmicos da matriz de fosfato tricálcico/hidroxiapatita contendo hMSCs por via subcutânea em imunocomprometidos de ratos SCID CB17-Prkdc17. O ensaio de cubo demonstra a osteogênese e condrogênese potencial e é considerado o último teste de avaliação individual de preparações de MSC17. Para visualizar hMSCs na vivo após a injeção, lentivirus foi usado para transduce hMSCs com construção de gene repórter triplo que consiste de luciferase de vaga-lume (fl), proteína monomérica fluorescente vermelha (mRFP) e herpes simplex vírus timidina quinase (ttk ), impulsionado por um vírus (mnd) de sarcoma mieloproliferativa modificados promotor18. A luciferase de vaga-lume no repórter triplo é uma enzima que luciferina injetado coverts para oxyluciferin em hMSCs e produz fótons/luz branca. Isso é detectado pela câmera sensível dispositivo de carga acoplada (CCD) (bioluminescência) em um na vivo óptico de imagem de sistema, que permite a visualização de hMSCs ao vivo em ratos. Bioluminescência imaging (BLI) é uma técnica sensível que pode ser usada em série para controlar as células e para análise ex vivo . O uso de um promotor forte mnd conduz a expressão contínua da construção de gene de fusão tripla repórter e permite a imagem latente de hMSCs injetado por mais de 16 semanas19. Os hMSCs são difíceis de transduce e ter um rendimento baixo transdução. Usando um protocolo otimizado, a eficiência de transdução de hMSCs foi melhorada e a expressão do transgene foi reforçada18. Usando a expressão de mRFP (um dos genes repórter triplo) na citometria de fluxo, demonstrou-se a capacidade de transduce hMSCs com uma alta eficiência de até 83%. Ensaios de diferenciação e na vivo o cubo ensaios demonstraram a capacidade do transduzidas hMSCs de se diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos17.

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Protocolo

todos os procedimentos no estudo e experimentos de ratos foram aprovados pela Case Western Reserve University ' s institucionais Cuidado Animal e Comissão de utilização. Os procedimentos foram realizados em associação para avaliação e acreditação dos cuidados com animais de laboratório (AAALAC) credenciado facilidade. O BM foi aspirado sob um protocolo aprovado Conselho de revisão institucional hospitais Universidade na instalação de núcleo de células-tronco na Case Western Reserve University, após consentimento informado.

1. cultura e derivado de transdução da medula óssea humana células-tronco mesenquimais (hMSCs)

Nota: O isolamento de hMSCs é descrito detalhadamente em anteriores Publicações 15 , 20.

  1. Cultura isolada hMSCs em Dulbecco ' suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) glicose (DMEM-LG) s Eagle modificado médio-baixo. Cultura de células em 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO 2 em T175 frascos com 25 mL de meio de crescimento. Substitua o médio a cada 3-4 dias. No dia 14, execute a passagem principal do hMSCs.
    1. Quando as células alcançar 80% de confluência, remover completamente o meio velho e lave delicadamente as células com 5 mL de tampão fosfato salina (PBS; para frascos de cultura de tecidos de 75 cm).
    2. Remover a PBS do recipiente e adicionar 4 mL de ácido de 0,25% do trypsin-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Lugar o frasco de volta na incubadora a 37 ° C durante 5-10 min. manter o tempo de exposição mais breve possível.
    3. Quando a maioria das células se tornaram bem-arredondado ou ter retirado o prato de cultura, pare a reação adicionando um volume de soro bovino bezerro igual a metade do volume de tripsina.
    4. Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de tamanho adequado. Centrifugar as células a 400 x g por 5 min e em seguida, Retire cuidadosamente o sobrenadante.
    5. Ressuspender as células em 5 mL de meio (DMEM-LG + 10% FBS) e contar as células com um hemocytometer.
      Nota: Neste momento, as células podem ser repicagem ou transfectadas com triplo repórter.
  2. Executar a transdução de hMSCs com repórter triplo.
    1. Células semente 1.5 x 10 6 um T175 balão. Cultura de células em 25 mL de meio de crescimento em 37 ° C, 95%, umidade e 5% de CO 2. Esperar 24 h para as células anexar.
    2. Fazer um vírus cocktail em tubos de 15 mL, conforme descrito na referência 18.
      1. Lentivirus de degelo a 37 ° C em uma água de banho. Adicione 160 µ l de uma solução de sulfato de proteamine 5 mg/mL em Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) a 8 mL de meio de cultura (DMEM-LG + 10% FBS) para uma concentração final de 100 µ g/mL. Vórtice de 3 s. Adicione uma multiplicidade de vírus de infecção (MOI) de 5 (1º vez descongelado) .
    3. Remover o meio do frasco de cultura celular (passo 1.2.1) e adicionar o coquetel de vírus para as células. Incubar durante 10 h a 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO 2.
  3. Adicionar 4 mL de sulfato de proteamine 100 µ g/mL em 4 mL de DMEM-LG + 10% FBS e incube por um adicional h. 14
  4. Parar a transdução após 24 h, substituindo com 25 mL de meio (DMEM-LG + 10% FBS).
  5. Eficiência de transdução confirmar através da avaliação da expressão de mRFP por citometria de fluxo 18.
    Nota: Aqui, hMSCs que foram transfectadas com mais de 65%, utilizaram-se eficiência.
  6. Expandir as células, substituindo com 25 mL de meio fresco (DMEM-LG + 10% FBS) duas vezes por semana. Cultura de células em 37 ° C, 95%, umidade e 5% de CO 2. Passagem de células após atingirem 80% confluência.
  7. Uma vez que o número de células desejado for atingido, executar tripsinização por etapas 1.1.2 - 1.1.4.
  8. Contar as células e suspendê-las em PBS estéril (1x) na concentração final de 1 x 10 6 células/75 µ l. manter as células no gelo para o transporte para a máquina de ultra-som. Para experiências, usar hMSCs de passagem os números 2-5.

2. Guiada por ultra-som intracardíaco injeção de hMSCs para o ventrículo esquerdo

Nota: uso SAMP1/YitFc com estabelecido pequeno-intestinal inflamação e idade e gênero-correspondência AKR/J ratos para as experiências. Manter os ratos SAMP e AKR condições específicas isentos de organismos patogénicos, alimentá-los chow padrão de laboratório e mantê-los em ciclos de 12 h claro/escuro. Aqui, as injeções cardíacas guiada por ultra-som foram realizadas em uma sala de ultrassom isentos de organismos patogénicos cardíaco dedicado localizada na unidade de pesquisa animal da CWRU que foi desinfectada com um desinfectante e lavada com álcool a 70%. Laboratório pesquisa pessoal deve usar equipamento de protecção pessoal, incluindo vestidos, máscaras com escudos de olho e luvas estéreis durante as injeções intracardíacos. O calor do corpo do mouse deve ser mantido para a duração do processo.

  1. Configurar o ultra-som sistema de imagem antes de anestesiar o mouse. Para este protocolo, use a máquina de ultra-som projetada para ecocardiograma de rato.
    1. Girar sobre o poder e inicializar o transdutor (30 MHz) para configurar o novo estudo.
  2. Anestesiar o mouse em uma câmara de indução usando 3-4% de isoflurano em oxigênio a 100% a uma taxa de 0,2 - 0,5 L/min manter o animal para todo o processo com 2% de isoflurano em 100% de oxigênio através de um cone de nariz. Confirmar anesthetization apropriado antes de executar a imagem latente por beliscar o dedo do pé, rolando o mouse e observar a ausência de movimento.
    Nota: Pomada oftálmica deve ser aplicada aos olhos após a indução da anestesia para evitar a secura da córnea. Transferi os ratos anestesiados para as máquinas de imagem (ou seja, o sistema de imageamento bioluminescência e ultra-som), onde receberão uma dose de manutenção de isoflurano anestésico. Determinar a anestesia começar a altura e a profundidade da anestesia, observando a falta de reação à pitadas na cauda e pé almofada a cada 10 min para toda a duração da anestesia.
  3. Definir a temperatura do gel tabela e ultra-som de imagem a 37 ° C.
  4. Remover completamente a pele sobre a área do tórax do mouse anestesiado usando o creme depilatório.
  5. Coloque o mouse em cima da mesa da imagem latente em posição supina e fixar ambos os membros superiores e inferiores com fita adesiva para evitar o movimento do corpo durante o procedimento. Usar um monitor de eletrocardiograma durante o procedimento para todos os mouses.
  6. Limpar a pele da área do tórax, usando um cotonete de iodopovidona/10% seguido de um cotonete de etanol 70%. Aplicar uma camada espessa de gel para a área do tórax do mouse.
  7. Montar o transdutor no suporte e ajustar sua posição até o ventrículo esquerdo é claramente visível no campo de visão.
  8. Carga 150 µ l de suspensão de células hMSC transduzidas (2 x 10 6 hMSCs em 150 µ l de PBS estéril) em uma seringa de 1 mL com uma 28-G agulha e fixar a seringa no suporte apropriado. Para visualizar o sangue pulsante, manter uma coluna de ar pequena na seringa. Para evitar a aglutinação, suspender as células antes da injeção.
  9. Avançar a seringa no sentido do tórax do mouse, ajustar a trajetória da agulha usando a orientação de ultra-som e introduza o ventrículo esquerdo.
  10. Seguindo a orientação da imagem do ultra-som, penetrar a agulha da seringa através do espaço intercostal e no ventrículo esquerdo do mouse.
    Nota: Ponta de agulha da seringa deve ser claramente visível no ventrículo esquerdo na imagem ultra-sonográficos. O posicionamento adequado deve ser confirmado ainda mais pela saída de sangue arterial fresco para a seringa. Estes são sinais de uma bem sucedida inserção.
  11. Injetar a suspensão de células de hMSC muito lentamente mais de 2 min, aplicando suave pressure.
  12. Após a injeção de células suspensas, delicadamente, retirar a agulha, limpe o gel de ultra-som e solte o mouse das restrições fita.
  13. Colocar o animal em uma gaiola nova e limpa com uma almofada pré-aquecido.
    Nota: Após a conclusão do procedimento, um ambiente quente deve ser fornecido aos ratos até se recuperar. Aquecimento excessivo deve ser evitado, desde que a vasodilatação periférica compromete a recuperação. Os ratos devem ser acompanhados de perto e isolados de outros ratos até sua recuperação total, indicada pela sua capacidade de manter a prostração esternal.
  14. Monitorar o animal até que eles alcancem a completa recuperação da anestesia e diariamente até o final do experimento.

3. Imagens de bioluminescência (BLI) de hMSCs

  1. imagem os ratos 24 h após a injeção intracardíaca no sistema de imagem a bioluminescência. Inicie o na vivo software de imagem. Inicializar o sistema de imagem e abrir um novo estudo.
    1. No painel de controle, defina os parâmetros de imagem clicando " sequência instalação. " no modo de imagem, selecione " luminescência " e " fotografia. " definir os tempos de exposição de 0,5 s a 10 min. definir o binning para " médio " e a F / Para de " 1. " definir o filtro de excitação " bloco " e o filtro de emissão para " aberto. " definir o campo de visão " C " para dois ratos. Adicionar a configuração de sequência para o assistente de imagem clicando no painel de controle de aquisição.
  2. Ligue a bomba de oxigênio e o conjunto do isoflurano para 2,5% em câmara de indução e o cone de nariz dentro da máquina.
  3. Injetar o i.p. de rato com 300 µ l de D-luciferina (12,5 mg/mL).
  4. Colocar o mouse na câmara de indução de anestesia.
    1. Após 2-3 min, transferir o mouse para o na vivo de imagens de câmara, com a cabeça do cone de nariz no colector de anestesia. Aplica a pomada óptica para proteger os olhos durante a imagem latente. Para vários mouses de imagem, use o defletor de luz negra para evitar a reflexão da luz em ratos adjacentes.
  5. Clique o " adquirir " o botão para iniciar a aquisição de imagem 10 min após a injeção de luciferina-D.
  6. Repita os passos 3.3-3.5 para imagem mais ratos.
  7. Após a aquisição imagem na vivo, eutanásia os ratos por inalação de CO 2 seguida por deslocamento cervical, para confirmar a morte. Efectuar a análise ex vivo.
    1. Se a análise ex vivo é executada Depois de 20 min, repetir a injeção de luciferina (passo 3.3) antes de sacrificar os ratos; o sinal BLI pode diminuir 20 min após a injeção de luciferina.
  8. Dissecar os ratos para remover o aparelho todo gastrointestinal (i.e., do estômago para o reto), linfonodos mesentéricos (MLN), pulmões, baço e fígado. Colocá-los em placas de Petri usando pinças e tesouras de 2 , 4.
  9. Coloque a placa de Petri contendo os órgãos explantados na câmara de imagens e adquirir imagens BLI por etapas 3.1-3.6.
  10. Após a aquisição da imagem, transferir os órgãos explantados para moldes de amostra contendo ideal da temperatura de corte (OCT) composto. Cryofreeze os moldes a-80 ° C, usando gelo seco. Executar a imuno-histoquímica utilizando anticorpo anti-luciferase seções congeladas para confirmar a presença de hMSCs 16.
  11. Para a quantificação da intensidade de luz, use a região da ferramenta de interesse (ROI) na ferramenta paleta 16 , 19. Selecione o quadro ROI e movê-lo para a região de interesse na imagem. Clique " medição de ROI " e salvar os dados no formato de arquivo SEQ. Exportar os dados como um arquivo. txt e usar software estatístico para realizar testes estatísticos básicos para quantificação 16.

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Resultados

A Figura 1 mostra que a hMSCs pode ser transfectadas com o repórter triplo com uma alta eficiência, preservando suas propriedades de célula-tronco. Transduzidas hMSCs podem ser visualizadas em tempo real por BLI (Figura 1, Figura 3). Neste romance, guiada por ultra-som injeção de hMSCs para o ventrículo esquerdo de ratos SAMP garante uma taxa de sucesso muito alta de injeção, permitindo a recuperação...

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Discussão

Este estudo descreve uma técnica nova para a injeção intracardíaca guiada por ultra-som de hMSCs em um modelo do CD experimental rato pequeno-intestinal. Esta técnica tem muito alta taxa de sobrevivência e de sucesso, como a trajetória da agulha pode ser ajustada com base em imagens de alta resolução, em tempo real do ventrículo esquerdo do mouse, fornecida pelo ultra-som. A vantagem da entrega para o ventrículo esquerdo é que hMSCs são então distribuídos intra arterially e ignorar a circulação venosa, evitando assim a a...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Maneesh Dave é suportado pelo departamento de defesa grant PR141774 e o Crohn e a colite Foundation of America carreira desenvolvimento Award. O laboratório de Fabio Cominelli é suportado pelo NIH concede DK042191 (FC), DK055812 (FC), DK091222 (F.C.) e DK07948 (FC). O laboratório de Arnold Caplan é suportado em parte pela David L. e E. Virginia Baldwin Foundation. Agências de fomento não tinham qualquer papel no estudo de análise ou escrita do manuscrito. Seu conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEM-LG   Gibco31600-091
0,25% tripsina-EDTAGibco25-200-072
Sulfato de ProteamineSigmaAldrich P4020-1G
D-LuciferinaGoldbioluck-500
Soro Fetal BobineGibco26140-079
Antibiótico-AntimicóticoGibco15240-062
PBSHyCloneSH30256.01
Frascos de cutlure de tecido de 175 cmCorning431080
Frascos de cutlure de tecido de 75 cmCorning430720
Tubos de centrífugaCrysalgen23-2265
Composto Tissue-Plus O.C.T. FisherHealthCare4585
Cryomold StandardTissue-Tek Lenti-Pac 4557
GeneCopoeiaHPK-LvTR-20 
Povidona Ionidine swabsMedlineMDS093901
Creme de depilaçãoNairN/A
Isoflurano Piramal Helathcare NDC 66794 013 25
Fórceps Fine Science Tools11200-33
Tesoura de dissecação (Wagner)Fine Science ToolsWagner 14068-12
Pomada veterináriaPuralube NDC17033-211-38
Aquasonic 100 gel de transmissão de ultrassomParker laboratories01 08
Placa de PetriFisher ScientificFB0875711A
camundongosSAMPCentro de Pesquisa de Doenças Digestivas de Cleveland
Visual Sonics, Toronto, Canadá
  Sistema da série de espectro IVIS PerkinElmer, Waltham, MA
Software de imagem vivo CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA
Repórter triploGentilmente cedido pelo Dr. Zheng-Hong Lee, CWRU, (citação 19)
Sistema de Embalagem de Expressão de HIV Camundongos AKR Centro de Pesquisa de Doenças Digestivas de Cleveland Sistema de imagem Vevo 770

Referências

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